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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die viral vermittelte ektopische Expression von Neurod1 nach einem kortikalen ischämischen Schlaganfall. Neurod1 wird (1) mit dem Cre-Flex AAV-System in Wildtyp-Mäusen während der subakuten Phase nach dem Schlaganfall (7 Tage) und (2) unter Verwendung eines einzelnen AAV-Vektors in bedingten Reportermäusen während der chronischen Phase nach dem Schlaganfall (21 Tage) verabreicht.

Zusammenfassung

Die ektopische Expression neurogener Faktoren in vivo hat sich als vielversprechender Ansatz für den Ersatz verlorener Neuronen in Krankheitsmodellen erwiesen. Über die Verwendung von neuronalen basischen Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktoren über nicht vermehrende virusähnliche Partikelsysteme, einschließlich Retroviren, Lentiviren und Adeno-assoziierten Viren (AAV), wurde ausführlich berichtet. Für in vivo Experimente werden AAVs aufgrund ihrer geringen Pathogenität und ihres Potenzials zur Übertragbarkeit zunehmend eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt zwei AAV-Systeme zur Untersuchung der ektopischen Expression von Transkriptionsfaktoren in transduzierten Zellen nach einem ischämischen Schlaganfall. In beiden Systemen wird die Neurod1-Expression durch den kurzen GFAP (gfaABC(1)D)-Promotor gesteuert, der sowohl in reaktiven Astrozyten nach einem Schlaganfall als auch in endogenen Neuronen in Kombination mit der Expression neurogener Faktoren hochreguliert ist. Im beschriebenen ischämischen Schlaganfallmodell wird die fokale Ischämie durch Injektion von Endothelin-1 (ET-1) in den motorischen Kortex von Mäusen induziert, wodurch eine Läsion entsteht, die von reaktiven GFAP-exprimierenden Astrozyten und überlebenden Neuronen umgeben ist. Intrazerebrale Injektionen von AAV werden durchgeführt, um die Expression von Neurod1 in der subakuten (7 Tage) und chronischen (21 Tage) Phase nach dem Schlaganfall ektopisch zu induzieren. Innerhalb weniger Wochen nach der AAV-Injektion wird bei Mäusen, die Neurod1 ektopisch exprimieren, eine signifikant höhere Anzahl von Neuronen unter den transduzierten Zellen identifiziert als bei Mäusen, die AAV-Kontrollviren erhielten. Die AAV-basierten Strategien replizierten die beobachteten Ergebnisse einer erhöhten Anzahl von Neuronen, die das Reportergen exprimieren, in einem Modell für einen leichten bis mittelschweren kortikalen Schlaganfall. Dieses Protokoll etabliert eine Standardplattform für die Erforschung der Auswirkungen der ektopischen Expression von Transkriptionsfaktoren, die mit AAV-basierten Systemen verabreicht werden, und trägt zum Verständnis der Expression neurogener Faktoren im Kontext eines Schlaganfalls bei.

Einleitung

Schlaganfall ist weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungen1. Ein Schlaganfall tritt auf, wenn der Blutfluss zum Gehirn gestört ist. Dies kann entweder durch einen hämorrhagischen Schlaganfall (~15% der Fälle) geschehen, bei dem ein Blutgefäß im Gehirn platzt, oder durch einen ischämischen Schlaganfall, bei dem der Blutfluss zum Gehirn blockiert wird1. Ischämische Schlaganfälle sind am häufigsten und machen ~85% der Schlaganfallfälle aus1. Ein Schlaganfall reduziert die Abgabe von Glukose und Sauerstoff an das Gehirn, was zu einem schnellen neuronalen Zelltod und einer Beeinträchtigung der neuronalen Funktion führt.

Ein ischämischer Schlaganfall führt innerhalb von Minuten zum Verlust von Zellen im Kern der Läsion durch Mechanismen der Exzitotoxizität, des oxidativen und nitrosativen Stresses, der Kalziumdysregulation, der kortikalen Spreizungsdepolarisation, des Ödems, der Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und der Entzündung 2,3. Zellen in den Periinfarktregionen erleiden innerhalb von Stunden und tagelang nach einem Schlaganfall einen apoptotischen Zelltod4. Das Periinfarktmilieu ist pro- und antiinflammatorischen Signalen ausgesetzt, die zur Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten ("reaktive" Astrozyten) führen, die nach einer Verletzung eine vielfältige Rolle spielen 5,6,7,8. Reaktive Astrozyten durchlaufen eine Reihe von phänotypischen Veränderungen, darunter die Hochregulierung des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) und die Bildung einer Grenze um die Läsion innerhalb von Tagen nach dem Schlaganfall, die dazu beiträgt, das Ausmaß der Läsion zu begrenzen und die Neuroplastizität im verletzten Gewebe zu beeinflussen 8,9,10.

Die direkte zelluläre Reprogrammierung ermöglicht die Umwandlung eines reifen Zelltyps in einen anderen reifen Zelltyp, ohne einen pluripotenten Zustand zu durchlaufen11. Die Umwandlung von residenten Gehirnzellen in neue Neuronen, um die durch Verletzungen verlorenen Neuronen zu ersetzen, stellt einen attraktiven Weg für die Wiederherstellung des Gehirns dar. Der Schlaganfall ist ein ideales Ziel für zellbasierte Behandlungen, da therapeutische Methoden erforderlich sind, um verlorene Neuronen zu ersetzen, den therapeutischen Zeitrahmen zu verlängern und letztendlich die funktionelle Wiederherstellung zu erleichtern. Zu diesem Zweck gibt es viele Arbeiten, die die Reprogrammierung von Astrazyten zu Neuronen (AtN) in vitro und in vivo unter Verwendung einer Vielzahl von basischen neurogenen Transkriptionsfaktoren zeigen, darunter Ascl1, Neurog2, Neurod1 und in jüngerer Zeit mutierte Versionen von Ascl1 (Ascl1-SA6), die eine verbesserte Reprogrammierungseffizienz zeigten 11,12,13,14. Wichtig zu berücksichtigen sind die vielen Faktoren des experimentellen Designs, die sich auf die Ergebnisse, die Interpretation und den Vergleich zwischen Studien auswirken können. Ghazale et al. zeigten, dass die Effizienz der AtN-Reprogrammierung zwischen verschiedenen Mausstämmen, AAV-Serotypen und Promotoren variierte, wenn derselbe bHLH-Transkriptionsfaktorverwendet wurde 14. Andere Überlegungen, wie z. B. das Verletzungsmodell, die Gehirnregion, die Virusdosierung, der Zeitpunkt der Genabgabe, der Reprogrammierungsfaktor und die Art der Verabreichung, werden sich auf die Ergebnisse auswirken. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass bereits existierende transduzierte Neuronen als reprogrammierte Neuronen fehlinterpretiert wurden15,16. Obwohl die Berichte nicht unbedingt leugnen, dass eine AtN-Umwandlung stattfindet, haben diese Studien die Bedeutung gut kontrollierter Experimente hervorgehoben, und mehrere Arbeiten haben Empfehlungen für die nächsten Schritte in diesem Bereich vorgelegt 15,17,18,19. Aus der Literatur geht hervor, dass die ektopische Expression von bHLH-Transkriptionsfaktoren die funktionellen Ergebnisse in einer Vielzahl von Tiermodellen für neurodegenerative Erkrankungen/Verletzungen verbessern kann 13,20,21,22,23,24.

Hierin wird dieses Protokoll Neurod1, ein Transkriptionsfaktor von Interesse, ektopisch in transduzierten Zellenexprimiert 13,22. Es wird das etablierte Endothelin-1 (ET-1)-Modell des ischämischen Schlaganfalls auf den sensomotorischen Kortex bei erwachsenen Mäusen verwendet. Die Injektion von ET-1 führt zu einer lokalen Vasokonstriktion, die die Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls nachahmt, einschließlich funktioneller Beeinträchtigung 22,23,25. Der häufig verwendete kurze GFAP-Promotor (gfaABC(1)D) wird verwendet, um die ektopische Expression von Neurod1 an der Verletzungsstelle und in der periläsionalen Region mit zwei viralen Strategien zu steuern: (1) AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in Wildtyp-Mäusen und (2) AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in tdTom-Cre Reportermäusen. Um das Potenzial für die ektopische Expression von Neurod1 im Schlaganfall-verletzten Gehirn besser zu verstehen, wurden AAVs in der subakuten Phase (7 Tage) oder in der chronischen Phase (21 Tage) nach einem Schlaganfall verabreicht. In beiden Paradigmen wurden innerhalb von Wochen nach der ektopischen Neurod1-Expression signifikant mehr markierte Neuronen gefunden.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee der University of Toronto genehmigt und entspricht dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (2. Auflage, Canadian Council on Animal Care, 2017). Für diese Studie wurden Wildtyp- (C57BL/6J) und transgene tdTom-Cre-Reporter (B6. Es wurden Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 Mausstämme verwendet. Die Mäuse waren 7-9 Wochen alt und umfassten sowohl Männchen als auch Weibchen. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Endothelin-1-Schlaganfall-Chirurgie

HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente und Materialien werden vor der Operation im Autoklaven sterilisiert. Der stereotaktische Rahmen wird mit PREempt sterilisiert. Die Spritzen werden vor der Operation mit PREempt, 70% Alkohol, sterilisiert und mit sterilem PBS grundiert. Endothelin-1 (ET-1) wird während der gesamten Operation auf Eis gelagert.

  1. Richten Sie vor Beginn der Operation den Erholungsbereich ein, indem Sie einen sauberen Käfig auf ein Heizkissen stellen, das auf 37 °C eingestellt ist. Wenn eine Heizlampe verwendet wird, stellen Sie alternativ nur die Hälfte des Käfigs unter die Hitze.
    1. Um Mäuse mit Isofluran zu betäuben, befolgen Sie das vom Animal Care Committee genehmigte Protokoll. Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie-Induktionskammer und schalten Sie den Sauerstoff auf 1-1,5 l/min ein, dann stellen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 3%-5% ein, um die Anästhesie einzuleiten.
  2. Nehmen Sie das Tier aus der Kammer, sobald es auf der Seite liegt und nicht mehr stehen kann, und legen Sie es auf eine saubere Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie vor und während der Operation bestätigen, dass kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
    1. Befestigen Sie den vom Anästhesiegerät verlängerten Nasenkonus am Tier und stellen Sie den Isofluran für die Wartung auf 1 % bis 2 % ein. Minimieren Sie die Exposition gegenüber Isofluran (5 Minuten bei 3 % bis 5 % für die Einleitung und die verbleibende Zeit bei 1 % bis 2 %), da der Eingriff bis zu 40 Minuten dauern kann.
  3. Verwenden Sie Tierhaarschneider, um das Fell vom Hals/hinter den Ohren bis zur Nase des Tieres zu entfernen, um die Haut am Schädel für die Operation freizulegen.
  4. Wiegen Sie das Tier und verabreichen Sie die geeignete Dosis eines präoperativen Analgetikums subkutan (Meloxicam (2,0 mg/kg)) basierend auf dem Gewicht.
  5. Tragen Sie Augenschmiersalbe auf jedes Auge der Maus auf, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern.
  6. Sterilisieren Sie die vom Fell abgeschnittene Hautpartie (Schritt 1.3) mit 70%igem Ethanol, gefolgt von Chlorhexidinalkohol zweimal, um ein Operationsfeld zu bilden.
  7. Übertragen Sie die Maus auf einen stereotaktischen Mausrahmen, indem Sie zuerst ihre Nase in den stereotaktischen Nasenkegel stecken und dann den Schädel mit Ohrstangen stabilisieren. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen, das auf 37 °C eingestellt ist, um die thermische Unterstützung während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten. Halten Sie den Isofluran bei 1%-2%, so dass die Maus eine Atemfrequenz von 1 Atemzug/s anzeigt.
  8. Wiederholen Sie die Anwendung von Augenschmierung, um bei Bedarf eine Austrocknung der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern. Tragen Sie ein steriles OP-Tuch auf den Körper der Maus unterhalb der Ohren auf, um das sterile Feld zu vergrößern.
  9. Machen Sie mit einer Skalpellklinge #10 einen vertikalen Schnitt parallel zur Sagittalebene des Tieres von hinter dem Mittelpunkt der Augen bis zum Hinterkopf (Scheitelknochen). Legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Haut sanft zu den Seiten zurückziehen.
  10. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Faszie am Schädel zu stören, und lassen Sie den Schädel trocknen, um das Bregma freizulegen.
  11. Richten Sie Manipulatorarme mit Bohrerhalter ein, der einen stereotaktischen Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem .018"-Bohrer trägt.
  12. Bohren Sie 3 Fräslöcher (0,018" Durchmesser) mit einem stereotaktischen Hochgeschwindigkeitsbohrer an den Koordinaten im rechten sensomotorischen Kortex bei 2,25 mm lateral zum Bregma und +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral und -1,0 mm kaudal zum Bregma.
  13. Ersetzen Sie den Bohrer durch eine 26-G-Spritze mit einer 0,375" langen Nadel.
  14. Laden Sie 1,5 μl 400 μM ET-1, gelöst in sterilem PBS, in die Spritze. Um einen guten Fluss zu gewährleisten, geben Sie ein kleines Volumen ET-1 ab, bis ein Tropfen an der Nadelspitze zu beobachten ist. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um den Überschuss abzuwischen, bevor Sie eine Injektion durchführen.
  15. Senken Sie die Nadelspitze über den Schädel hinaus in das mittlere Bohrloch (im rechten sensomotorischen Kortex bei + 0,0 anterior und 2,25 mm lateral zum Bregma), ohne die Dura mater zu punktieren. Sobald Sie ausgerichtet sind, senken Sie die Nadel 1 mm in das Gehirn ab.
  16. Injizieren Sie 1 μl ET-1, indem Sie jeweils 0,1 μl abgeben. Schieben Sie den Kolben der Hamilton-Spritze nach vorne, um 0,1 μl abzugeben, und warten Sie eine Minute, bevor Sie die nächsten 0,1 μl injizieren, und injizieren Sie, bis 1 μl abgegeben wurde.
    1. Nachdem die letzten 0,1 μl abgegeben wurden (0,1 μl x 10 Injektionen = 1 μl insgesamt), halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern, und ziehen Sie sie dann langsam nach oben zurück, um die Spritze zu entfernen.
  17. Um sicherzustellen, dass die Nadel während der Injektion nicht verstopft, geben Sie ein kleines Volumen des ET-1 ab, bis ein Tropfen an der Nadelspitze zu beobachten ist. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um den Überschuss abzuwischen, bevor Sie eine Injektion durchführen. Sterilisieren Sie die Spritzen, bevor Sie dem nächsten Tier PREempt injizieren, gefolgt von 70 % Alkohol und dann sterilem PBS.
  18. Um die Wunde zu schließen, nähen Sie die darüber liegende Haut am Schädel mit einer sterilen Naht aus 4-0-Polysorb-Polyester zusammen.
  19. Verabreichen Sie eine antibiotische Salbe mit einem Wattestäbchen auf die vernähte Stelle, um eine postoperative Infektion zu verhindern.
  20. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie sie in einen sauberen, vorgeheizten Stallkäfig im Auffangbereich um. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer und den Sauerstoff aus.
  21. Bewahren Sie den Käfig für die Dauer der Genesung von der Narkose auf einem Heizkissen auf. Wenn Sie eine Heizlampe verwenden, platzieren Sie die Maus alternativ an der Seite des Käfigs unter der Lampe, damit die Maus nach dem Aufwachen aus der Narkose auf die kühle Seite des Käfigs wechseln kann, um eine Überhitzung zu vermeiden. Überwachen Sie die Maus, wenn sie in den nächsten 5-10 Minuten aus der Narkose kommt.
  22. Überwachen Sie die Maus in den nächsten 3 Tagen (Gewichtsüberwachung), sorgen Sie für postoperative Pflege (feuchtes, püriertes Chow, um die Flüssigkeitszufuhr zu gewährleisten) und Analgetika (2 mg/kg Meloxicam, 2x täglich subkutan, für 2-3 Tage) in Übereinstimmung mit den Vorschriften des örtlichen Tierschutzausschusses.

2. Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus (AAV) (7 Tage - subakutes Modell oder 21 Tage - chronisches Modell) nach einem Schlaganfall

VORSICHT: Beachten Sie die institutionellen Biosicherheitsrichtlinien für die Arbeit mit AAVs. Gemäß den Richtlinien der University of Toronto wird diese Operation in einer Biosicherheitswerkbank der Eindämmungsstufe 2 durchgeführt.

HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente und Materialien werden vor der Operation im Autoklaven sterilisiert. Der stereotaktische Rahmen wird mit PREempt sterilisiert. Die Spritzen werden mit PREempt, 70% Alkohol sterilisiert und mit sterilem PBS grundiert. AAVs werden während der gesamten Operation auf Eis gelagert.

  1. Richten Sie vor Beginn der Operation den Erholungsbereich ein, indem Sie einen sauberen Käfig auf ein Heizkissen stellen, das auf 37 °C eingestellt ist. Wenn eine Heizlampe verwendet wird, stellen Sie alternativ nur die Hälfte des Käfigs unter die Hitze.
    1. Um Mäuse mit Isofluran zu betäuben, legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer und schalten Sie den Sauerstoff auf 1-1,5 l/min ein, dann stellen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 3%-5% ein, um die Anästhesie einzuleiten (gemäß den von der Schule zugelassenen Protokollen).
  2. Nehmen Sie das Tier aus der Kammer, sobald es auf der Seite liegt und nicht mehr auf einer sauberen Oberfläche stehen kann. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie vor und während der Operation bestätigen, dass kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
    1. Befestigen Sie den vom Anästhesiegerät verlängerten Nasenkonus am Tier und stellen Sie den Isofluran für die Wartung auf 1 % bis 2 % ein. Minimieren Sie die Exposition gegenüber Isofluran (5 Minuten bei 3 % bis 5 % für die Einleitung und die verbleibende Zeit bei 1 % bis 2 %), da der Eingriff bis zu 40 Minuten dauern kann.
  3. Wiegen Sie das Tier und verabreichen Sie die geeignete Dosis eines präoperativen Analgetikums subkutan (Meloxicam (2,0 mg/kg)) basierend auf dem Gewicht.
  4. Tragen Sie Augenschmiersalbe auf jedes Auge der Maus auf, um zu verhindern, dass die Hornhaut unter Narkose austrocknet.
  5. Sterilisieren Sie die mit Fell abgeschnittene Hautpartie mit 70% Ethanol, gefolgt von Chlorhexidinalkohol zweimal, um ein Operationsfeld zu bilden.
  6. Übertragen Sie die Maus auf einen stereotaktischen Mausrahmen, indem Sie zuerst ihre Nase in den stereotaktischen Nasenkegel stecken und dann den Schädel mit Ohrstangen stabilisieren. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen, das auf 37 °C eingestellt ist, um die thermische Unterstützung während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten. Halten Sie den Isofluran bei 1 % bis 2 %, so dass die Maus die Atemfrequenz von 1 Atemzug/s anzeigt.
  7. Wiederholen Sie die Anwendung von Augenschmierung, um bei Bedarf eine Austrocknung der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern. Tragen Sie ein steriles chirurgisches Abdecktuch auf den Körper der Maus unterhalb der Ohren auf, um die Größe des sterilen Feldes zu vergrößern.
  8. Falls noch vorhanden, die Nähte mit einer chirurgischen Schere durchtrennen und den Schorf mit einer Pinzette entfernen. Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
    HINWEIS: Bei chronischem Modell kann es notwendig sein, die Haut mit der Skalpellklinge #10 zu entfernen.
  9. Verwende ein steriles Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen und Bohrlöcher zu lokalisieren.
  10. Richten Sie die Manipulatorarme der stereotaktischen Apparatur mit einem Nadelhalter ein, der eine 26-G-Spritze mit einer 0,375" langen Nadel trägt.
  11. Laden Sie 3,4 μl AAV (1 x 109 Genomkopien (GC)/μl für akute Untersuchungen; 1 x 1010 GC/μl für chronische Untersuchungen) in die Spritze. Um sicherzustellen, dass der Fluss gut ist, geben Sie eine kleine Menge AAV ab, bis ein Tropfen an der Nadelspitze zu beobachten ist. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um den Überschuss abzuwischen, bevor Sie eine Injektion durchführen.
  12. Senken Sie die Nadelspitze über den Schädel hinaus in das erste Bohrloch für ET-1 (im rechten sensomotorischen Kortex bei + 0,0 anterior und 2,25 mm lateral zum Bregma), ohne die Dura mater zu punktieren. Sobald Sie ausgerichtet sind, senken Sie die Nadel 1 mm in das Gehirn ab. (0 AP, +2,25 ML, -1,0 DV von Bregma).
  13. Injizieren Sie 1 μl AAV (1 x 109 GC/μl für akute Untersuchungen; 1 x10 10 GC/μl für chronische Untersuchungen), indem Sie jeweils 0,1 μl abgeben. Schieben Sie den Kolben der Hamilton-Spritze nach vorne, um 0,1 μl abzugeben, und warten Sie eine Minute, bevor Sie die nächsten 0,1 μl injizieren. injizieren, bis 1 μl abgegeben wurde. Nachdem die letzten 0,1 μl abgegeben wurden (0,1 μl x 10 Injektionen = 1 μl insgesamt), halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern, und ziehen Sie sie dann langsam nach oben zurück, um die Spritze zu entfernen.
  14. Um sicherzustellen, dass die Nadel während der Injektion nicht blockiert wird, geben Sie ein kleines Volumen des AAV ab, bis ein Tropfen an der Nadelspitze zu beobachten ist. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um den Überschuss abzuwischen, bevor Sie eine Injektion durchführen.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.14 für die AAV-Injektionen in die beiden verbleibenden Bohrlöcher (im rechten sensomotorischen Kortex bei +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; und -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm vom Bregma). Sterilisieren Sie die Spritzen, bevor Sie dem nächsten Tier PREempt injizieren, gefolgt von 70 % Alkohol und schließlich sterilem PBS.
  16. Um die Wunde zu schließen, nähen Sie die darüber liegende Haut am Schädel mit einer sterilen Naht aus 4-0-Polysorb-Polyester zusammen.
  17. Verabreichen Sie eine antibiotische Salbe, indem Sie ein Wattestäbchen auf den genähten Bereich auftragen, um eine postoperative Infektion zu verhindern.
  18. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie sie in einen sauberen, vorgeheizten Stallkäfig im Auffangbereich um. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer und den Sauerstoff aus.
  19. Lassen Sie die Maus im Käfig und sterilisieren Sie die Außenseite des Käfigs mit PREempt und 70% Alkohol, bevor Sie sie auf ein Heizkissen legen, um sich von der Narkose zu erholen.
    1. Wenn Sie eine Heizlampe verwenden, platzieren Sie die Maus alternativ an der Seite des Käfigs unter der Lampe, damit sich die Maus nach dem Aufwachen aus der Narkose auf die kühle Seite des Käfigs bewegen kann, um eine Überhitzung zu vermeiden. Überwachen Sie die Maus, wenn sie in den nächsten 5-10 Minuten aus der Narkose kommt.
  20. Überwachen Sie die Maus in den nächsten 3 Tagen (Gewichtsüberwachung), sorgen Sie für postoperative Pflege (feuchtes, püriertes Chow, um die Flüssigkeitszufuhr zu gewährleisten) und Analgetika (2 mg/kg Meloxicam, 2x täglich subkutan, für 2-3 Tage) gemäß den Vorschriften des örtlichen Tierschutzausschusses.

3. Gewebeaufbereitung und -dissektion

  1. Um die Maus einzuschläfern, injizieren Sie der Maus intraperitoneal Tribromethanol (Avertin) (konz. 12,5 mg/ml, 250 mg/KG(kg)) und warten Sie 2-3 Minuten für die vollständige Induktion. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie die Maus aus dem Käfig nehmen und bestätigen, dass kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
  2. In einem Abzug ist die transkardiale Perfusion26 mit Kochsalzlösung gefolgt von 4 % Paraformaldehyd durchzuführen. Besprühen Sie den Kopf des eingeschläferten Tieres mit 70% Ethanol, bis er eingeweicht ist.
  3. Schneide den Kopf an der Schädelbasis mit einer großen Schere ab. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie des gesamten Schädels mit einer geraden 4-1/2" Irisschere auf. Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
  4. Aus der Öffnung der Wirbelsäule am Hals führen Sie die Irisschere ein und schneiden den Schädel entlang der sagittalen und interfrontalen Naht durch.
  5. Führen Sie dann eine Schere in die beiden Augenhöhlen ein und schneiden Sie die frontal-nasale Naht durch.
  6. Achten Sie besonders darauf, das Gehirn nicht zu schädigen. Hebeln Sie die Schädelplatten nach links und rechts auf, bis das Gehirn freigelegt ist.
  7. Übertragen Sie das Gehirn in ein Szintillationsfläschchen mit 4 % Paraformaldehyd. Halten Sie das Gehirn in 4% Paraformaldehyd für 4 Stunden bei 4 °C.
  8. Das Gehirn wird dann kryogeschützt, indem 4 % Paraformaldehyd durch 30 % Saccharose ersetzt werden. Halten Sie das Gehirn in 30%iger Saccharose bei 4 °C, bis das Gehirn auf den Boden des Fläschchens sinkt (~12 h).

4. Schneiden von gefrorenen Gehirnen

  1. Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer zwischen -20 °C und -26 °C ein.
  2. Machen Sie einen koronalen Schnitt durch das Kleinhirn und befestigen Sie den flachen, kaudalen Teil des Gehirns an einem Kryostat-Futter mit optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT).
  3. Setzen Sie das Bohrfutter mit dem Gehirn in den Scheibenhalter ein und richten Sie den Riechkolben auf die Messerklinge aus.
  4. Schneiden Sie das Gehirn in koronale Schnitte mit einer Dicke von 20 μm. Um Schlieren oder Kratzlinien auf geschnittenen Hirnschnitten zu vermeiden, legen Sie ein Stück Klebeband auf die Trennplattform, um einen kleinen Spalt zwischen der Anti-Rollplatte und der Plattform zu schaffen. Mit einem Pinsel kann die Ausrichtung des Abschnitts angepasst werden, bevor er auf einem positiv geladenen Glasobjektträger festgehalten wird.
  5. Lagern Sie Objektträger mit Hirnschnitten bei -20 °C.

5. Immunhistochemie und Quantifizierung

  1. Die Schnitte für die Immunhistochemie werden mit einem primären Antikörper gegen NeuN, einen panneuronalen Marker, gemäß den Standardprotokollen 22,26 bearbeitet.
  2. Kryokonservierte Hirnschnitte 5 Minuten bei Raumtemperatur auftauen. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jeweils 5 min.
  3. Inkubieren Sie die Schnitte in 0,3 % Triton X-100 in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um zu permeabilizieren.
  4. Bereiten Sie die Blockierungslösung vor (5 % normales Ziegenserum und 0,3 % Triton X-100 in PBS) und inkubieren Sie die Schnitte in der Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Der Primärantikörper, Kaninchen-Anti-NeuN, wird in der Blockierungslösung im Verhältnis 1:500 verdünnt. Die Schnitte werden über Nacht bei 4 °C mit der primären Antikörperlösung inkubiert.
  6. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit 0,3 % Triton X-100 in PBS, jeweils 5 Minuten lang.
  7. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper, Ziegen-Anti-Kaninchen 568 oder 488, im Verhältnis 1:1000 in PBS. Inkubieren Sie die Schnitte mit der Sekundärantikörperlösung 1 h lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
  8. Führen Sie drei Wäschen mit 0,3 % Triton X-100 in PBS für jeweils 5 Minuten durch. Inkubieren Sie die Schnitte mit DAPI (1:10.000 in PBS) für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  9. Waschen Sie die Abschnitte noch dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Montieren Sie die beizifizierten Abschnitte auf einem Objektträger mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium und einem Glasdeckglas. Lassen Sie die montierten Dias über Nacht trocknen.
  10. Bildte gefärbte Objektträger mit einem 20-fach-Objektiv und einem konfokalen Mikroskop, um Ansichten von Reporter+-Zellen um die Schlaganfallläsion herum in 3 verschiedenen koronalen Schnitten (zwischen den anatomischen Regionen der Kreuzung des Corpus callosum anterior und der Kreuzung der vorderen Kommissur posterior) für jedes Tier zu erhalten.
    HINWEIS: Der Abstand der AAV-Spreizung variiert innerhalb der Hemisphäre. Basierend auf unseren Erfahrungen und der Analyse von Reporter+-Zellen nach der Gewebeverarbeitung erstreckt sich die AAV-Ausbreitung jedoch im Allgemeinen über etwa +3 mm bis -3 mm ab dem Bregma. Reporter+-Zellen um die Schlaganfallläsion (identifiziert durch die Abwesenheit/spärliche Färbung von NeuN) in dem Bereich zwischen dem Corpus callosum, das die Mittellinie kreuzt, und der Verbindung zwischen der vorderen Kommissur sollten quantifiziert werden.
  11. Zur Quantifizierung von transduzierten Neuronen führen Sie eine Kolokalisationsanalyse durch. Zählen Sie manuell die Anzahl der doppelt positiven Zellen (Reporter+NeuN+) und die Gesamtzahl der transduzierten (Reporter+) Zellen in Hirnschnitten. Für die vorliegenden Ergebnisse wurden >3 Gesichtsfelder um die Läsion herum (medial, lateral und inferior) von 3 koronalen Schnitten pro Maus gezählt.

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Ergebnisse

Zur Untersuchung der zellulären Ergebnisse der kurzen GFAP (gfaABC(1)D)-Promotor-gesteuerten, ektopischen Neurod1-Expression in Wildtyp-Stämmen (C57BL/6J) und in transgenen tdTom-Cre-Reporterstämmen (insbesondere B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 wurden zwei AAV5-basierte Systeme bei ET-1-Schlaganfall-verletzten Mäusen eingesetzt (Abbildung 1A-C). In einem subakute...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt zwei AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 im Rahmen eines leichten bis mittelschweren kortikalen ET-1-Schlaganfallmodells. Eine Reihe kritischer Schritte im Zusammenhang mit dem ET-1-Schlaganfall sind wichtig für die Reproduzierbarkeit und Konsistenz der Verletzung. Bohrlöcher müssen sorgfältig gebohrt werden, ohne die Dura Mater zu durchstechen, um unbeabsichtigte chirurgische Verletzungen zu vermeid...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Heart and Stroke Foundation, dem Ontario Institute of Regenerative Medicine, dem Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) und dem Connaught Innovation Award (University of Toronto).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

Referenzen

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