بروتوكول محسن للرولز السويسرية المعوية وتلطيخ الفلورسنت المناعي للأنسجة المدمجة في البارافين

Summary

الأمعاء أمر حيوي للهضم والامتصاص. كل منطقة - الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، القولون - تخدم وظائف مميزة بسبب الهياكل الخلوية الفريدة. تتطلب دراسة فسيولوجيا الأمعاء تحليلا دقيقا للأنسجة. يحدد هذا البروتوكول تثبيت الأنسجة ومعالجتها باستخدام تقنية Swiss roll ، مما يضمن تلطيخا مناعيا دقيقا من خلال الحفاظ على الأنسجة وتوجيهها بشكل صحيح.

Abstract

الأمعاء هي عضو معقد يتكون من الأمعاء الدقيقة والأمعاء. يمكن تقسيم الأمعاء الدقيقة إلى اثني عشر والصائم والدقاقي. كل منطقة تشريحية من الأمعاء لها وظيفة فريدة تنعكس من خلال الاختلافات في البنية الخلوية. يتطلب التحقيق في التغيرات في الأمعاء تحليلا متعمقا لمناطق الأنسجة المختلفة والتغيرات الخلوية. لدراسة الأمعاء وتصور قطع كبيرة من الأنسجة ، يستخدم الباحثون عادة تقنية تعرف باسم القوائم السويسرية المعوية. في هذه التقنية ، تنقسم الأمعاء إلى كل منطقة تشريحية وثابتة في اتجاه مسطح. بعد ذلك ، يتم لف الأنسجة بعناية ومعالجتها لتضمين البارافين. يعد التثبيت والتوجيه المناسبين للأنسجة تقنية مختبرية غالبا ما يتم تجاهلها ولكنها مهمة للغاية للتحليل النهائي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التدحرج السويسري غير السليم للأنسجة المعوية إلى إتلاف ظهارة الأمعاء الهشة ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الأنسجة للتلطيخ المناعي. يعد ضمان الأنسجة الثابتة جيدا والموجهة بشكل صحيح مع الهياكل الخلوية السليمة خطوة حاسمة تضمن التصور الأمثل للخلايا المعوية. نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة وبسيطة لصنع لفائف سويسرية لتشمل جميع أقسام الأمعاء في كتلة واحدة مدمجة بالبارافين. كما وصفنا تلطيخ الأنسجة المعوية بالإشعاع المناعي الأمثل لدراسة الجوانب المختلفة لظهارة الأمعاء. يوفر البروتوكول التالي للباحثين دليلا شاملا للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية وتقنية Swiss-roll و immunostaining. إن استخدام هذه الأساليب المكررة يحافظ على التشكل المعقد لظهارة الأمعاء ويعزز فهما أعمق لفسيولوجيا الأمعاء وعلم الأمراض المرضي.

Introduction

تشكل البنية الخلوية للأمعاء تحديا فريدا في الحفاظ على سلامتها الهيكلية عندما يتم الحفاظ على الأنسجة المعوية للتلطيخ المناعي. تتكون الأمعاء الدقيقة من تراكيب ممدودة تشبه الأصابع تعرف باسم الزغابات¹. غالبا ما تصبح هذه الزغابات مشوهة أثناء عمليات التضمين. إن التأكد من أن الباحثين لديهم تقنيات لتضمين الأمعاء بشكل صحيح لتحقيق المقاطع العرضية ، مما يسمح بتصور جميع مناطق الأمعاء ، وكذلك الطبقات التي تشكل الأمعاء (أي البروبريا العضلية ، والغشاء المخاطي ، والمصل) ، أمر بالغ الأهمية للتحليل التجريبي القوي². سيؤدي التثبيت غير الكافي والتثبيت المفرط والتعامل غير السليم مع الأنسجة إلى الإضرار بسلامة الأنسجة ، مما يؤدي إلى تلف غير مقصود لظهارة الأمعاء ^3,4. يمكن أن يؤدي إتلاف ظهارة الأمعاء خلال هذه الخطوات إلى تقليل جودة التحليلات اللاحقة بشكل كبير ، مثل التألق المناعي ، بغض النظر عن فعالية بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية والأجسام المضادة المستخدمة.

يعد التلوين المناعي ، مثل التثبيت المناسب للأنسجة ، جزءا مهما من البحوث الطبية الحيوية. عندما يتم ذلك بشكل جيد ، يمكن أن يضيء التلوين المناعي جوانب غير معروفة سابقا من البنية الخلوية والوظيفة. يمكن أن يكون تلطيخ التألق المناعي لأقسام البارافين أمرا صعبا بسبب التعديلات الفيزيائية والكيميائية الناتجة عن عملية التثبيت وتضمين البارافين⁵. يؤدي التثبيت وتضمين البارافين إلى إخفاء المستضد الذي يمكن أن يتداخل مع الكشف عن التألق المناعي للحواتم ذات الأهمية⁶. يمكن أن يؤدي التثبيت المتأخر إلى تدهور التحلل البروتيني ، مما يؤدي إلى ضعف أو غياب تلطيخ الحواتم الحرجة⁷. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون الأجسام المضادة غير دقيقة مع مستويات عالية من الخلفية. يمكن أن توفر بروتوكولات التلوين المناعي التي تعزز ارتباط الأجسام المضادة المتسق والمحدد ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية معلومات قيمة للباحثين.

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا مصمما للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية ، وإعداد اللفة^{السويسرية 8} ، والتلوين المناعي. مع التأكيد على المبادئ التوجيهية للحفاظ على سلامة الأمعاء ، يهدف البروتوكول إلى تزويد الباحثين بمنهجية قوية لتعزيز جودة وموثوقية دراسات التصوير المناعي. لقد سعينا أيضا إلى استخدام موارد فعالة من حيث التكلفة ، بما في ذلك ورق الترشيح واسترجاع المستضد محلي الصنع ، وحلول الحظر ، ومخففات الأجسام المضادة لجعل البروتوكول في متناول المختبرات التي قد تكون مقيدة الأموال. بالنسبة لجميع البروتوكولات التجريبية ، يجب على الباحثين تحسين البروتوكول الحالي بناء على نهجهم التجريبي ومجالات اهتمامهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة ساوث كارولينا الطبية على جميع رعاية وصيانتها وعلاجها. تم جمع الأنسجة المعوية من الفئران البالغة C57BL / 6J (الذكور والإناث من 3-5 أشهر ، ويزن حوالي 30 جم) لاستخدامها في الدراسة الحالية.

1. تثبيت الأنسجة المعوية

1. قم بتشريح الأمعاء بأكملها بعناية من فأر القتل الرحيم وضعه في وعاء وزن أو طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بإزالة الأمعاء من برنامج تلفزيوني واستخدم المقص لإزالة الدهون الزائدة والأنسجة الضامة برفق. يساعد قطع النسيج الضام الأنسجة على الاستلقاء أثناء الخطوات اللاحقة.
3. قسم الأمعاء إلى شرائح فردية باستخدام المقص (أي الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، الأعور ، والقولون). قسم الأجزاء بناء على السمات التشريحية و / أو الطول ، حيث يكون ما يقرب من 13٪ من طول الأمعاء اثني عشر ، و 58٪ هو الصائم ، و 8٪ هو الدقاق ، و 6٪ الأعور ، والقولون 15٪ ⁹. يتبع الاثني عشر المعدة ، والدقاق هو الجزء الطرفي من الأمعاء الدقيقة قبل الأعور مباشرة.
4. حرر القولون عن طريق قطع حيث ينضم إلى الأعور باستخدام المقص. ضع الاثني عشر والصائم والدقاق والقولون في وعاء الوزن أو طبق بتري من برنامج تلفزيوني. تجاهل الأعور أو إصلاحه وفقا للطرق المنشورة الأخرى¹⁰.
5. قم بتوصيل طرف ماصة P200 بحقنة سعة 10 مل عن طريق قطع الطرف الكبير من الطرف بشفرة حلاقة. ملء حقنة مع برنامج تلفزيوني.
6. أدخل طرف المحقنة في فتحة شريحة معوية باستخدام ملقط. استخدم الملقط لتثبيت الجزء المعوي على المحقنة واغسله برفق بمعدل ~ 50 ميكرولتر / ثانية لإزالة محتويات الأمعاء. اجمع محتويات الأمعاء في وعاء وزن فارغ أو طبق بتري.
7. ضع الجزء المعوي الرطب في خط مستقيم على شريط من ورق ترشيح السليلوز الجاف المسمى (انظر جدول المواد). تأكد من أن الجزء المعوي مبلل بدرجة كافية للالتصاق بشكل صحيح بورق الترشيح الجاف. قم بتسمية ورقة الترشيح بمعلومات رقم الماوس والنمط الجيني والمجموعة التجريبية وما إلى ذلك باستخدام قلم رصاص.
   ملاحظة: قد يؤدي استخدام قلم لتسمية ورق الترشيح إلى فقدان الملصقات أثناء التثبيت.
8. استخدم مقص التشريح لقطع الأمعاء مفتوحة طوليا على طول خط المساريق. قص ~ 5 مم في المرة الواحدة ، باستخدام الحافة السفلية للمقص أو زوج من الملقط لوضع الأنسجة المقطوعة بشكل مسطح على ورق الترشيح. استمر حتى يتم قطع الجزء بأكمله من الأمعاء ووضعه بشكل مسطح على ورق الترشيح. احرص على قطع الأمعاء المفتوحة في خط مستقيم قدر الإمكان ، لأن هذا سيجعل من السهل لف الأنسجة.
   ملاحظة: يمكن استخدام مقص رأس الكرة خلال هذه الخطوة لتجنب تلف الأنسجة.
9. ضع قطعة أخرى من ورق الترشيح أعلى الجزء المعوي. تأكد من أن ورق الترشيح يقوم بشطائر الجزء المعوي ، مما يمنع الأمعاء من التجعيد أو فقدان شكلها المسطح أثناء التثبيت.
10. قم بتدبيس حواف ورق الترشيح لتثبيت الأنسجة في مكانها. لا تدبيس المنديل. ضع ما يكفي من الدبابيس حول المنديل لمنع انفصال الأنسجة عن ورق الترشيح أثناء التثبيت.
11. كرر الخطوات 1.5-1.10 لكل جزء من أجزاء الأمعاء (الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون).
12. اغمر الأنسجة في 10٪ فورمالين مخزن طبيعي (أو مثبت من اختيارك مثل 4٪ بارافورمالدهيد ، مثبت كارنوي ، إلخ) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية الصحيحة لأن المثبتات مثل الفورمالين سامة.

2. لف الأنسجة المعوية ومعالجتها

تنبيه: نفذ الخطوات من 2.1 إلى 2.6 في غطاء محرك السيارة جيد التهوية.

1. قم بإزالة القطعة العلوية من ورق الترشيح برفق (تلك التي تلامس الجانب اللمعي من الأمعاء). استخدم الملقط لتقشير الأمعاء بعناية من القطعة السفلية من ورق الترشيح. تخلص من ورق الترشيح.
2. املأ ثلاثة قوارب وزن ب PBS. اغسل المناديل في برنامج تلفزيوني 3x لإزالة الفورمالين من الأنسجة.
3. باستخدام ملقط الحركة العكسية (انظر جدول المواد) ، التقط قطعة من الأمعاء على طول الحافة القصيرة مع توجيه الجانب اللمعي لأعلى. أدر الملقط للف الأنسجة. استخدم زوجا من الملقط العادي للمساعدة في توجيه الأنسجة أثناء لفها. إذا تم طي المنديل ، فقم بفكه وحاول مرة أخرى.
4. ضع المنديل في وعاء وزن جاف أو طبق بتري. امسك المنديل في مكانه باستخدام ملقط في يد واحدة. افتح ملقط الحركة العكسية بعناية وحرر الأنسجة ، باستخدام الملقط الآخر لإزاحة الأنسجة من ملقط الحركة العكسية.
5. أدخل دبوس تشريح بحجم 00 أو دبوس دقيق في الأنسجة (انظر جدول المواد). استخدم قواطع الأسلاك لإزالة الطرف الحاد للدبوس. ضع المنديل في كاسيت كبير ثم ضع الكاسيت في وعاء يحتوي على 70٪ من الإيثانول حتى يصبح جاهزا للمعالجة.
6. كرر الخطوات 2.1-2.5 مع جميع الأجزاء المعوية (الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون) ، مع وضع جميع لفائف الأنسجة الأربعة في نفس الكاسيت الكبير (انظر جدول المواد). تأكد من أن الدرج مكتوب عليه بقلم رصاص لمنع الملصق من الغسل في محاليل الإيثانول والزيلين (انظر جدول المواد).
7. بمجرد لف جميع العينات ، ضع العينات في معالج الأنسجة. استخدم الإعدادات التالية للأنسجة المعوية: 70٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 90٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 100٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ، 3x ؛ زيلين لمدة 35 دقيقة ، 3x ؛ البارافين لمدة 60 دقيقة ، 3x. يمكن ترك الكاسيتات في شمع البارافين المذاب لفترات زمنية طويلة.
   تنبيه: تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة لأن الزيلين مادة كيميائية سامة.

3. تضمين الأنسجة المعوية

1. سخن قوالب التضمين الكبيرة للحفاظ على ذوبان البارافين.
2. أخرج الكاسيتات من معالج الأنسجة وضعها في كأس من البارافين المذاب.
3. في محطة التضمين ، ضع كمية صغيرة من البارافين في قالب. قم بإزالة اللفائف السويسرية الأربعة من الكاسيت وضعها جميعا في قالب واحد ، وضعها بشكل مسطح قدر الإمكان. أضف المزيد من البارافين لملء القالب.
4. انقل القالب إلى اللوحة الباردة وتأكد من أن جميع اللفائف السويسرية مسطحة في الجزء السفلي من القالب. ضع سطح كاسيت صغير مكتوب عليه (انظر جدول المواد) على القالب وأضف المزيد من البارافين إذا لزم الأمر.
5. بمجرد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة الكتلة من القالب. الأنسجة جاهزة الآن للتقطيع إلى شرائح 5 ميكرومتر وتطفو على شرائح زجاجية مشحونة للتلطيخ المناعي¹¹.

4. التصاق الأنسجة وإعداد الشرائح

1. لضمان التصاق قسم مناديل البارافين المحضر 5 ميكرومتر بالشريحة ، ينزلق الزجاج الحراري على جهاز تسخين منزلق أو كتلة حرارية مضبوطة على 60 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. يمكن أيضا ترك الشرائح ساخنة لفترة أطول ؛ هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.
2. دع الشرائح تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 15 دقيقة).

5. إزالة البارافين

1. عند البدء في إزالة البارافين من الشرائح ، تأكد من بقاء الأنسجة في محلول ولا تجف طوال فترة التلوين المناعي.
2. استخدم رفا منزلقا (انظر جدول المواد) لتثبيت الشرائح الزجاجية ووضعها داخل طبق مقاوم للمذيبات (انظر جدول المواد) مملوء بكاشف إزالة / إزالة البارافين (انظر جدول المواد). تأكد من أن الكاشف يغطي الأنسجة بالكامل على كل شريحة. قبل غمر الشرائح تماما في كاشف المقاصة ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات في محلول المقاصة. اترك الشرائح مغمورة لمدة 10 دقائق أو أكثر.
   ملاحظة: قد يلزم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء جيد التهوية بسبب الأبخرة الخطرة ، اعتمادا على عامل التطهير المختار. إزالة البارافين من الأنسجة في هذه الخطوة ليست حساسة للوقت ، إذا كنت تستخدم عامل تطهير غير سام.
3. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة كاشف الإزالة الزائد. في طبق جديد مقاوم للمذيبات ، كرر الخطوة 5.2.
4. في طبق جديد مقاوم للمذيبات ، كرر الخطوة 5.3. اترك الشرائح مغمورة لمدة 15 دقيقة أو أكثر. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.

6. الإماهة

1. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة كاشف الإزالة الزائد. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ ، اغمس أو ادفع رف الشرائح عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت. كرر 2x.
2. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 100٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 95٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت. كرر 1x.
3. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 95٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع رف الشرائح عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
4. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 70٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 50٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
5. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 50٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بالماء منزوع الأيونات (DI) ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
   1. للتوقف هنا ، ضع الشرائح في وعاء به برنامج تلفزيوني حتى يمكن استئناف التلوين المناعي بعد خطوة الإماهة المائية لمدة 5 دقائق.

7. استرجاع المستضد

1. املأ طبقا جديدا مقاوما للمذيبات بمخزن مؤقت مناسب لاسترجاع المستضد. انقل رف الشرائح مباشرة إلى هذا الحل. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل في محلول استرجاع المستضد ، وتغطي الأنسجة بالكامل.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف حلول استرجاع المستضد المثلى اعتمادا على الجسم المضاد المعين المستخدم. قد يحتاج الباحث إلى تحديد استرجاع المستضد المطلوب للأجسام المضادة الفردية.
   1. لعمل 1x مخزن مؤقت لاسترجاع مستضد السيترات ، أضف 2.94 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم (انظر جدول المواد) لكل 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. بمجرد إذابة ثنائي هيدرات سترات الصوديوم ، أضف كلوريد الهيدروجين (انظر جدول المواد) حتى يصل المحلول إلى درجة حموضة 6. أخيرا ، أضف 500 ميكرولتر من Tween20 (انظر جدول المواد) لكل 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
   2. لعمل 1x Tris-EDTA مخزن مؤقت لاسترجاع المستضد ، أضف 1.211 جم قاعدة Tris و 0.292 جم EDTA في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. بمجرد إذابته ، اضبط على الرقم الهيدروجيني 9.
2. قم بتغطية الطبق المقاوم للمذيبات الذي يحتوي على محلول استرجاع المستضد والشرائح بغطاء وثبت الغطاء بأشرطة مطاطية.
3. ضع الطبق الآمن المقاوم للمذيبات في قدر الضغط (انظر جدول المواد) أعلى الرف المعدني أو الحامل الثلاثي. تأكد من وجود كمية كافية من الماء في قدر الضغط للوصول إلى الرف المعدني أو الحامل حتى يتراكم الضغط.
4. ضع الغطاء على قدر الضغط وقم بلفه في اتجاه عقارب الساعة لتثبيت الغطاء في مكانه. قم بلف صمام حد الضغط الموجود على الغطاء إلى إعداد الضغط.
5. ضمن إعداد القائمة ، حدد الضغط العالي على قدر الضغط ، ثم ضمن إعداد الوقت ، اضبط قدر الضغط على 30 دقيقة. حدد ابدأ.
6. بعد 30 دقيقة ، سيصدر قدر الضغط صوتا ويتم ضبطه تلقائيا على إعداد الاحتفاظ بالدفء. انتظر حتى يتحرر الضغط بشكل طبيعي ويتم فك الغطاء بحرية.
7. استخدم قفازات مقاومة للحرارة (انظر جدول المواد) لإزالة الطبق المقاوم للمذيبات من قدر الضغط وإزالة الشريط المطاطي والغطاء. ضع الطبق في حمام جليدي لمدة ~ 30 دقيقة للسماح للشرائح بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.
8. بمجرد تبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الرف المنزلق من الطبق المقاوم للمذيبات وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بماء DI لإزالة محلول استرجاع المستضد المتبقي. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل.
9. أخرج الرف المنزلق من ماء DI وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.

8. منع تلطيخ الخلفية غير المحددة

1. قم بإعداد غرفة مرطبة عن طريق أخذ صندوق منزلق كبير وإزالة غطاء الكرتون الملتصق بالغطاء. في قاعدة صندوق الشرائح ، ضع مناشف ورقية مبللة عموديا لأسفل. تأكد من وضع المناشف الورقية الرطبة بشكل مسطح.
2. قم بإزالة شريحة واحدة تلو الأخرى من حامل الشرائح المغمور في PBS. امسح بعناية PBS الزائد على الشريحة الزجاجية ، وتجنب الأنسجة.
3. باستخدام قلم كاره للماء (انظر جدول المواد) ، قم بتشكيل حاجز يحيط بالأنسجة عن طريق رسم مربع حول الأنسجة باستخدام القلم الكارهة للماء. احرص على تجنب الأنسجة وعدم استخدام القلم الكارهة للماء بالقرب من الأنسجة.
4. ضع الشريحة المحددة أفقيا فوق المناشف الورقية المبللة. أضف عازلة مانعة لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
   1. لعمل عازل مانع ، أضف 100 ميكرولتر من جيلاتين جلد أسماك الماء البارد (Teleostein Gelatin ؛ انظر جدول المواد) إلى 9.85 مل من PBS. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 (انظر جدول المواد) واخلطها حتى تذوب.
5. كرر الخطوات من 8.2 إلى 8.4 لكل شريحة. أغلق الغرفة الرطبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.

9. الماوس على حجب الماوس

1. عند استخدام جسم مضاد أساسي للفأر لأنسجة الفئران المناعية ، قم بإجراء خطوة حظر إضافية. الكواشف المانعة للفأر (كتلة الماوس على الماوس ؛ انظر جدول المواد) متاحة تجاريا ؛ اتبع التعليمات التجارية عند إعداد كتلة الماوس على الماوس.
2. اضغط برفق على محلول الحظر وأضف على الفور كتلة الماوس على الماوس المعدة لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر). كرر لكل شريحة تحتوي على أنسجة الفأر ، والتي سيتم تلطيخها باستخدام جسم مضاد أولي أثير في الفئران.
3. احتضان أقسام الأنسجة في صندوق الغرفة المرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. قم بإزالة الشرائح من الغرفة المرطب وضعها مباشرة في رف منزلق مغمور في PBS. اترك الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لغسل كتلة الماوس على الماوس.

10. الأجسام المضادة الأولية

1. لكل شريحة ، حدد الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية التي يتم تربيتها في أنواع مختلفة. تمييع الأجسام المضادة الأولية في مخفف الأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: E-CADHERIN (1: 100) ، MUC2 (1: 200) ، PCNA (1: 500) ، LAMININ (1: 200) ، β-CATENIN (1: 200) ، و LAMP1 (1:50).
   ملاحظة: إذا لم تقدم الشركة المصنعة التخفيفات الموصى بها ، فإن التخفيف 1: 100 هو نقطة انطلاق جيدة. إذا كان الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام مقترنا بالفلوروفور ، فراجع الخطوة 12.2.
   1. لجعل مخفف الجسم المضاد ، أضف المخزن المؤقت المانع 1:20 إلى PBS ، في حالة استخدام المخزن المؤقت لحجب جيلاتين السمك الموصوف أعلاه.
2. قم بإزالة الشرائح من PBS أو من الغرفة المرطبة، واضغط برفق على محلول الحجب الزائد أو PBS، وضعها أفقيا مرة أخرى في الغرفة المرطبة. تأكد من بقاء الحاجز الذي تم إنشاؤه باستخدام القلم الكارهة للماء في الخطوة 8.3 ؛ حدد الخطوط العريضة للأنسجة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
3. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة بشكل مناسب والتي تهمك لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
4. أغلق الغرفة المرطبة واحتضن الشرائح على سطح مستو عند 4 درجات مئوية في الظلام طوال الليل.

11. غسل الشرائح

1. قم بإزالة الشرائح من الغرفة المرطبة، واضغط برفق على الأجسام المضادة الأولية، وضع الشرائح في رف منزلق مغمور في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
2. قم بإزالة الرف المنزلق وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 1x.

12. الأجسام المضادة الثانوية وتلطيخ النوى

1. لكل شريحة ، حدد فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية المصممة للارتباط بأنواع الأجسام المضادة الأولية. تمييع فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية أو الأجسام المضادة الأولية المترافقة في مخفف الأجسام المضادة الثانوية. كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هي حمار مضاد للماعز 488 (1: 200) ، حمار مضاد للأرانب cy3 (1: 200) ، حمار مضاد للفأر 647 (1: 200) ، حمار مضاد للأرانب 647 (1: 200) ، وحمار مضاد للفئران cy3 (1: 200). تم استخدام الجسم المضاد الأساسي γ-ACTIN المترافق مع الفلوروفور 647 عند تخفيف 1: 100.
   1. لجعل مخفف الأجسام المضادة الثانوية ، أضف المخزن المؤقت المانع 1: 100 إلى PBS ، في حالة استخدام المخزن المؤقت لحجب جيلاتين الأسماك كما هو موضح أعلاه.
2. قم بإزالة الشرائح من PBS ، وانقر برفق على PBS الزائد ، وضعها أفقيا مرة أخرى في الغرفة المرطبة. تأكد من بقاء الحاجز الذي تم إنشاؤه باستخدام القلم الكارهة للماء في الخطوة 8.3 ؛ حدد الخطوط العريضة للأنسجة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
3. أضف فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية المخففة بشكل مناسب أو الأجسام المضادة الأولية المترافقة ذات الأهمية لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
4. أغلق الغرفة الرطبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1 ساعة.
5. تمييع 10 ملغ / مل Hoechst (انظر جدول المواد) أو DAPI باستخدام PBS لتركيز نهائي من 1 ميكروغرام / مل Hoechst أو DAPI باستخدام PBS وإضافة مباشرة إلى الأنسجة (~ 100 μL). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
6. قم بإزالة الشرائح من الغرفة الرطبة وضعها في رف منزلق مغمور في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
7. قم بإزالة الرف المنزلق وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق في الظلام. كرر الخطوة 1x.

13. التركيب والتحضير للفحص المجهري

1. قم بإزالة شريحة واحدة في كل مرة من رف الشرائح المغمور في PBS ، مع إبقاء الشرائح المتبقية مغمورة في PBS في الظلام. اضغط برفق على PBS الزائد ، وإذا لزم الأمر ، استخدم منديلا خاليا من النسالة لمسح PBS الزائد بعناية على الشريحة الزجاجية ، وتجنب المنديل.
2. أضف قطرة أو قطرتين من وسط تركيب مضاد التلاشي (انظر جدول المواد) إلى مركز الأنسجة.
3. أمسك غطاء نظيفا (انظر جدول المواد ) من الحواف وقم بخفضه ببطء على الشريحة بزاوية 45 درجة. تأكد من أن وسط التثبيت ينتشر بالتساوي على الأنسجة.
4. بدءا من وسط المنديل ، اضغط برفق على غطاء الغطاء بإصبعين للمساعدة في إزالة فقاعات الهواء ووسط التثبيت الزائد. إذا لزم الأمر ، استمر في الضغط باتجاه الحواف وحافظ على الضغط اللطيف طوال الوقت.
5. اقطع الطرف الصغير من ماصة P200 غير المفلترة وأرفقها بطرف ماصة مصلية متصلة بالفراغ.
6. باتباع حواف غطاء الغطاء ، استخدم المكنسة الكهربائية لإزالة وسيط التثبيت الزائد.
7. في مربع شرائح جديد ، ضع الشريحة أفقيا بشكل مسطح واترك الشريحة تجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
8. كرر هذه العملية لكل شريحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) ، كما هو موضح سابقا¹². باستخدام الطريقة المثلى ، تضمنت اللفائف السويسرية المعوية جميع الأجزاء الثلاثة للأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة على شريحة واحدة. يسمح استيعاب الأمعاء بأكملها على شريحة للباحثين بتحليل التغييرات في جميع أجزاء ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا ، نقدم طريقة محسنة لتثبيت الأنسجة باستخدام تقنية Swiss roll للحفاظ على بنية الأمعاء وتعزيز تلطيخ المناعة الدقيق. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية التي تنطوي على فسيولوجيا الأمعاء وبيولوجيا الخلية¹⁹. تم نشر العديد من طرق الدر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638