腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール

要約

腸は消化と吸収に不可欠です。各領域(十二指腸、空腸、回腸、結腸)は、独自の細胞構造により、異なる機能を果たします。腸の生理学を研究するには、綿密な組織分析が必要です。このプロトコールでは、スイスロール法を用いた組織の固定と処理の概要を説明し、適切な組織の保存と配向を通じて正確な免疫染色を保証します。

要約

腸は、小腸と大腸からなる複雑な器官です。小腸はさらに十二指腸、空腸、回腸に分けることができます。腸の各解剖学的領域には、細胞構造の違いによって反映される独自の機能があります。腸の変化を調べるには、さまざまな組織領域と細胞の変化を詳細に分析する必要があります。腸を研究し、大きな組織片を視覚化するために、研究者は通常、腸内スイスロールと呼ばれる技術を使用します。この技術では、腸は各解剖学的領域に分割され、平らな向きに固定されます。次に、組織を慎重に巻き、パラフィン包埋のために処理します。適切な組織の固定と配向は、見落とされがちな実験室技術ですが、下流の分析にとって非常に重要です。さらに、腸組織の不適切なスイスローリングは、壊れやすい腸上皮を損傷し、免疫染色のための組織品質の低下につながる可能性があります。無傷の細胞構造でしっかりと固定され、適切に配向された組織を確保することは、腸細胞の最適な視覚化を確実にするための重要なステップです。私たちは、腸のすべてのセクションを単一のパラフィン包埋ブロックに含めるスイスロールを作成するための費用対効果の高い簡単な方法を紹介します。また、腸上皮のさまざまな側面を研究するための腸組織の最適化された免疫蛍光染色についても説明します。以下のプロトコルは、腸管組織固定、スイスロール法、免疫染色を通じて高品質の免疫蛍光画像を取得するための包括的なガイドを研究者に提供します。これらの洗練されたアプローチを採用することで、腸上皮の複雑な形態が維持され、腸の生理学と病理生物学のより深い理解が促進されます。

概要

腸の細胞構造は、腸組織が免疫染色のために保存される際に、その構造的完全性を維持する上で独自の課題を提起します。小腸は、絨毛¹として知られる細長い指のような構造で構成されています。これらの絨毛は、埋め込みプロセス中に奇形になることがよくあります。研究者が腸を適切に埋め込んで断面を達成し、腸のすべての領域と腸を構成する層(つまり、固有筋、粘膜、漿膜)を視覚化できるようにする技術を持っていることを確認することは、堅牢な実験的分析²にとって重要です。不適切な固定、過度の固定、および不適切な組織の取り扱いは、組織の完全性を損ない、腸上皮に不注意な損傷をもたらします^3,4。これらのステップで腸上皮を損傷すると、免疫組織化学プロトコルや使用される抗体の有効性に関係なく、免疫蛍光法などのその後の分析の品質が大幅に低下する可能性があります。

免疫染色は、適切な組織固定と同様に、生物医学研究の重要な部分です。免疫染色がうまくいけば、細胞の構造と機能のこれまで知られていなかった側面を明らかにすることができます。パラフィン切片の免疫蛍光染色は、固定およびパラフィン包^{埋プロセス5}から生じる物理化学的修飾により、困難な場合があります。固定およびパ....

プロトコル

サウスカロライナ医科大学の動物管理・使用委員会は、すべての動物の世話、維持、治療を承認しました。本研究では、C57BL/6Jの成体マウス(生後3〜5ヶ月の雄と雌、体重約30g)から腸管組織を採取しました。

1. 腸管組織固定

1. 安楽死させたマウスから腸全体を慎重に解剖し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む計量ボートまたはペトリ皿に入れます。
2. PBSから腸を取り出し、ハサミを使って余分な脂肪と結合組織をやさしく取り除きます。結合組織を切断すると、その後のステップで組織が平らになります。
3. はさみを使用して腸を個々のセグメントに分割します(つまり、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸)。解剖学的特徴および/または長さに基づいてセグメントを分割し、腸の長さの約13%が十二指腸、58%が空腸、8%が回腸、6%が盲腸、結腸が15^%9です。十二指腸は胃に続き、回腸は盲腸の直前の小腸の終末部分です。
4. はさみを使用して盲腸を結合する場所を切断することにより、結腸を解放します。十二指腸、空腸、回腸、および結腸をPBSの計量ボートまたはペトリ皿に入れます。盲腸を捨てるか、他の公開された方法に従って固定します¹⁰。
5. P200ピペットチップを10mLシリンジに取り付け、カミ....

ディスカッション

ここでは、腸の構造を保存し、正確な免疫染色を促進するために、スイスロール法を使用した組織固定の最適化された方法を紹介します。一度習得すると、この技術は、腸の生理学や細胞生物学を含むさまざまな研究課題を調査するために使用できる¹⁹。いくつかの最適化されたスイスの圧延方法が公開されており、非常に便利です^20,21

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638