Protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina

Resumen

El intestino es vital para la digestión y la absorción. Cada región (duodeno, yeyuno, íleon, colon) cumple funciones distintas debido a estructuras celulares únicas. El estudio de la fisiología intestinal exige un análisis meticuloso de los tejidos. Este protocolo describe la fijación y el procesamiento de tejidos mediante la técnica de rollo suizo, lo que garantiza una inmunotinción precisa a través de la preservación y orientación adecuadas de los tejidos.

Resumen

El intestino es un órgano complejo compuesto por el intestino delgado y el intestino grueso. El intestino delgado se puede dividir a su vez en duodeno, yeyuno e íleon. Cada región anatómica del intestino tiene una función única que se refleja en las diferencias en la estructura celular. La investigación de los cambios en el intestino requiere un análisis en profundidad de las diferentes regiones de los tejidos y las alteraciones celulares. Para estudiar el intestino y visualizar grandes trozos de tejido, los investigadores suelen utilizar una técnica conocida como rollos suizos intestinales. En esta técnica, el intestino se divide en cada región anatómica y se fija en una orientación plana. Luego, el tejido se enrolla cuidadosamente y se procesa para su inclusión en parafina. La fijación y orientación adecuadas del tejido es una técnica de laboratorio que a menudo se pasa por alto, pero es de vital importancia para el análisis posterior. Además, el laminado inadecuado del tejido intestinal puede dañar el frágil epitelio intestinal, lo que conduce a una mala calidad del tejido para la inmunotinción. Asegurar un tejido bien fijado y orientado correctamente con estructuras celulares intactas es un paso crucial que garantiza una visualización óptima de las células intestinales. Presentamos un método rentable y sencillo para hacer panecillos suizos para incluir todas las secciones del intestino en un solo bloque incrustado en parafina. También describimos la tinción optimizada con inmunofluorescencia del tejido intestinal para estudiar diversos aspectos del epitelio intestinal. El siguiente protocolo proporciona a los investigadores una guía completa para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la técnica de rollo suizo y la inmunotinción. El empleo de estos enfoques refinados preserva la intrincada morfología del epitelio intestinal y fomenta una comprensión más profunda de la fisiología y la patobiología intestinales.

Introducción

La arquitectura celular del intestino plantea un desafío único para mantener su integridad estructural cuando el tejido intestinal se preserva para la inmunotinción. El intestino delgado está formado por estructuras alargadas en forma de dedos conocidas como vellosidades¹. Estas vellosidades a menudo se deforman durante los procesos de incrustación. Asegurarse de que los investigadores dispongan de técnicas para incrustar correctamente los intestinos con el fin de lograr secciones transversales, lo que permite la visualización de todas las regiones del intestino, así como de las capas que componen el intestino (es decir, la muscular propia, la ....

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur aprobó todo el cuidado, mantenimiento y tratamiento de los animales. Se recolectó tejido intestinal de ratones C57BL/6J adultos (machos y hembras de 3 a 5 meses de edad, con un peso aproximado de 30 g) para su uso en el presente estudio.

1. Fijación del tejido intestinal

1. Diseccione cuidadosamente todo el intestino de un ratón sacrificado y colóquelo en un bote de pesaje o en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Retire los intestinos del PBS y use unas tijeras para elim....

Discusión

Aquí, presentamos un método optimizado para la fijación de tejidos utilizando la técnica del rollo suizo para preservar la arquitectura intestinal y promover una inmunotinción precisa. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para investigar una amplia variedad de cuestiones de investigación relacionadas con la fisiología intestinal y la biología celular¹⁹. Se han publicado varios métodos de laminación suizos optimizados que son muy útiles^20,21.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638