Optimiertes Protokoll für intestinale Swiss Rolls und Immunfluoreszenzfärbung von in Paraffin eingebettetem Gewebe

Zusammenfassung

Der Darm ist wichtig für die Verdauung und Resorption. Jede Region - Duodenum, Jejunum, Ileum, Dickdarm - erfüllt aufgrund einzigartiger zellulärer Strukturen unterschiedliche Funktionen. Das Studium der Darmphysiologie erfordert eine sorgfältige Gewebeanalyse. Dieses Protokoll beschreibt die Gewebefixierung und -verarbeitung mit der Swiss-Roll-Technik, um eine genaue Immunfärbung durch die richtige Gewebekonservierung und -ausrichtung zu gewährleisten.

Zusammenfassung

Der Darm ist ein komplexes Organ, das sich aus dem Dünn- und dem Dickdarm zusammensetzt. Der Dünndarm kann weiter in Duodenum, Jejunum und Ileum unterteilt werden. Jede anatomische Region des Darms hat eine einzigartige Funktion, die sich in Unterschieden in der Zellstruktur widerspiegelt. Um Veränderungen im Darm zu untersuchen, bedarf es einer vertieften Analyse verschiedener Geweberegionen und zellulärer Veränderungen. Um den Darm zu untersuchen und große Gewebestücke sichtbar zu machen, verwenden Forscher häufig eine Technik, die als Darmrollen bekannt ist. Bei dieser Technik wird der Darm in jede anatomische Region unterteilt und in einer flachen Ausrichtung fixiert. Anschließend wird das Gewebe sorgfältig gerollt und für die Paraffineinbettung verarbeitet. Die richtige Fixierung und Ausrichtung des Gewebes ist eine oft übersehene Labortechnik, die jedoch für die nachgelagerte Analyse von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus kann ein unsachgemäßes Rollen des Darmgewebes das empfindliche Darmepithel schädigen, was zu einer schlechten Gewebequalität für die Immunfärbung führt. Die Sicherstellung eines gut fixierten und richtig ausgerichteten Gewebes mit intakten Zellstrukturen ist ein entscheidender Schritt, um eine optimale Visualisierung der Darmzellen zu gewährleisten. Wir stellen eine kostengünstige und einfache Methode zur Herstellung von Schweizer Rollen vor, bei der alle Teile des Darms in einem einzigen, in Paraffin eingebetteten Block enthalten sind. Wir beschreiben auch eine optimierte Immunfluoreszenzfärbung von Darmgewebe, um verschiedene Aspekte des Darmepithels zu untersuchen. Das folgende Protokoll bietet Forschern einen umfassenden Leitfaden zur Gewinnung hochwertiger Immunfluoreszenzbilder durch Fixierung des Darmgewebes, Swiss-Roll-Technik und Immunfärbung. Die Anwendung dieser verfeinerten Ansätze bewahrt die komplizierte Morphologie des Darmepithels und fördert ein tieferes Verständnis der Darmphysiologie und Pathobiologie.

Einleitung

Die zelluläre Architektur des Darms stellt eine einzigartige Herausforderung für die Aufrechterhaltung seiner strukturellen Integrität dar, wenn Darmgewebe für die Immunfärbung konserviert wird. Der Dünndarm besteht aus länglichen, fingerartigen Strukturen, die als Zotten¹ bekannt sind. Diese Zotten werden während der Einbettungsprozesse oft missgebildet. Für eine robuste experimentelle^{Analyse ist} es von entscheidender Bedeutung, sicherzustellen, dass die Forscher über Techniken zur korrekten Einbettung des Darms verfügen, um Querschnitte zu erzielen, die eine Visualisierung aller Regionen des Darms sowie der Schichten, ....

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigte die gesamte Pflege, Wartung und Behandlung von Tieren. Darmgewebe wurde von adulten C57BL/6J-Mäusen (Männchen und Weibchen im Alter von 3-5 Monaten, mit einem Gewicht von etwa 30 g) für die Verwendung in der vorliegenden Studie entnommen.

1. Fixierung des Darmgewebes

1. Präparieren Sie vorsichtig den gesamten Darm einer euthanasierten Maus und legen Sie ihn in ein Waagschen oder eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
2. Entferne den Darm aus dem PBS und entferne mit einer Schere s....

Diskussion

Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Gewebefixierung mit der Swiss-Roll-Technik vor, um die Darmarchitektur zu erhalten und eine genaue Immunfärbung zu fördern. Einmal gemeistert, kann diese Technik zur Untersuchung einer Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit der Darmphysiologie und Zellbiologie verwendet werden¹⁹. Mehrere optimierte Schweizer Walzverfahren wurden publiziert und sind sehr nützlich^20,21. Ein Vorteil d.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638