Оптимизированный протокол для кишечных булочек и иммунофлуоресцентного окрашивания тканей, залитых парафином

Резюме

Кишечник жизненно важен для пищеварения и всасывания. Каждый регион – двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, толстая кишка – выполняет различные функции благодаря уникальным клеточным структурам. Изучение физиологии кишечника требует тщательного анализа тканей. Этот протокол описывает фиксацию и обработку тканей с использованием швейцарского вала, обеспечивая точное иммуноокрашивание за счет правильного сохранения и ориентации тканей.

Аннотация

Кишечник – сложный орган, состоящий из тонкой и толстой кишки. Тонкую кишку можно разделить на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку. Каждая анатомическая область кишечника обладает уникальной функцией, которая отражается в различиях в клеточной структуре. Исследование изменений в кишечнике требует глубокого анализа различных областей тканей и клеточных изменений. Чтобы изучить кишечник и визуализировать большие куски ткани, исследователи обычно используют технику, известную как кишечные швейцарские булочки. При этой методике кишечник делится на каждую анатомическую область и фиксируется в плоской ориентации. Затем ткань аккуратно сворачивают в рулон и обрабатывают для заделки парафина. Правильная фиксация и ориентация тканей — это часто упускаемый из виду лабораторный метод, но он критически важен для последующего анализа. Кроме того, неправильное швейцарское скручивание кишечной ткани может повредить хрупкий эпителий кишечника, что приведет к ухудшению качества тканей для иммуноокрашивания. Обеспечение хорошо закрепленной и правильно ориентированной ткани с неповрежденными клеточными структурами является важным шагом, обеспечивающим оптимальную визуализацию клеток кишечника. Мы представляем экономичный и простой метод изготовления рулетов, включающий все отделы кишечника в один блок, залитый парафином. Мы также описываем оптимизированное иммунофлуоресцентное окрашивание кишечной ткани для изучения различных аспектов кишечного эпителия. Следующий протокол предоставляет исследователям исчерпывающее руководство по получению высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, метода Swiss-roll и иммуноокрашивания. Использование этих усовершенствованных подходов позволяет сохранить сложную морфологию кишечного эпителия и способствует более глубокому пониманию физиологии кишечника и патобиологии.

Введение

Клеточная архитектура кишечника представляет собой уникальную проблему в поддержании его структурной целостности, когда кишечная ткань сохраняется для иммуноокрашивания. Тонкая кишка состоит из удлиненных пальцевидных структур, известных как ворсинки¹. Эти ворсинки часто деформируются в процессе внедрения. Обеспечение того, чтобы исследователи располагали методами правильного встраивания кишечника для получения поперечных сечений, позволяющих визуализировать все области кишечника, а также слои, составляющие кишечник (т.е. собственную мышечную мышцу, слизистую оболочку и серозу), имеет решающее значение для надежного^{эксперимент....}

протокол

Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины одобрил весь уход, содержание и лечение животных. Кишечная ткань была собрана у взрослых мышей C57BL/6J (самцы и самки в возрасте 3-5 месяцев, массой около 30 г) для использования в настоящем исследовании.

1. Фиксация тканей кишечника

1. Осторожно извлеките весь кишечник усыпленной мыши и поместите его в весовую лодку или чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
2. Извлеките кишечник из ПБС и с помощью ножниц аккуратно удалите лишний жир и соединительную ткань. Разрезание соединительной тка....

Результаты

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) проводили, как описано ранее¹². Используя оптимизированный метод, кишечные швейцарские булочки включали в себя все три сегмента тонкой кишки и толстой кишки на одном слайде. Размещение всего кишечника на предметном стекле позволяет.......

Обсуждение

В этой статье мы представляем оптимизированный метод фиксации тканей с использованием швейцарского валка для сохранения архитектуры кишечника и обеспечения точного иммуноокрашивания. После освоения эта методика может быть использована для исследования широкого спектра исследоват?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638