JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Кишечник жизненно важен для пищеварения и всасывания. Каждый регион – двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, толстая кишка – выполняет различные функции благодаря уникальным клеточным структурам. Изучение физиологии кишечника требует тщательного анализа тканей. Этот протокол описывает фиксацию и обработку тканей с использованием швейцарского вала, обеспечивая точное иммуноокрашивание за счет правильного сохранения и ориентации тканей.

Аннотация

Кишечник – сложный орган, состоящий из тонкой и толстой кишки. Тонкую кишку можно разделить на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку. Каждая анатомическая область кишечника обладает уникальной функцией, которая отражается в различиях в клеточной структуре. Исследование изменений в кишечнике требует глубокого анализа различных областей тканей и клеточных изменений. Чтобы изучить кишечник и визуализировать большие куски ткани, исследователи обычно используют технику, известную как кишечные швейцарские булочки. При этой методике кишечник делится на каждую анатомическую область и фиксируется в плоской ориентации. Затем ткань аккуратно сворачивают в рулон и обрабатывают для заделки парафина. Правильная фиксация и ориентация тканей — это часто упускаемый из виду лабораторный метод, но он критически важен для последующего анализа. Кроме того, неправильное швейцарское скручивание кишечной ткани может повредить хрупкий эпителий кишечника, что приведет к ухудшению качества тканей для иммуноокрашивания. Обеспечение хорошо закрепленной и правильно ориентированной ткани с неповрежденными клеточными структурами является важным шагом, обеспечивающим оптимальную визуализацию клеток кишечника. Мы представляем экономичный и простой метод изготовления рулетов, включающий все отделы кишечника в один блок, залитый парафином. Мы также описываем оптимизированное иммунофлуоресцентное окрашивание кишечной ткани для изучения различных аспектов кишечного эпителия. Следующий протокол предоставляет исследователям исчерпывающее руководство по получению высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, метода Swiss-roll и иммуноокрашивания. Использование этих усовершенствованных подходов позволяет сохранить сложную морфологию кишечного эпителия и способствует более глубокому пониманию физиологии кишечника и патобиологии.

Введение

Клеточная архитектура кишечника представляет собой уникальную проблему в поддержании его структурной целостности, когда кишечная ткань сохраняется для иммуноокрашивания. Тонкая кишка состоит из удлиненных пальцевидных структур, известных как ворсинки1. Эти ворсинки часто деформируются в процессе внедрения. Обеспечение того, чтобы исследователи располагали методами правильного встраивания кишечника для получения поперечных сечений, позволяющих визуализировать все области кишечника, а также слои, составляющие кишечник (т.е. собственную мышечную мышцу, слизистую оболочку и серозу), имеет решающее значение для надежногоэкспериментального анализа. Недостаточная фиксация, чрезмерная фиксация и неправильное обращение с тканями нарушают целостность тканей, что приводит к непреднамеренному повреждению эпителия кишечника 3,4. Повреждение эпителия кишечника на этих этапах может значительно снизить качество последующих анализов, таких как иммунофлюоресценция, независимо от эффективности протоколов иммуногистохимии и используемых антител.

Иммуноокрашивание, как и правильная фиксация тканей, является важной частью биомедицинских исследований. При правильном подходе иммуноокрашивание может пролить свет на ранее неизвестные аспекты клеточной структуры и функции. Иммунофлуоресцентное окрашивание парафиновых срезов может быть затруднено из-за физико-химических изменений, возникающих в процессе фиксации и встраивания парафина5. Фиксация и встраивание парафина приводят к маскировке антигена, которая может препятствовать иммунофлуоресцентному детектированию эпитопов, представляющих интерес6. Отсроченная фиксация может индуцировать протеолитическую деградацию, что приводит к ослаблению или отсутствию окрашивания критических эпитопов7. Кроме того, антитела часто неточны и имеют высокий уровень фона. Протоколы иммуноокрашивания, которые способствуют последовательному и специфическому связыванию антител и высокому соотношению сигнал/шум, могут предоставить ценную информацию для исследователей.

Здесь мы предоставляем комплексный протокол, предназначенный для получения высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, подготовки швейцарского рулона8 и иммуноокрашивания. Подчеркивая рекомендации по сохранению целостности кишечника, протокол направлен на то, чтобы предоставить исследователям надежную методологию для повышения качества и надежности исследований иммунофлуоресцентной визуализации. Мы также стремились использовать экономически эффективные ресурсы, включая фильтровальную бумагу и самодельный забор антигенов, блокирующие растворы и разбавители антител, чтобы сделать протокол более доступным для лабораторий, которые могут иметь ограниченное финансирование. Как и в случае со всеми экспериментальными протоколами, исследователи должны оптимизировать текущий протокол, исходя из своего экспериментального подхода и областей интересов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины одобрил весь уход, содержание и лечение животных. Кишечная ткань была собрана у взрослых мышей C57BL/6J (самцы и самки в возрасте 3-5 месяцев, массой около 30 г) для использования в настоящем исследовании.

1. Фиксация тканей кишечника

  1. Осторожно извлеките весь кишечник усыпленной мыши и поместите его в весовую лодку или чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
  2. Извлеките кишечник из ПБС и с помощью ножниц аккуратно удалите лишний жир и соединительную ткань. Разрезание соединительной ткани помогает ткани лежать ровно на последующих этапах.
  3. Разделите кишечник на отдельные сегменты с помощью ножниц (т.е. двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку и толстую кишку). Разделите сегменты в зависимости от анатомических особенностей и/или длины, при этом примерно 13% длины кишечника приходится на двенадцатиперстную кишку, 58% - на тощую кишку, 8% - на подвздошную кишку, 6% - на слепую кишку, а на толстую кишку - 15%9. Двенадцатиперстная кишка следует за желудком, а подвздошная кишка — это конечный отдел тонкой кишки непосредственно перед слепой кишкой.
  4. Освободите толстую кишку, разрезав ножницами место ее соединения с слепой кишкой. Поместите двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку и толстую кишку в весовую лодку или чашку Петри PBS. Выбросьте слепую кишку или зафиксируйте ее по другим опубликованным способам10.
  5. Прикрепите наконечник для пипетки P200 к шприцу объемом 10 мл, отрезав большой конец наконечника лезвием бритвы. Наполните шприц PBS.
  6. Введите наконечник шприца в отверстие кишечного сегмента с помощью щипцов. С помощью щипцов удерживайте кишечный сегмент на шприце и осторожно промойте со скоростью ~50 мкл/с, чтобы удалить содержимое кишечника. Соберите содержимое кишечника в пустую лодку для взвешивания или чашку Петри.
  7. Положите влажный кишечный сегмент по прямой линии на полоску целлюлозной фильтровальной бумаги с сухой этикеткой (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что кишечный сегмент достаточно влажный, чтобы правильно прилипнуть к сухой фильтровальной бумаге. Пометьте фильтровальную бумагу с помощью карандаша информацией о количестве мыши, генотипе, экспериментальной группе и т.д.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ручки для маркировки фильтровальной бумаги может привести к потере этикеток во время фиксации.
  8. С помощью ножниц для рассечения кишечника разрежьте его в продольном направлении по брыжеечной линии. Режьте ~5 мм за раз, используя нижний край ножниц или пару щипцов, чтобы положить разрезанную ткань на фильтровальную бумагу. Продолжайте до тех пор, пока весь участок кишечника не будет разрезан и положен на фильтровальную бумагу. Позаботьтесь о том, чтобы разрезать кишечник как можно более прямой линией, так как так будет легче сворачивать ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага можно использовать ножницы с шариковым наконечником, чтобы избежать повреждения тканей.
  9. Положите еще один лист фильтровальной бумаги поверх кишечного сегмента. Убедитесь, что фильтровальная бумага облегает кишечный сегмент, предотвращая скручивание кишечника или потерю его уплощенной формы во время фиксации.
  10. Скрепите края фильтровальной бумаги, чтобы закрепить салфетку на месте. Не сшивайте салфетку. Наложите на салфетку достаточное количество скоб, чтобы она не отделилась от фильтровальной бумаги во время фиксации.
  11. Повторите шаги 1.5-1.10 для каждого из сегментов кишечника (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки и толстой кишки).
  12. Погрузите ткани в 10% нормального буферного формалина (или фиксатор по выбору, такой как 4% параформальдегид, фиксатор Карноя и т.д.) на ночь при 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что вы правильно носите средства индивидуальной защиты, так как фиксаторы, такие как формалин, токсичны.

2. Скручивание и обработка кишечной ткани

ВНИМАНИЕ: Выполняйте действия 2.1-2.6 в вентилируемой вытяжке.

  1. Аккуратно снимите верхний кусок фильтровальной бумаги (тот, который касается просветной стороны кишечника). С помощью щипцов осторожно отклейте кишечник от нижнего куска фильтровальной бумаги. Выбросьте фильтровальную бумагу.
  2. Заполните три весовые лодки PBS. Промойте салфетку в PBS 3x, чтобы удалить формалин из ткани.
  3. С помощью щипцов обратного действия (см. Таблицу материалов) возьмите кусочек кишечника по короткому краю просветной стороной вверх. Поверните щипцы, чтобы свернуть ткань. Используйте пару обычных щипцов, чтобы направлять ткань во время ее сворачивания. Если ткань сложилась, разверните ее и повторите попытку.
  4. Поместите салфетку в сухую лодку или чашку Петри. Удерживайте ткань на месте щипцами в одной руке. Осторожно раскройте щипцы обратного действия и освободите ткань, используя другие щипцы для вытеснения ткани из щипцов обратного действия.
  5. Вставьте в ткань рассекающий штифт размера 00 или мельчайший булавочный штифт (см. Таблицу материалов). С помощью кусачек удалите острый кончик булавки. Поместите салфетку в большую кассету, а затем поместите кассету в контейнер с 70% этанолом до готовности к обработке.
  6. Повторите шаги 2.1-2.5 со всеми сегментами кишечника (двенадцатиперстной кишкой, тощей кишкой, подвздошной кишкой и толстой кишкой), поместив все четыре рулона ткани в одну большую кассету (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что кассета промаркирована карандашом, чтобы предотвратить смывание этикетки в растворах этанола и ксилола (см. Таблицу материалов).
  7. После того, как все образцы будут свернуты, поместите образцы в тканевый процессор. Используйте следующие настройки для тканей кишечника: 70% этанол в течение 35 мин; 90% этанол в течение 35 мин; 95% этанол в течение 35 мин; 100% этанол в течение 35 мин, 3х; ксилол в течение 35 мин, 3х; парафин на 60 мин, 3х. Кассеты можно оставлять в расплавленном парафиновом воске на длительное время.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что вы носите надлежащее защитное снаряжение, так как ксилол является токсичным химическим веществом.

3. Встраивание тканей кишечника

  1. Разогрейте большие закладные формы, чтобы парафин расплавился.
  2. Извлеките кассеты из тканевого процессора и поместите их в стакан с расплавленным парафином.
  3. На станции заделки поместите небольшое количество парафина в форму. Достаньте четыре рулета из кассеты и поместите их все в одну форму, выложив как можно ровнее. Добавьте еще парафина, чтобы заполнить форму.
  4. Переместите форму на холодную плиту и убедитесь, что все швейцарские рулеты ровно лежат на дне формы. Поместите на форму крышку небольшой кассеты с маркировкой (см. Таблицу материалов) и при необходимости добавьте еще парафина.
  5. Как только воск застынет, извлеките блок из формы. Теперь ткань готова к разрезанию на срезы размером 5 мкм и размещению на заряженных стеклянных предметных стеклах для иммуноокрашивания11.

4. Адгезия тканей и подготовка предметного стекла

  1. Чтобы подготовленный срез парафиновой ткани толщиной 5 мкм прилегал к предметному стеклу, стекло нагревают на нагревателе предметного стекла или нагревательном блоке, установленном на 60 °C в течение 15-30 минут. Горки также можно оставить нагревать на более длительный срок; Этот шаг не зависит от времени.
  2. Дайте предметным стеклам остыть до комнатной температуры (~15 минут).

5. Депарафинизация

  1. Начав депарафинизацию предметных стекол, следите за тем, чтобы ткань оставалась в растворе и не пересыхала в течение всего курса иммуноокрашивания.
  2. Используйте штатив для слайдов (см. Таблицу материалов) для удержания стеклянных стекол и поместите их внутрь устойчивой к растворителям чашки (см. Таблицу материалов), заполненной реагентом для очистки/депарафинизации (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что реагент полностью покрывает ткань на каждом предметном стекле. Перед полным погружением предметных стекол в очищающий реагент несколько раз окуните или втолкните штатив для предметных стекол в раствор для очистки. Оставьте предметные стекла погруженными в воду на 10 минут или дольше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребоваться выполнить в вентилируемом вытяжном шкафу из-за опасных испарений, в зависимости от выбранного очищающего агента. Депарафинизация ткани на этом этапе не чувствительна ко времени, если используется нетоксичный очищающий агент.
  3. Снимите и перемешайте штатив для слайдов, чтобы удалить излишки очищающего реагента. В новой посуде, устойчивой к растворителям, повторите шаг 5.2.
  4. В новой посуде, устойчивой к растворителям, повторите шаг 5.3. Оставьте предметные стекла погруженными в воду на 15 минут или дольше. Этот шаг не зависит от времени.

6. Регидратация

  1. Снимите и перемешайте штатив для слайдов, чтобы удалить излишки очищающего реагента. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 100% этанолом, опустите или встряхните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени. Повторите 2 раза.
  2. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 100% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 95% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени. Повторите 1 раз.
  3. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 95% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 70% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
  4. Снимите и перемешайте решетку для слайдов, чтобы удалить излишки 70% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 50% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте предметные стекла погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
  5. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 50% этанола. В новую стойкую к растворителям чашку, наполненную деионизированной (DI) водой, опустите или встряхните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
    1. Чтобы сделать паузу, поместите предметные стекла в контейнер с PBS до тех пор, пока иммуноокрашивание не будет возобновлено после 5-минутного этапа регидратации воды.

7. Забор антигена

  1. Заполните новую устойчивую к растворителям чашку подходящим буфером для извлечения антигена. Непосредственно перенесите направляющую стойку в это решение. Убедитесь, что предметные стекла полностью погружены в раствор для извлечения антигена, полностью покрывая ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные решения для получения антигена могут варьироваться в зависимости от конкретного используемого антитела. Извлечение антигена, необходимое для отдельных антител, может потребоваться определить исследователю.
    1. Чтобы сделать 1x буфер для извлечения цитратного антигена, добавьте 2,94 г дигидрата цитрата натрия (см. Таблицу материалов) на 1 л деионизированной воды. После того, как дигидрат цитрата натрия растворится, добавьте хлористый водород (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока раствор не достигнет pH 6. Наконец, добавьте 500 μL Tween20 (см. Таблицу материалов) на 1 л деионизированной воды.
    2. Чтобы сделать 1x Tris-EDTA буфер для извлечения антигена, добавьте 1,211 г Tris Base и 0,292 г ЭДТА в 1 л деионизированной воды. После растворения отрегулируйте pH до 9.
  2. Накройте устойчивую к растворителям чашку, содержащую раствор для извлечения антигена, и горки крышкой и зафиксируйте крышку резинками.
  3. Поместите надежную устойчивую к растворителям тарелку в скороварку (см. Таблицу материалов) на металлическую решетку или подставку. Убедитесь, что в скороварке достаточно воды, чтобы она достигала металлической решетки или подставки, чтобы давление могло нарастать.
  4. Поставьте крышку на скороварку и поверните по часовой стрелке, чтобы зафиксировать крышку на месте. Поверните ограничительный клапан давления, который находится на крышке, в положение, установленное для давления.
  5. В настройках меню выберите «Высокое давление в скороварке», затем в параметре «Время» установите скороварку на 30 мин. Выберите «Пуск».
  6. Через 30 минут скороварка издаст звуковой сигнал и автоматически перейдет на режим поддержания тепла. Подождите, пока давление не ослабнет естественным образом и крышка свободно открутится.
  7. Используйте термостойкие перчатки (см. Таблицу материалов), чтобы снять устойчивую к растворителям посуду из скороварки и снять резинку и крышку. Поместите блюдо на ледяную баню на ~30 минут, чтобы горки остыли до комнатной температуры. Этот шаг не зависит от времени.
  8. После охлаждения до комнатной температуры снимите решетку для слайдов с устойчивой к растворителям чашки и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную деионизированной водой, чтобы удалить остаточный раствор для извлечения антигена. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду.
  9. Извлеките решетку для слайдов из деионизированной воды и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную PBS, на 5 минут. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду. Этот шаг не зависит от времени.

8. Блокировка неспецифических фоновых окрашиваний

  1. Подготовьте увлажненную камеру, взяв большую задвижку и сняв картонную крышку, прилипшую к крышке. У основания слайд-бокса положите влажные бумажные полотенца вертикально вниз. Убедитесь, что влажные бумажные полотенца лежат ровно.
  2. Снимайте слайды по одному с решетки для слайдов, погруженной в PBS. Тщательно сотрите излишки PBS на предметном стекле, избегая салфетки.
  3. С помощью гидрофобной ручки (см. Таблицу материалов) сформируйте барьер, который окружает ткань, нарисовав коробку вокруг ткани с помощью гидрофобной ручки. Будьте осторожны, избегайте ткани и не используйте гидрофобную ручку слишком близко к ткани.
  4. Положите намеченную горку горизонтально на влажные бумажные полотенца. Добавьте блокирующий буфер, чтобы покрыть ткань (~100 μл).
    1. Чтобы сделать блокирующий буфер, добавьте 100 мкл холодноводного желатина рыбьей кожи (Teleostein Gelatin; см. Таблицу материалов) в 9,85 мл PBS. Наконец, добавьте 50 мкл 20% Triton X-100 (см. Таблицу материалов) и перемешайте до полного растворения.
  5. Повторите шаги 8.2-8.4 для каждого слайда. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 90 минут.

9. Блокировка мышкой

  1. При использовании первичного мышиного антитела для иммуноокрашивания тканей мыши выполните дополнительный этап блокирования. реагенты-блокаторы «мышь на мыши» (блок «мышь на мыши»; см. Таблицу материалов) имеются в продаже; Следуйте рекламной инструкции при подготовке блока «мышь на мыши».
  2. Аккуратно постучите по блокирующему раствору и сразу же добавьте подготовленный блок мыши-на-мыши, чтобы покрыть ткань (~100 μл). Повторите то же самое для каждого предметного стекла, содержащего мышиную ткань, которая будет окрашена с помощью первичного антитела, выращенного у мышей.
  3. Срезы тканей инкубировать в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 15 минут.
  4. Извлеките предметные стекла из увлажненной камеры и поместите их непосредственно в решетку для слайдов, погруженную в PBS. Оставьте слайды в PBS на 5 минут, чтобы смыть блок мыши-на-мыши.

10. Первичные антитела

  1. Для каждого слайда выберите первичные антитела, которые вырабатываются у разных видов. Разведите первичные антитела в разбавителе антител в соответствии с инструкцией производителя. Использовали следующие первичные антитела: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATENIN (1:200) и LAMP1 (1:50).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если производитель не предоставляет рекомендуемых разведений, разведение 1:100 является хорошей отправной точкой. Если первичное антитело, представляющее интерес, конъюгировано с флуорофором, см. шаг 12.2.
    1. Чтобы сделать антитело разбавителем, добавьте блокирующий буфер 1:20 в PBS, если используется описанный выше буфер, блокирующий рыбий желатин.
  2. Извлеките предметные стекла из PBS или из увлажненной камеры, аккуратно постучите излишки блокирующего раствора или PBS и поместите их горизонтально обратно в увлажненную камеру. Убедитесь, что барьер, созданный с помощью гидрофобной ручки на шаге 8.3, остается; При необходимости еще раз наметьте ткань.
  3. Добавьте соответствующим образом разведенные первичные антитела, представляющие интерес, чтобы покрыть ткань (~100 μL).
  4. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла на ровной поверхности при температуре 4 °C в темноте на ночь.

11. Мытье горок

  1. Извлеките предметные стекла из увлажненной камеры, аккуратно постучите по первичным антителам и поместите предметные стекла в решетку для предметных стекол, погруженную в PBS, на 5 минут.
  2. Снимите решетку и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную PBS, на 5 минут. Повторите шаг 1 раза.

12. Вторичное окрашивание антител и ядер

  1. Для каждого слайда выберите флуорофоры вторичных антител, предназначенные для связывания с первичными формами антител. Разведите флуорофоры вторичных антител или конъюгированные первичные антитела в разбавитель вторичных антител. В качестве вторичных антител использовались donkey anti-goat 488 (1:200), donkey anti-rabbit cy3 (1:200), donkey anti-mouse 647 (1:200), donkey anti-rabbit 647 (1:200) и donkey anti-rat cy3 (1:200). Первичное антитело γ-ACTIN, конъюгированное с флуорофором 647, использовали в разведении 1:100.
    1. Чтобы получить вторичный разбавитель антител, добавьте блокирующий буфер 1:100 в PBS, если вы используете буфер, блокирующий рыбий желатин, как описано выше.
  2. Снимите предметные стекла с PBS, аккуратно постучите по излишкам PBS и поместите их горизонтально обратно во увлажненную камеру. Убедитесь, что барьер, созданный с помощью гидрофобной ручки на шаге 8.3, остается; При необходимости еще раз наметьте ткань.
  3. Добавьте соответствующим образом разведенные флуорофоры вторичных антител или конъюгированные первичные антитела, представляющие интерес, для покрытия ткани (~100 мкл).
  4. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч.
  5. Разведите 10 мг/мл Hoechst (см. Таблицу материалов) или DAPI с использованием PBS до конечной концентрации 1 мкг/мл Hoechst или DAPI с использованием PBS и добавьте непосредственно в ткань (~100 μл). Выдерживать 5 минут при комнатной температуре в темноте.
  6. Выньте предметные стекла из увлажненной камеры и поместите их в решетку для слайдов, которая погружается в PBS на 5 минут в темноте.
  7. Снимите решетку и поместите в новую устойчивую к растворителям посуду, наполненную PBS, на 5 минут в темноте. Повторите шаг 1 раза.

13. Монтаж и подготовка к микроскопии

  1. Извлекайте по одному слайду за раз из штатива для слайдов, погруженного в PBS, сохраняя оставшиеся слайды погруженными в PBS в темноте. Аккуратно постучите излишки PBS и, при необходимости, используйте безворсовую салфетку, чтобы осторожно стереть излишки PBS со стекла, избегая салфетки.
  2. Добавьте одну-две капли монтажного средства с защитой от выцветания (см. Таблицу материалов) в центр ткани.
  3. Держите чистый покровный стекло (см. Таблицу материалов ) за края и медленно опустите его на предметное стекло под углом 45°. Убедитесь, что монтажная среда равномерно распределена по ткани.
  4. Начиная с центра ткани, осторожно надавите на покровный лист двумя пальцами, чтобы удалить пузырьки воздуха и излишки монтажной среды. При необходимости продолжайте надавливать по направлению к краям и поддерживайте мягкое давление на протяжении всего движения.
  5. Отрежьте маленький конец нефильтрованной пипетки P200 и прикрепите его к кончику серологической пипетки, подключенной к вакууму.
  6. Следуя за краями покровного стекла, используйте пылесос, чтобы удалить излишки монтажной среды.
  7. В новой коробке слайдов горизонтально положите предметное стекло и дайте ему высохнуть в темноте при комнатной температуре.
  8. Повторите этот процесс для каждого слайда.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) проводили, как описано ранее12. Используя оптимизированный метод, кишечные швейцарские булочки включали в себя все три сегмента тонкой кишки и толстой кишки на одном слайде. Размещение всего кишечника на предметном стекле позволяет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы представляем оптимизированный метод фиксации тканей с использованием швейцарского валка для сохранения архитектуры кишечника и обеспечения точного иммуноокрашивания. После освоения эта методика может быть использована для исследования широкого спектра исследоват?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) K01 DK121869 для ACE, а эта публикация была частично поддержана T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) и грантами HCS Cornerstone для SAD & RS. Эта работа была поддержана стартовыми фондами от Медицинского университета Южной Каролины (MUSC) до ACE и была поддержана Центром исследований заболеваний пищеварительной системы MUSC (P30 DK123704) и COBRE в области заболеваний пищеварительной системы и печени (P20 GM120475). Визуализация была выполнена с использованием ядра клеточной и молекулярной визуализации в MUSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
β-CATENINGeneTexGTX101435
Cellulose filter paperCytiva10427804Thick Whatman paper
Charged glass slidesThermo Fisher Scientific23888114
CoverslipEpredia152440
Dissecting pins size 00PhusisB082DH4TZF
E-CADHERINR&D SystemsAF748
Freezer glovesTempshieldUX-09113-02
Heating blockPremiereXH-2001Slide Warmer
Histo-Clear IIElectron Microscopy Sciences64111-04Clearing reagent
HoeschtThermo Fisher Scientific62249
Hydrochloric AcidSigma Aldrich320331
Hydrophobic penMillipore402176
LAMININGeneTexGTX27463
LAMP1Santa CruzSC-19992
Large cassettesTissue-Tek4173
Minutien pinsFine Science ToolsNC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213Mouse-on-mouse block
MUC2GeneTexGTX100664
PCNACell Signaling Technology2586S
Pressure CookerCuisinartB000MPA044
ProLong gold antifadeThermo Fisher ScientificP36934Mounting medium
Reverse action forcepsDumont5748
Slide RackTissue-Tek62543-06
Slide Staining SetTissue-Tek62540-01Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettesFisherbrand15-200-403B
Sodium citrate dihydrateFisher BioreagentsBP327-1
Teleostein GelatinSigmaG7765Blocking buffer
Triton X-100Thermo Fisher ScientificA16046
Tween 20Thermo Fisher ScientificJ20605-AP
WipesKimTech34155
XylenesFisher Chemical1330-20-7
γ-ACTINSanta CruzSC-65638

Ссылки

  1. Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
  2. Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , Springer US. New York, NY. (2021).
  3. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
  4. Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
  5. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  6. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
  7. Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
  8. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  9. Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
  10. Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).
  11. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288(2018).
  12. Feldman, A. T., Wolfe, D. Histopathology: Methods and protocols. , Springer New York. New York, NY. (2014).
  13. Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883(2023).
  14. Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
  15. Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).
  16. Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
  17. Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747(2021).
  18. Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).
  19. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652(2010).
  20. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  21. Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630(2022).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).
  23. Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  24. Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
  25. Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
  26. Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).
  27. Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
  28. Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
  29. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
  30. Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  31. Bolognesi, M. aO., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены