Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Кишечник жизненно важен для пищеварения и всасывания. Каждый регион – двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, толстая кишка – выполняет различные функции благодаря уникальным клеточным структурам. Изучение физиологии кишечника требует тщательного анализа тканей. Этот протокол описывает фиксацию и обработку тканей с использованием швейцарского вала, обеспечивая точное иммуноокрашивание за счет правильного сохранения и ориентации тканей.

Аннотация

Кишечник – сложный орган, состоящий из тонкой и толстой кишки. Тонкую кишку можно разделить на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку. Каждая анатомическая область кишечника обладает уникальной функцией, которая отражается в различиях в клеточной структуре. Исследование изменений в кишечнике требует глубокого анализа различных областей тканей и клеточных изменений. Чтобы изучить кишечник и визуализировать большие куски ткани, исследователи обычно используют технику, известную как кишечные швейцарские булочки. При этой методике кишечник делится на каждую анатомическую область и фиксируется в плоской ориентации. Затем ткань аккуратно сворачивают в рулон и обрабатывают для заделки парафина. Правильная фиксация и ориентация тканей — это часто упускаемый из виду лабораторный метод, но он критически важен для последующего анализа. Кроме того, неправильное швейцарское скручивание кишечной ткани может повредить хрупкий эпителий кишечника, что приведет к ухудшению качества тканей для иммуноокрашивания. Обеспечение хорошо закрепленной и правильно ориентированной ткани с неповрежденными клеточными структурами является важным шагом, обеспечивающим оптимальную визуализацию клеток кишечника. Мы представляем экономичный и простой метод изготовления рулетов, включающий все отделы кишечника в один блок, залитый парафином. Мы также описываем оптимизированное иммунофлуоресцентное окрашивание кишечной ткани для изучения различных аспектов кишечного эпителия. Следующий протокол предоставляет исследователям исчерпывающее руководство по получению высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, метода Swiss-roll и иммуноокрашивания. Использование этих усовершенствованных подходов позволяет сохранить сложную морфологию кишечного эпителия и способствует более глубокому пониманию физиологии кишечника и патобиологии.

Введение

Клеточная архитектура кишечника представляет собой уникальную проблему в поддержании его структурной целостности, когда кишечная ткань сохраняется для иммуноокрашивания. Тонкая кишка состоит из удлиненных пальцевидных структур, известных как ворсинки1. Эти ворсинки часто деформируются в процессе внедрения. Обеспечение того, чтобы исследователи располагали методами правильного встраивания кишечника для получения поперечных сечений, позволяющих визуализировать все области кишечника, а также слои, составляющие кишечник (т.е. собственную мышечную мышцу, слизистую оболочку и серозу), имеет решающее значение для надежногоэксперимент....

протокол

Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины одобрил весь уход, содержание и лечение животных. Кишечная ткань была собрана у взрослых мышей C57BL/6J (самцы и самки в возрасте 3-5 месяцев, массой около 30 г) для использования в настоящем исследовании.

1. Фиксация тканей кишечника

  1. Осторожно извлеките весь кишечник усыпленной мыши и поместите его в весовую лодку или чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
  2. Извлеките кишечник из ПБС и с помощью ножниц аккуратно удалите лишний жир и соединительную ткань. Разрезание соединительной тка....

Результаты

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) проводили, как описано ранее12. Используя оптимизированный метод, кишечные швейцарские булочки включали в себя все три сегмента тонкой кишки и толстой кишки на одном слайде. Размещение всего кишечника на предметном стекле позволяет.......

Обсуждение

В этой статье мы представляем оптимизированный метод фиксации тканей с использованием швейцарского валка для сохранения архитектуры кишечника и обеспечения точного иммуноокрашивания. После освоения эта методика может быть использована для исследования широкого спектра исследоват?.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) K01 DK121869 для ACE, а эта публикация была частично поддержана T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) и грантами HCS Cornerstone для SAD & RS. Эта работа была поддержана стартовыми фондами от Медицинского университета Южной Каролины (MUSC) до ACE и была поддержана Центром исследований заболеваний пищеварительной системы MUSC (P30 DK123704) и COBRE в области заболеваний пищеварительной системы и печени (P20 GM120475). Визуализация была выполнена с использованием ядра клеточной и молекулярной визуализации в MUSC.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
β-CATENINGeneTexGTX101435
Cellulose filter paperCytiva10427804Thick Whatman paper
Charged glass slidesThermo Fisher Scientific23888114
CoverslipEpredia152440
Dissecting pins size 00PhusisB082DH4TZF
E-CADHERINR&D SystemsAF748
Freezer glovesTempshieldUX-09113-02
Heating blockPremiereXH-2001Slide Warmer
Histo-Clear IIElectron Microscopy Sciences64111-04Clearing reagent
HoeschtThermo Fisher Scientific62249
Hydrochloric AcidSigma Aldrich320331
Hydrophobic penMillipore402176
LAMININGeneTexGTX27463
LAMP1Santa CruzSC-19992
Large cassettesTissue-Tek4173
Minutien pinsFine Science ToolsNC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213Mouse-on-mouse block
MUC2GeneTexGTX100664
PCNACell Signaling Technology2586S
Pressure CookerCuisinartB000MPA044
ProLong gold antifadeThermo Fisher ScientificP36934Mounting medium
Reverse action forcepsDumont5748
Slide RackTissue-Tek62543-06
Slide Staining SetTissue-Tek62540-01Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettesFisherbrand15-200-403B
Sodium citrate dihydrateFisher BioreagentsBP327-1
Teleostein GelatinSigmaG7765Blocking buffer
Triton X-100Thermo Fisher ScientificA16046
Tween 20Thermo Fisher ScientificJ20605-AP
WipesKimTech34155
XylenesFisher Chemical1330-20-7
γ-ACTINSanta CruzSC-65638

Ссылки

  1. Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
  2. Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены