用于肠瑞士卷和石蜡包埋组织的免疫荧光染色的优化方案

摘要

肠道对消化和吸收至关重要。由于独特的细胞结构，每个区域（十二指肠、空肠、回肠、结肠）都发挥着不同的功能。研究肠道生理学需要细致的组织分析。该方案概述了使用 Swiss roll 技术进行组织固定和处理，通过适当的组织保存和定位确保准确的免疫染色。

摘要

肠道是一个复杂的器官，由小肠和大肠组成。小肠可进一步分为十二指肠、空肠和回肠。肠道的每个解剖区域都有独特的功能，这反映在细胞结构的差异上。研究肠道的变化需要对不同的组织区域和细胞改变进行深入分析。为了研究肠道并观察大块组织，研究人员通常使用一种称为肠道瑞士卷的技术。在这种技术中，肠道被分成每个解剖区域并固定在平坦的方向上。然后，小心地卷起组织并处理石蜡包埋。正确的组织固定和定向是一种经常被忽视的实验室技术，但对于下游分析至关重要。此外，肠道组织不适当的瑞士滚动会损害脆弱的肠上皮，导致免疫染色组织质量差。确保组织固定良好且方向正确、细胞结构完整是确保肠道细胞最佳可视化的关键步骤。我们提出了一种经济高效且简单的方法来制作瑞士卷，将肠道的所有部分包含在一个石蜡包埋块中。我们还描述了肠道组织的优化免疫荧光染色，以研究肠上皮的各个方面。以下方案为研究人员提供了通过肠道组织固定、Swiss-roll 技术和免疫染色获得高质量免疫荧光图像的综合指南。采用这些精细的方法可以保留肠上皮的复杂形态，并促进对肠道生理学和病理生物学的更深入理解。

引言

当肠道组织被保存以进行免疫染色时，肠道的细胞结构在维持其结构完整性方面构成了独特的挑战。小肠由细长的指状结构组成，称为绒毛¹。这些绒毛在包埋过程中经常变形。确保研究人员拥有正确嵌入肠道以获得横截面的技术，允许可视化肠道的所有区域以及构成肠道的各层（即固有肌层、粘膜和浆膜），对于稳健的实验分析至关重要²。固定不充分、过度固定和组织处理不当会损害组织完整性，导致对肠上皮的意外损伤 ^3,4。在这些步骤中损伤肠上皮会显着降低后续分析的质量，例如免疫荧光，无论免疫组化方案和所采用的抗体的功效如何。

免疫染色与适当的组织固定一样，是生物医学研究的重要组成部分。如果操作得当，免疫染色可以阐明细胞结构和功能以前未知的方面。由于固定和石蜡包埋过程导致的物理化学修饰，石蜡切片的免疫荧光染色可能具有挑战性⁵。固定和石蜡包埋导致抗原掩蔽，这会干扰目标表位的免疫荧光检测⁶。延迟固定可诱导蛋白水解降解，从而导致关键表位染色减弱或缺失⁷。此外，抗体通常不准确，背景水平高。促进一致和特异性抗体结合以及高信噪比的免疫染色方案可以为研究人员提供有价值的信息。

在这里，我们提供了一个全面的方案，旨在通过肠道组织固定、瑞士卷制备⁸ 和免疫染色获得高质量的免疫荧光图像。该方案强调保护肠道完整性的指南，旨在为研究人员提供一种强大的方法，以提高免疫荧光成像研究的质量和可靠性。我们还寻求使用具有成本效益的资源，包括滤纸和自制抗原修复、封闭溶液和抗体稀释剂，以使可能资金有限的实验室更容易获得该方案。对于所有实验方案，研究人员应根据其实验方法和感兴趣的领域优化当前方案。

研究方案

南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会批准了所有动物护理、维护和治疗。收集成年 C57BL/6J 小鼠 （雄性和雌性 3-5 个月大，体重约 30 g） 的肠道组织用于本研究。

1. 肠道组织固定

1. 小心地从安乐死的小鼠中解剖出整个肠道，并将其放入含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的称重船或培养皿中。
2. 从 PBS 中取出肠道，用剪刀轻轻去除多余的脂肪和结缔组织。切割结缔组织有助于组织在后续步骤中平放。
3. 用剪刀将肠道分成单独的段（即十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）。根据解剖特征和/或长度划分节段，肠道长度的大约 13% 是十二指肠，58% 是空肠，8% 是回肠，6% 是盲肠，结肠是 15%⁹。十二指肠沿着胃，回肠是盲肠之前的小肠末端部分。
4. 用剪刀剪开结肠与盲肠的连接处，以释放结肠。将十二指肠、空肠、回肠和结肠放入 PBS 的称重船或培养皿中。丢弃盲肠或根据其他已公布的方法固定¹⁰.
5. 用剃须刀片切掉 P200 移液器吸头的大端，将 P200 移液器吸头连接到 10 mL 注射器上。用 PBS 填充注射器。
6. 使用镊子将注射器尖端插入肠段的开口。使用镊子将肠段固定在注射器上，并以 ~50 μL/s 的速率轻轻冲洗以去除肠道内容物。将肠内容物收集到空的称重船或培养皿中。
7. 将湿肠段沿一条直线铺在一条干贴的纤维素滤纸上（参见 材料表）。确保肠段足够湿润，以正确粘附在干燥的滤纸上。用铅笔用小鼠编号、基因型、实验组等信息标记滤纸。
   注意：使用笔标记滤纸可能会导致固定过程中标签丢失。
8. 使用解剖剪刀沿肠系膜线纵向切开肠道。一次剪 ~5 毫米，使用剪刀的底部边缘或一把镊子将切割的组织平放在滤纸上。继续直到切开整个肠段并平放在滤纸上。注意将肠道切成尽可能一条直线，因为这样更容易滚动组织。
   注意：在此步骤中可以使用球形剪刀，以避免组织损伤。
9. 将另一张滤纸放在肠段顶部。确保滤纸夹在肠段之间，防止肠在固定过程中卷曲或失去扁平的形状。
10. 钉住滤纸的边缘以将组织固定到位。不要装订纸巾。在纸巾周围放置足够的订书钉，以防止纸巾在固定时从滤纸上脱落。
11. 对每个肠段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）重复步骤 1.5-1.10。
12. 将组织浸入 10% 正常缓冲福尔马林（或选择的固定剂，如 4% 多聚甲醛、Carnoy 固定剂等）中，在 4 °C 下过夜。
    注意：确保佩戴正确的个人防护装备，因为福尔马林等固定剂有毒。

2. 肠组织滚动和加工

注意： 在通风罩中执行步骤 2.1-2.6。

1. 轻轻去除最上面的滤纸（接触肠道管腔侧的那张）。使用镊子小心地将肠子从滤纸的底部剥落。丢弃滤纸。
2. 用 PBS 填充三个称重船。在 PBS 3x 中洗涤组织以从组织中去除福尔马林。
3. 使用反向作用镊子（见 材料表），沿短边缘夹起一块肠子，管腔侧朝上。转动镊子滚动组织。使用一对普通镊子帮助引导滚动组织。如果纸巾折叠，请展开它并重试。
4. 将组织放入干重舟或培养皿中。用一只手用镊子将组织固定到位。小心地打开反向作用镊子并释放组织，使用其他镊子将组织从反向作用镊子中移出。
5. 将 00 号解剖针或小针插入组织中（见 材料表）。使用剪线钳去除销钉的锋利尖端。将组织放入一个大包埋盒中，然后将包埋盒放入装有 70% 乙醇的容器中，直到准备好处理。
6. 对所有肠段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）重复步骤 2.1-2.5，将所有四个组织卷放入同一个大盒中（参见 材料表）。确保用铅笔标记包埋盒，以防止标签在乙醇和二甲苯（参见 材料表）溶液中被洗掉。
7. 所有样品均已滚动完毕，将样品放入组织脱水机中。对肠组织使用以下设置：70% 乙醇 35 分钟;90% 乙醇 35 分钟;95% 乙醇 35 分钟;100% 乙醇 35 分钟，3 次;二甲苯 35 分钟，3 次;石蜡 60 分钟，3 倍。包埋盒可以在熔化的石蜡中长时间放置。
   注意：确保穿戴适当的防护装备，因为二甲苯是一种有毒化学物质。

3. 包埋肠道组织

1. 预热大型包埋模具以保持石蜡熔化。
2. 从组织处理器中取出包埋盒，并将其放入装有熔化石蜡的烧杯中。
3. 在包埋站，将少量石蜡放入模具中。从盒中取出四个瑞士卷，将它们全部放入一个模具中，尽可能平放。添加更多石蜡以填充模具。
4. 将模具移至冷板上，并确保所有瑞士卷都平放在模具底部。将标记的小包埋盒顶部（参见 材料表）放在模具上，并根据需要添加更多石蜡。
5. 蜡凝固后，从模具中取出块。组织现在可以切割成 5 μm 切片，并漂浮在带电的载玻片上进行免疫染色¹¹。

4. 组织粘附和玻片制备

1. 为确保制备的 5 μm 石蜡组织切片粘附在载玻片上，在载玻片加热器或设置为 60 °C 的加热块上加热载玻片 15-30 分钟。玻片也可以加热更长时间;此步骤对时间不敏感。
2. 让玻片冷却至室温（~15 分钟）。

5. 脱蜡

1. 在开始对载玻片进行脱蜡时，确保组织保持在溶液中，并且在整个免疫染色过程中不会变干。
2. 使用载玻片架（参见 材料表）固定载玻片，并将它们放入装有透明化/脱蜡试剂的耐溶剂培养皿（参见 材料表）中（参见 材料表）。确保试剂完全覆盖每张载玻片上的组织。在将玻片完全浸入透明试剂中之前，将玻片架浸入或推挤透明溶液中数次。将玻片浸没 10 分钟或更长时间。
   注意：由于存在有害烟雾，此步骤可能需要在通风罩中进行，具体取决于所选的清除剂。如果使用无毒的透明化剂，则此步骤中的组织脱蜡对时间不敏感。
3. 取出并搅拌载玻片架以去除多余的透明化试剂。在新的耐溶剂培养皿中，重复步骤 5.2。
4. 在新的耐溶剂培养皿中，重复步骤 5.3。将玻片浸没 15 分钟或更长时间。此步骤对时间不敏感。

6. 补水

1. 取出并搅拌载玻片架以去除多余的透明化试剂。在装满 100% 乙醇的新耐溶剂培养皿中，将载玻片架浸入或推挤数次，然后将载玻片浸没 5 分钟。此步骤对时间敏感。重复 2 次。
2. 取出并搅拌载玻片架以去除过量的 100% 乙醇。在装满 95% 乙醇的新耐溶剂培养皿中，将载玻片架浸入或推挤数次，然后将载玻片浸没 5 分钟。此步骤对时间敏感。重复 1 次。
3. 取出并搅拌载玻片架以去除过量的 95% 乙醇。在装满 70% 乙醇的新耐溶剂培养皿中，将载玻片架浸入或推挤数次，然后将载玻片浸没 5 分钟。此步骤对时间敏感。
4. 取出并搅拌载玻片架以去除过量的 70% 乙醇。在装满 50% 乙醇的新耐溶剂培养皿中，将载玻片架浸入或推挤数次，然后将载玻片浸没 5 分钟。此步骤对时间敏感。
5. 取出并搅拌载玻片架以去除过量的 50% 乙醇。在装满去离子 （DI） 水的新耐溶剂培养皿中，将载玻片架浸入或推挤数次，然后将载玻片浸没 5 分钟。此步骤对时间敏感。
   1. 要在此处暂停，请将载玻片放入装有 PBS 的容器中，直到 5 分钟水再水化步骤后可以恢复免疫染色。

7. 抗原修复

1. 用适当的抗原修复缓冲液填充新的耐溶剂培养皿。将玻片架直接转移到此溶液中。确保载玻片完全浸没在抗原修复溶液中，完全覆盖组织。
   注：最佳抗原修复溶液可能因所使用的特定抗体而异。单个抗体所需的抗原修复可能需要由研究人员确定。
   1. 要制备 1x 柠檬酸盐抗原修复缓冲液，每 1 L 去离子水加入 2.94 g 柠檬酸钠二水合物（参见 材料表）。柠檬酸钠二水合物溶解后，加入氯化氢（参见 材料表），直至溶液达到 pH 值 6。最后，每 1 L 去离子水添加 500 μL Tween20（参见 材料表）。
   2. 要制备 1x Tris-EDTA 抗原修复缓冲液，请在 1 L 去离子水中加入 1.211 g Tris 碱和 0.292 g EDTA。溶解后，调节至 pH 值 9。
2. 盖上装有抗原修复溶液的耐溶剂培养皿，并用盖子滑行，并用橡皮筋固定盖子。
3. 将安全的耐溶剂培养皿放入金属架或三脚架顶部的压力锅中（参见 材料表）。确保压力锅中有足够的水到达金属架或三脚架，以便压力增加。
4. 将盖子放在压力锅上并顺时针旋转以将盖子锁定到位。将盖子上的限压阀扭至压力设置。
5. 在菜单设置下，选择高压锅上的高压，然后在时间设置下，将高压锅设置为 30 分钟。选择开始。
6. 30 分钟后，压力锅会发出哔哔声并自动设置为保温设置。等到压力自然释放并且盖子自由拧开。
7. 使用耐热手套（参见 材料表）从压力锅中取出耐溶剂盘，并取下橡皮筋和盖子。将培养皿放入冰浴中 ~30 分钟，让载玻片冷却至室温。此步骤对时间不敏感。
8. 冷却至室温后，从耐溶剂培养皿中取出载玻片架，并将其放入装满去离子水的新耐溶剂培养皿中，以去除残留的抗原修复溶液。确保载玻片完全浸没。
9. 从去离子水中取出载玻片架，并将其放入装满 PBS 的新耐溶剂培养皿中 5 分钟。确保载玻片完全浸没。此步骤对时间不敏感。

8. 阻断非特异性背景染色

1. 取一个大滑盒并取下粘在盖子上的纸板盖，准备一个加湿室。在载玻片盒的底部，将湿纸巾垂直向下放置。确保湿纸巾平放。
2. 从浸没在 PBS 中的载玻片架上一次取出一张载玻片。小心擦去载玻片上多余的 PBS，避开组织。
3. 使用疏水笔（参见 材料表），通过用疏水笔在组织周围画一个框来形成一个围绕组织的屏障。小心避开组织，不要将疏水笔使用得太靠近组织。
4. 将勾勒出的载玻片水平放在湿纸巾上。添加封闭缓冲液以覆盖组织 （~100 μL）。
   1. 要制备封闭缓冲液，将 100 μL 冷水鱼皮明胶（Teleostein 明胶;参见 材料表）添加到 9.85 mL PBS 中。最后，加入 50 μL 20% Triton X-100（参见 材料表）并混合直至溶解。
5. 对每张幻灯片重复步骤 8.2-8.4。关闭加湿室，在室温下孵育载玻片 90 分钟。

9. 鼠标对鼠标阻止

1. 当使用小鼠一抗对小鼠组织进行免疫染色时，请执行额外的封闭步骤。小鼠对小鼠封闭试剂（小鼠对小鼠封闭剂;参见 材料表）已上市销售;在准备 mouse-on-mouse 块时，请遵循商业说明。
2. 轻轻拍掉封闭溶液，并立即添加准备好的 mouse-on-mouse 块以覆盖组织 （~100 μL）。对包含小鼠组织的每张载玻片重复此操作，将使用在小鼠中产生的一抗对其进行染色。
3. 在室温下将组织切片在加湿室盒中孵育 15 分钟。
4. 从加湿室中取出载玻片，将它们直接放入浸没在 PBS 中的载玻片架中。将玻片在 PBS 中放置 5 分钟以洗掉鼠标对鼠标块。

10. 一抗

1. 对于每张玻片，选择在不同物种中产生的目标一抗。按照制造商的说明，在抗体稀释剂中稀释一抗。使用以下一抗：E-钙粘蛋白 （1：100）、MUC2 （1：200）、PCNA （1：500）、层粘连蛋白 （1：200）、β-连环蛋白 （1：200） 和 LAMP1 （1：50）。
   注意：如果制造商未提供推荐的稀释度，则 1：100 稀释是一个很好的起点。如果目标一抗与荧光基团偶联，请参见步骤 12.2。
   1. 要使用上述鱼明胶封闭缓冲液，则要制备抗体稀释剂，请向 PBS 中加入 1：20 的封闭缓冲液。
2. 从 PBS 或加湿室中取出载玻片，轻轻敲掉多余的封闭溶液或 PBS，然后将它们水平放回加湿室中。确保在步骤 8.3 中使用疏水笔创建的屏障仍然存在;如有必要，再次勾勒出组织的轮廓。
3. 添加适当稀释的目标一抗以覆盖组织 （~100 μL）。
4. 关闭加湿室，并将载玻片在 4 °C 的平坦表面上在黑暗中孵育过夜。

11. 清洗载玻片

1. 从加湿室中取出载玻片，轻轻敲掉一抗，然后将载玻片放入浸没在 PBS 中的载玻片架中 5 分钟。
2. 取下载玻片架，将其放入装满 PBS 的新耐溶剂培养皿中 5 分钟。重复步骤 1x。

12. 二抗和细胞核复染

1. 对于每张玻片，选择旨在与一抗种类结合的二抗荧光基团。在二抗稀释剂中稀释二抗荧光基团或偶联的一抗。使用的二抗是驴抗山羊 488 （1：200）、驴抗兔 cy3 （1：200）、驴抗小鼠 647 （1：200）、驴抗兔 647 （1：200） 和驴抗大鼠 cy3 （1：200）。与荧光团 647 偶联的一抗 γ-ACTIN 以 1：100 的稀释度使用。
   1. 要制备二抗稀释剂，如果使用如上所述的鱼明胶封闭缓冲液，则向 PBS 中加入 1：100 的封闭缓冲液。
2. 从 PBS 中取出载玻片，轻轻拍掉多余的 PBS，然后将它们水平放回加湿室中。确保在步骤 8.3 中使用疏水笔创建的屏障仍然存在;如有必要，再次勾勒出组织的轮廓。
3. 添加适当稀释的二抗荧光基团或目标偶联的一抗以覆盖组织 （~100 μL）。
4. 关闭加湿室，并在室温下在黑暗中孵育载玻片 1 小时。
5. 使用 PBS 稀释 10 mg/mL Hoechst（参见 材料表）或 DAPI，最终浓度为 1 μg/mL Hoechst，或使用 PBS 稀释 DAPI，然后直接添加到组织中 （~100 μL）。在室温下避光孵育 5 分钟。
6. 从加湿室中取出载玻片，并将其放入载玻片架中，在黑暗中浸没在 PBS 中 5 分钟。
7. 取下载玻片架，放入装满 PBS 的新耐溶剂培养皿中，在黑暗中放置 5 分钟。重复步骤 1x。

13. 显微镜的安装和准备

1. 从浸没在 PBS 中的载玻片架上一次取出一张载玻片，将剩余的载玻片浸没在 PBS 中避光。轻轻拍掉多余的 PBS，如果需要，使用无绒湿巾小心擦去载玻片上多余的 PBS，避开组织。
2. 在组织中心加入一到两滴抗淬灭封固剂（参见 材料表）。
3. 握住干净的盖玻片（参见 材料表 ）的边缘，然后以 45° 角慢慢将其降低到载玻片上。确保封固剂均匀分布在组织上。
4. 从组织中心开始，用两根手指轻轻按压盖玻片，以帮助去除气泡和多余的封固剂。如果需要，继续按压边缘并在整个过程中保持轻柔的压力。
5. 切掉未过滤的 P200 移液器的小端，并将其连接到连接到真空的血清移液器的尖端。
6. 沿着盖玻片的边缘，使用真空除去多余的封固剂。
7. 在新的载玻片盒中，将载玻片水平平放，让载玻片在室温下避光干燥。
8. 对每张幻灯片重复此过程。

结果

如前所述，进行苏木精和伊红 （H&E） 染色¹²。使用优化的方法，瑞士肠卷在单个载玻片上包括小肠和大肠的所有三个段。将整个肠道放在载玻片上可以让研究人员分析肠道所有部分的变化，并节省切片和染色试剂的成本（图 1）。此外，在免疫染色时将所有肠段同时暴露于相同的溶液中有助于确保准确的结果。H&E 显微照片显示小肠和大肠所有部分的肠道结...

讨论

在这里，我们提出了一种使用 Swiss roll 技术进行组织固定的优化方法，以保留肠道结构并促进准确的免疫染色。一旦掌握，这项技术可用于研究涉及肠道生理学和细胞生物学的各种研究问题¹⁹。几种优化的瑞士轧制方法已经发布，非常有用^20,21。这种技术的优点是易于在滤纸上准确打开肠道。这使得组织可以固定平整，防止组织在滚动?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638