Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

Özet

Bağırsak, sindirim ve emilim için hayati önem taşır. Her bölge -duodenum, jejunum, ileum, kolon- benzersiz hücresel yapılar nedeniyle farklı işlevlere hizmet eder. Bağırsak fizyolojisini incelemek, titiz bir doku analizi gerektirir. Bu protokol, İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonunu ve işlenmesini ana hatlarıyla belirtir ve uygun doku koruması ve oryantasyonu yoluyla doğru immün boyamayı sağlar.

Özet

Bağırsak, ince ve kalın bağırsaklardan oluşan karmaşık bir organdır. İnce bağırsak ayrıca duodenum, jejunum ve ileum olarak ikiye ayrılabilir. Bağırsağın her anatomik bölgesi, hücresel yapıdaki farklılıklarla yansıtılan benzersiz bir işleve sahiptir. Bağırsaktaki değişikliklerin araştırılması, farklı doku bölgelerinin ve hücresel değişikliklerin derinlemesine analizini gerektirir. Bağırsakları incelemek ve büyük doku parçalarını görselleştirmek için, araştırmacılar genellikle bağırsak İsviçre ruloları olarak bilinen bir teknik kullanırlar. Bu teknikte bağırsak her anatomik bölgeye ayrılır ve düz bir yönelimde sabitlenir. Daha sonra, doku dikkatlice yuvarlanır ve parafin gömme için işlenir. Uygun doku fiksasyonu ve oryantasyonu genellikle gözden kaçan bir laboratuvar tekniğidir, ancak aşağı akış analizi için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, bağırsak dokusunun yanlış İsviçre yuvarlanması, kırılgan bağırsak epiteline zarar verebilir ve bu da immün boyama için düşük doku kalitesine yol açabilir. Sağlam hücresel yapılara sahip iyi sabitlenmiş ve düzgün yönlendirilmiş dokunun sağlanması, bağırsak hücrelerinin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlayan çok önemli bir adımdır. Bağırsağın tüm bölümlerini tek bir parafine gömülü blokta içerecek şekilde İsviçre ruloları yapmak için uygun maliyetli ve basit bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, bağırsak epitelinin çeşitli yönlerini incelemek için bağırsak dokusunun optimize edilmiş immünofloresan boyamasını da tarif ediyoruz. Aşağıdaki protokol, araştırmacılara bağırsak dokusu fiksasyonu, Swiss-roll tekniği ve immünoboyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüleri elde etmek için kapsamlı bir kılavuz sağlar. Bu rafine yaklaşımları kullanmak, bağırsak epitelinin karmaşık morfolojisini korur ve bağırsak fizyolojisi ve patobiyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

Bağırsağın hücresel mimarisi, bağırsak dokusu immün boyama için korunurken yapısal bütünlüğünün korunmasında benzersiz bir zorluk teşkil eder. İnce bağırsak, villus¹ olarak bilinen uzun parmak benzeri yapılardan oluşur. Bu villuslar genellikle gömme işlemleri sırasında malform hale gelir. Araştırmacıların, bağırsağın tüm bölgelerinin yanı sıra bağırsağı oluşturan katmanların (yani muscularis propria, mukoza ve serosa) görselleştirilmesine izin vererek, enine kesitler elde etmek için bağırsakları düzgün bir şekilde gömme tekniklerine sahip olmalarını sağlamak, sağlam deneysel analiz için çok önemlidir². Yetersiz fiksasyon....

Protokol

Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, tüm hayvan bakımını, bakımını ve tedavisini onayladı. Bu çalışmada kullanılmak üzere yetişkin C57BL / 6J farelerinden (3-5 aylık erkek ve dişiler, yaklaşık 30 g ağırlığında) bağırsak dokusu toplandı.

1. Bağırsak dokusu fiksasyonu

1. Ötenazi uygulanmış bir farenin tüm bağırsağını dikkatlice inceleyin ve fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir tartı teknesine veya Petri kabına yerleştirin.
2. Bağırsakları PBS'den çıkarın ve fazla yağ ve bağ dokusunu nazikçe çıkarmak için makas kullanın. Bağ dokusunun kesilmesi, sonraki adımlarda dokunun....

Tartışmalar

Burada, bağırsak mimarisini korumak ve doğru immün boyamayı teşvik etmek için İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bağırsak fizyolojisi ve hücre biyolojisini içeren çok çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir¹⁹. Optimize edilmiş birkaç İsviçre haddeleme yöntemi yayınlanmıştır ve çok faydalıdır ^20,21

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638