פרוטוקול ממוטב לגלילים שוויצריים במעי וצביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה משובצת פרפין

Summary

המעי חיוני לעיכול וספיגה. כל אזור - תריסריון, ג'ג'ונום, איליאום, המעי הגס - משרת פונקציות נפרדות בשל מבנים תאיים ייחודיים. לימוד הפיזיולוגיה של המעי דורש ניתוח רקמות קפדני. פרוטוקול זה מתאר קיבוע ועיבוד רקמות בטכניקת הרול השוויצרית, ומבטיח אימונוסטיין מדויק באמצעות שימור וכיוון נכון של הרקמות.

Abstract

המעי הוא איבר מורכב המורכב מהמעי הדק והגס. המעי הדק יכול להיות מחולק עוד יותר תריסריון, jejunum, ו ileum. לכל אזור אנטומי במעי יש תפקיד ייחודי המתבטא בהבדלים במבנה התאים. חקירת שינויים במעי דורשת ניתוח מעמיק של אזורי רקמות שונים ושינויים תאיים שונים. כדי לחקור את המעי ולדמיין חתיכות גדולות של רקמה, חוקרים משתמשים בדרך כלל בטכניקה המכונה לחמניות שוויצריות מעיים. בטכניקה זו, המעי מחולק לכל אזור אנטומי קבוע בכיוון שטוח. לאחר מכן, הרקמה מגולגלת בזהירות ומעובדת להטבעת פרפין. קיבוע וכיוון נכונים של רקמות הם טכניקת מעבדה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה, אך היא חשובה באופן קריטי לניתוח במורד הזרם. בנוסף, גלגול שוויצרי לא תקין של רקמת המעי עלול לפגוע באפיתל המעי השברירי, מה שמוביל לאיכות רקמה ירודה לצביעת מערכת החיסון. הבטחת רקמה קבועה היטב ומכוונת כראוי עם מבנים תאיים שלמים היא צעד חיוני המבטיח הדמיה אופטימלית של תאי המעי. אנו מציגים שיטה חסכונית ופשוטה להכנת לחמניות שוויצריות כדי לכלול את כל חלקי המעי בבלוק אחד משובץ פרפין. אנו מתארים גם צביעה אימונופלואורסצנטית אופטימלית של רקמת המעי כדי לחקור היבטים שונים של אפיתל המעי. הפרוטוקול הבא מספק לחוקרים מדריך מקיף להשגת תמונות אימונופלואורסנציה באיכות גבוהה באמצעות קיבוע רקמת מעי, טכניקת סוויס-רול וצביעת מערכת החיסון. שימוש בגישות מעודנות אלה משמר את המורפולוגיה המורכבת של אפיתל המעי ומטפח הבנה עמוקה יותר של הפיזיולוגיה של המעי והפתוביולוגיה.

Introduction

הארכיטקטורה התאית של המעי מציבה אתגר ייחודי בשמירה על שלמותו המבנית כאשר רקמת המעי נשמרת לצורך צביעה חיסונית. המעי הדק מורכב ממבנים מוארכים דמויי אצבעות המכונים וילי¹. וילי אלה לעתים קרובות הופכים מעוותים במהלך תהליכי הטמעה. הבטחת שלחוקרים יש טכניקות להטמעה נכונה של מעיים כדי להשיג חתכים, המאפשרים הדמיה של כל אזורי המעי, כמו גם את השכבות המרכיבות את המעי (כלומר, muscularis propria, רירית והסרוסה), היא חיונית לניתוח ניסויי חזק². קיבוע לא מספק, קיבוע מוגזם וטיפול לא נכון ברקמות יפגעו בשלמות הרקמה, וכתוצאה מכך ייגרם נזק לא מכוון לאפיתל המעי ^3,4. פגיעה באפיתל המעי במ....

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה אישרה את כל הטיפול, התחזוקה והטיפול בבעלי חיים. רקמת המעי נאספה מעכברים בוגרים C57BL/6J (זכרים ונקבות בני 3-5 חודשים, במשקל של כ-30 גרם) לשימוש במחקר הנוכחי.

1. קיבוע רקמת המעי

1. נתחו בזהירות את המעי כולו מעכבר שעבר המתת חסד והניחו אותו בסירת שקילה או בצלוחית פטרי המכילה מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. הסר את המעיים מה- PBS והשתמש במספריים כדי להסיר בעדינות עודפי שומן ורקמת חיבור. חיתוך רקמת החיבור מסייע לרקמה להשתטח בשלבים הבאים.
3. חלקו את המעי למקטעים נפרדים באמצעות מספריים (כלומר, תריסריון, ג'ג'ונום, איליאום, צקום ומעי גס). חל....

תוצאות

בוצעה צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E), כפי שתואר קודם לכן¹². בשיטה האופטימלית, לחמניות שוויצריות במעיים כללו את כל שלושת המקטעים של המעי הדק והמעי הגס בשקופית אחת. איכלוס המעי כולו בשקופית מאפשר לחוקרים לנתח שינויים בכל חלקי המעי וחוסך עלויות על ריאגנטים של חתך וצביעה (?.......

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית לקיבוע רקמות בטכניקת הרול השוויצרית כדי לשמר את ארכיטקטורת המעי ולקדם אימונוסטיין מדויק. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות מחקר הקשורות פיזיולוגיה של המעי וביולוגיה התא¹⁹. פורסמו מספר שיטות גלגול שוויצריות אופטימליו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638