JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتصميم وبناء وتسليم الدائرة الاصطناعية المستحثة القائمة على التتراسيكلين. يمكن دراسة تأثير الدوائر الاصطناعية على التخلص من الطفيليات وتعبير السيتوكين عن طريق توجيه خط الأنابيب المقدم. هذا البروتوكول مناسب للباحثين الذين يدرسون العلاجات القائمة على الدوائر الاصطناعية في الأمراض المعدية.

Abstract

الأيض المناعي هو محدد محوري في تطور داء الليشمانيات. حظي النهج القائم على البيولوجيا التركيبية باهتمام كبير كخطوة نحو التدخل العلاجي الذي يستهدف العوامل المرتبطة بالمضيف والتي تدفع داء الليشمانيات. تستلزم البيولوجيا التركيبية هندسة المكونات الجينية بطريقة متعامدة ومعيارية لتعديل النظم البيولوجية بدقة ، مما يضفي وظائف جديدة على الخلايا. في الدراسة المقدمة ، كان الهدف من توضيح خط أنابيب منهجي لتطوير دائرة اصطناعية قائمة على التتراسيكلين (TetON) قابلة للتحريض إلى توصيل نازعة هيدروجين السكسينات كعامل علاجي لتسهيل القضاء على طفيليات الليشمانيا داخل الخلايا. يصف البروتوكول المبين تصميم الدائرة الاصطناعية والتحقق من صحتها لاحقا. تركز الاستراتيجية المقترحة أيضا على دمج الدوائر الاصطناعية في العمود الفقري البلازميدي كوسيلة توصيل. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام آلات التوصيل التي تستخدم جزيئات نانوية قائمة على polyplexes لتوصيل الدوائر الاصطناعية في خطوط خلايا البلاعم الفئران دون المساس بالتشكل الخلوي. تم إجراء توحيد الطريقة لاختيار الخلايا المنقولة وتحديد تركيز الحث الأمثل لتعبير الدوائر الاصطناعية. تكشف الملاحظات عن انخفاض واضح في عبء الطفيليات داخل الخلايا في الخلايا المنقولة مقارنة بالخلايا المصابة. تم التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بعد العدوى في الخلايا المنقولة والمستحثة في الدائرة الاصطناعية كآلية لتعزيز القضاء على الطفيليات. وهذا يؤكد على الطريقة القائمة على البيولوجيا التركيبية كنهج قوي في داء الليشمانيات من خلال استهداف العوامل المضيفة المرتبطة بتطور المرض.

Introduction

يعد تقدم الطب الشامل والتكاملي رابطا مهما تم تحديده بين التغيرات الأيضية في الخلايا المناعية وقدرتها على تعديل النمط الظاهري للخلايا المناعية في الأمراض المعدية. يقدم التمثيل الغذائي المناعي وجهات نظر جديدة لتوضيح التسبب في الأمراض المعدية السائدة في البشر. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر تقنيات واعدة لتطوير اللقاحات والعقاقير من خلال تحديد أهداف جديدة للتدخل1. يتم تحديد إعادة البرمجة الأيضية للخلايا المناعية عبر الأمراض المعدية المختلفة ، بما في ذلك داء الليشمانيات. الليشمانيا النيابة. مسؤول عن التسبب في داء الليشمانيات ، حيث تسبب الليشمانيا الكبرى (L. major) داء الليشمانيات الجلدي (CL). L. الطفيليات الرئيسية تثير تأثيرا كبيرا على استقلاب الخلايا المضيفة ، وخاصة في الضامة ، للتكاثر والبقاء على قيد الحياة كطفيليات داخل الخلايا2. يمكن أن تستقطب البلاعم عادة إما إلى مجموعات فرعية منشطة بشكل كلاسيكي (M1) أو بدلا من ذلك (M2) حيث تمتلك خلايا M1 إفرازا عاليا للسيتوكين مؤيدا للالتهابات وإنتاج أكسيد النيتريك (NO) من خلال استقلاب أنواع النيتروجين. تظهر خلايا M2 مستويات مرتفعة من السيتوكينات المضادة للالتهابات وتعرض نشاطا عاليا للأرجيناز من خلال استقلاب النيتروجين3. وبالتالي ، فإن كلا النمطين الظاهريين لا يختلفان فقط من خلال استجابتهما المناعية ولكن أيضا في مساراتهما الأيضية.

تهدف بيولوجيا النظم لداء الليشمانيات إلى تحديد الأهداف الجزيئية لتصميم علاجات جديدة من خلال تصميم الأدوية وتطويرها. تساعد إعادة بناء شبكات الإشارات والمسارات الأيضية في فهم داء الليشمانيات كنموذج شامل وترسم نظرة ثاقبة لتحديد المكون الرئيسي الذي يقود الحالة المريضة. النمذجة الرياضية هي واحدة من أكثر الأساليب التحليلية التطبيقية تفضيلا لفهم تعقيدات داء الليشمانيات4. مكنت شبكات التمثيل الغذائي المناعي والنماذج الرياضية من تحديد نازعة هيدروجين السكسينات (SDHA) كمكون رئيسي للنمط الظاهري M1 ، والذي يتم التعبير عنه للقضاء على الطفيلي5. البيولوجيا التركيبية لها تطبيقات في التشخيص وتطوير اللقاحات والعلاجات في داء الليشمانيات. يمكن تحقيق التمثيل الغذائي الذي يستهدف تعديل الاستجابة المناعية من خلال أدوات البيولوجيا التركيبية. لتعديل الإينوزيتول فوسفوريل سيراميد سينسيز الذي ينظم استقلاب السفينغوليبيد ويغير الإشارات المناعية للمضيف ، تم استخدام دائرة وراثية تمتلك سلوكا ثنائي الاستقرار لضبط المتانة الجوهرية لنموذج العدوى الرئيسية L. 6,7 صناعيا. وبالتالي ، يمكن أن توفر الأنظمة والبيولوجيا التركيبية منصة هندسة وراثية قائمة على النموذج لتطوير الطب الدقيق في نظام نموذج الليشمانيا.

يتميز النمط الظاهري M1 بالتعبير عن شبكات الإشارات الأيضية المناعية حيث يعزز إنتاج السيتوكينات الالتهابية والمسارات الأيضية بشكل تآزري القضاء على الطفيليات. يشير استقطاب M1 إلى إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل Interleukin-12 (IL-12) وإنترفيرون جاما (IFN-γ) وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α). تشمل المسارات الأيضية عالية الإثراء في النمط الظاهري M1 تحلل السكر ومسار فوسفات البنتوز ودورة حمض الكربوكسيل المقطوعة (دورة TCA)5. توجه دورة TCA المقطوعة آلية القضاء على الطفيليات من خلال زيادة مستويات السكسينات والسترات ، والتي توجه إنتاج NO3. يؤدي تراكم السكسينات بواسطة SDHA إلى تنشيط عامل النسخ الذي يسبب نقص الأكسجة العامل 1-alpha (HIF-1α) ، والذي يحفز إنتاج IL-1β8. في النمط الظاهري M2 ، لوحظت أكسدة الأحماض الدهنية ، وزيادة استخدام الجلوتامين ، وتعزيز الفسفرة التأكسدية للجلوكوز جنبا إلى جنب مع إنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات مثل Interleukin-10 (IL-10) ، تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) ، إنترلوكين -4 (IL-4) وإنترلوكين -13 (IL-13) 3. يعرض M2 الميتوكوندريا الممدودة كميزة مميزة ، مما يؤدي إلى تعزيز الكفاءة في توليد الطاقة. يستخدمون الأحماض الدهنية والجلوكوز والجلوتامين كركائز لتغذية دورة TCA ، وبالتالي توليد ATP من خلال الفسفرة التأكسدية بمعدل أعلى لتعزيز نمو الطفيليات وانتشارها9. لا يمكن لإنزيم SDHA المسؤول عن تراكم السكسينات من خلال TCA المقطوع أن يعزز إنتاج NO فحسب ، بل يبدأ أيضا في استهلاك الأكسجين المعتمد على السكسينات من خلال نقل الإلكترون10. في البلاعم المصابة بالليشمانيا ، ينخفض تنظيم SDHA بمقدار 2.17 ضعف ، مما يشير إلى أن التنفس الهوائي قد ينخفض أيضا11. من أجل زيادة استهلاك السكسينات للحث على إنتاج NO بوساطة السيتوكين المؤيد للالتهابات وتعزيز القضاء على الطفيليات ، فإن التعبير عن SDHA ضروري.

تقدم الدائرة الاصطناعية علاجات مستهدفة بدقة قد تغير النظام المصاب لتحقيق تذبذب ثنائي الاستقرار قد يعيد النمط الظاهري الصحي على المستوى الزماني المكاني. تسليم الدوائر الاصطناعية والتعبير عنها يجعل النظام ديناميكيا وقويا. يكمن أحد العوامل المحورية التي تساهم في تقدم البيولوجيا التركيبية في القدرة على تجميع الأجزاء والعناصر الجينية بطريقة معيارية لتمكين توليد أبنية معقدة ووظائف مصممةخصيصا 12. حفزت القيود المرتبطة بتقنيات التعبير التقليدية ظهور دوائر اصطناعية بلازميدية مستحثة قائمة على التتراسيكلين ، مما يسمح بالتقييم السريع للبلازميد وسهولة التسليم عبر أنواع الخلاياالمختلفة 13. يظهر بروتين المثبط المستجيب للتتراسيكلين (TetR) ، عند وجوده كثنائي ، تقاربا قويا مع tet operon (TetO) ، مما يثبط النسخ بشكل فعال. ومع ذلك ، عند تفاعل ليجند ، الدوكسيسيكلين (dox) ، يخضع TetR لتغيير هيكلي ، مما يؤدي إلى انفصاله عن TetO ، مما يسمح للنسخ بالمضي قدما دون عوائق. يمكن أن تظهر هذه الدائرة التحكم في ترجمة البروتين14. لذلك ، من خلال المنهجية المحددة ، تم تمكين الدائرة الاصطناعية البلازميد المستحثة القائمة على التتراسيكلين القائم على التتراسيكلين للتعبير عن SDHA في ناقل pEGFP-N1. قدم تقييم كفاءة تحويل الدائرة وعائدها رؤى حول كفاءة التسليم. من خلال تقييد هضم الناقل ، تم تأكيد تحديد كفاءة الاستنساخ. علاوة على ذلك ، لوحظ خط خلايا بلاعم فأر RAW264.7 منقولة مشتقة من البلاعم البريتونية لفئران Balb / c لتعبير البروتين الفلوري الأخضر المعتمد على جرعة الدوكسيسيكلين (GFP) في الخلايا المنقولة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تأكيد تأثير القضاء على الطفيليات في الخلايا المنقولة بتعبير عن الدائرة الاصطناعية. علاوة على ذلك ، لوحظ تحريض وتعبير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، والتي تم توجيهها من خلال زيادة في النقطة الزمنية للعدوى في الخلايا المنقولة والمستحثة في الدائرة الاصطناعية ، والتي كانت مرتبطة مباشرة بعمل الدائرة الاصطناعية.

Protocol

1. زراعة الخلايا من خلايا RAW264.7

ملاحظة: استخدم أرقام مرور منخفضة للتجريب. تم شراء خط الخلايا RAW264.7 من مستودع الخلايا الوطني لمجلس ابتكار أبحاث التكنولوجيا الحيوية - المركز الوطني لعلوم الخلية (BRIC-NCCS) ، بيون. نظرا لأن خط الخلية RAW264.7 هو خط خلية بلاعم ، فقد يبدأ في التمايز مع زيادة الممرات. بعد إحياء الخلايا استخدام خط الخلية لنقل بعد 2 ممرات.

  1. بذرة 5 × 105 خلايا من خط الخلايا RAW264.7 في قارورة 25 سم2 مكملة ب 5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين كوسط كامل.
  2. احتفظ بالخلايا للنمو والانتشار في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التقاء 90٪.
  3. تخلص من الوسائط واغسل 3x باستخدام 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS). أضف 1 مل من PBS إلى القارورة ، وكشط الخلايا باستخدام مكشطة ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. قم بطرد الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 24 درجة مئوية وأعد تعليق الحبيبات باستخدام ماصة 1 مل في 1 مل من وسط DMEM الكامل.
  5. عد الخلايا في غرفة عد الخلايا باستخدام 0.5٪ تريبان أزرق لتحديد النسبة المئوية للخلايا الحية.

2. زراعة الخلايا من L. الطفيلي الرئيسي

ملاحظة: كانت L. promastigotes الرئيسية (MHOM / Su73 / 5ASKH) هدية من BRIC-NCCS. يجب أن يكون ل Promastigotes رقم مرور أقل من 10. يضمن رقم الممر السفلي أن الطفيلي يتمتع بصحة جيدة وأن قدرته على إصابة الضامة أعلى.

  1. Grow L. promastigotes الرئيسية (MHOM / Su73 / 5ASKH) في معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) المكمل ب 20٪ FBS كوسيط كامل.
  2. البذور 1 × 106 promastigotes في قارورة غير مهواة 25 سم2 تحتوي على 5 مل من الوسط الكامل. احتضان القارورة عند 27 درجة مئوية لمدة 5 أيام ومراقبة المرحلة الثابتة promastigote L. الطفيلي الرئيسي عند 20x في مجهر المجال الساطع.
    ملاحظة: يمكن تحقيق promastigotes المرحلة الثابتة في 4-7 أيام بعد الاستزراع. وهي تتميز بحالتها الممدودة وانخفاض حركتها.

3. تصميم دائرة اصطناعية في البلازميد كناقل توصيل

  1. تصميم أجزاء من الدائرة الاصطناعية
    1. افتح برنامج خلية Tinker وانتقل إلى علامة التبويب الأجزاء. حدد مكون المروج من المكتبة وضعه على اللوحة القماشية ليرمز إلى مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) داخل الدائرة الاصطناعية. استرجع موقع ربط الكابت ، المشابه ل TetO ، من علامة تبويب الأجزاء وضعه بجوار المروج على اللوحة القماشية ، ودمجه بسلاسة مع مروج CMV.
    2. دمج مشغل التتراسيكلين (TetO) ومواقع دخول الريبوسوم الداخلية (IRES) ومنطقة الترميز عن طريق سحب وإسقاط موقع ربط الكابت وموقع ربط الريبوسوم (rbs) ومنطقة الترميز على اللوحة القماشية ، ودمجها مع المكونات الجينية الموجودة.
    3. أعد تسمية منطقة الترميز باسم TetR ، للدلالة على الكابت المستجيب للتتراسيكلين ، والذي يعمل كمنظم سلبي مفترض داخل الدائرة الاصطناعية. دمج هذه العناصر الوراثية لتسهيل بناء الأجزاء الاصطناعية.
    4. قم بدمج منطقة مباعدة (sd1) على القماش ، مصممة لتكون قابلة للانقسام بواسطة البروتياز الخلوي مثل فيروس teschovirus-1 2A (P2A). إدخال منطقة ترميز إضافية تمثل الجين محل الاهتمام ، وتسميتها باسم SDHA ، إلى البنية الاصطناعية ودمجها مع العناصر الأخرى.
    5. بجوار منطقة ترميز SDHA ، قم بدمج منطقة مباعدة أخرى قابلة للانقسام البروتيني (sd2) ، والتي ستكون قابلة للانقسام بواسطة البروتياز الخلوي P2A. أدخل منطقة ترميز تمثل جين المراسل وقم بتسميتها على أنها GFP في البناء.
      ملاحظة: قد يوفر تعبير GFP تقديرا لإنتاج SDHA ويضمن أن الدائرة الاصطناعية لها أداء منطقي13.
    6. بجوار GFP ، قم بإلحاق الفاصل (ter1) وتحقق من الأجزاء المجمعة عن طريق التحقق مما إذا كانت جميع الأجزاء متصلة. يجب أن تظهر الدائرة باللون الأحمر عند النقر فوق أي جزء. هذا يؤكد تشكيل دائرة وراثية وظيفية.
    7. من علامة التبويب التفاعل ، قم بتعيين المعدلات التنظيمية ، والتي تتضمن المعلمات والقيم الأولية لإنتاج البروتين ، إلى TetR و SDHA و GFP لتحديد تفاعل الترجمة داخل الدائرة الاصطناعية.
    8. أضف جزيئا صغيرا من علامة التبويب الأجزاء ، وقم بتسميته Doxycycline (dox) ، وقم بتعيين وظيفة موجة له عن طريق تحديد الإدخال من علامة التبويب الأجزاء والاتصال ثم بالنقر فوق إدخال الموجة.
    9. من علامة التبويب التنظيم ، انقر فوق رد فعل القمع. قم بسحب وإسقاط معدل التفاعل على اللوحة القماشية بين dox و TetR. اضبط حركية التفاعل بين dox و TetR بالنقر المزدوج فوق رمز Wave Function على dox وضبط سعة Doxyxycline.sin.amplitude إلى 10.
    10. قم بتنفيذ التفاعل التنظيمي للنسخ بين بروتين TetR وموقع ربط الكابت عن طريق تحديد التفاعل من علامة التبويب التنظيم ووضعه على اللوحة القماشية بين TetR و TetO.
    11. بالنقر المزدوج فوق كل مكون وتفاعل ، قم بتعيين تركيز أولي ومعلمة للمحاكاة. انقر فوق محاكاة ، واختر حتمية ومحاكاة الدائرة ل 100 وحدة زمنية. اضبط الرسم البياني للمحاكاة من لوحة التحكم ، التي تنبثق مع الرسم البياني ، ولاحظ نمط الرسم البياني لبروتينات SDHA و TetR.
  2. تحديد المكونات الجينية من سجل أجزاء iGEM
    1. افتح سجل الأجزاء البيولوجية القياسية (جدول المواد) وانقر على بحث. أدخل اسم المكون الجيني ، على سبيل المثال ، مروج CMV.
      ملاحظة: يجب إجراء عملية البحث عن معرف iGEM لجميع المكونات الجينية للدائرة الاصطناعية. يتم تجنيد خطوات تحديد معرف iGEM لمروج CMV ؛ بعد ذلك ، يجب تكرار الخطوات للمكونات الأخرى.
    2. للحصول على تسلسل النوكليوتيدات لمروج CMV ، انقر فوق خيار الحصول على تسلسل الجزء واحفظ الملف كملف نصي.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان ملاحظة أن مخزونات جميع الأجزاء الجينية متوفرة.
    3. كرر الخطوة 3.2.1 والخطوة 3.2.2 لجميع الأجزاء الجينية (مشغل التتراسيكلين ، تسلسل كوزاك ، TetR ، P2A و GFP) باستثناء SDHA.
    4. للحصول على تسلسل ترميز البروتين ل SDHA ، افتح NCBI واختر النوكليوتيدات من القائمة المنسدلة بجوار نافذة البحث. اكتب سكسينات ديهيدروجيناز و Mus musculus وابحث عن تسلسل النوكليوتيدات.
    5. انقر فوق خيار CDS للحصول على تسلسل ترميز SDHA وحفظ التسلسل في ملف نصي.
    6. دمج تسلسل النوكليوتيدات لجميع الأجزاء التنظيمية الوراثية في ملف واحد بالتتابع. أضف كودون البدء (ATG) مباشرة بعد تسلسل كوزاك وقم بإزالة كودونات التوقف الداخلية لتجنب تكوين عديدات الببتيد الوليدة.
    7. افتح موقع ExPASy15 والصق تسلسل النوكليوتيدات. انقر فوق خيار ترجمة التسلسل . حدد 5'3' Frame 1 وقم بإزالة كودونات التوقف ، والتي سيتم تمييزها باللون الأحمر في قسم النتائج.
      ملاحظة: لتحديد ما إذا كان تسلسل النوكليوتيدات يترجم بشكل فعال إلى تسلسل عديد الببتيد المطلوب ، يمكن استخدام أداة ترجمة مثل ExPASy. هذا يضمن الوقاية من الببتيدات الوليدة غير المرغوب فيها. يعد اختيار متجه pEGFP-N1 للتعبير عن الدائرة الاصطناعية هو الأمثل ، بالنظر إلى أن مروج CMV وجين GFP كانا موجودين مسبقا داخل المتجه. تم تجميع جميع الأجزاء الجينية باستخدام بروتوكول الاستنساخ (الذي تم الاستعانة بمصادر خارجية). إنزيمات التقييد المستخدمة لاستنساخ الإدخالات هي NotI و XhoI. تقع مواقع إنزيم التقييد هذه داخل موقع الاستنساخ المتعدد لناقل pEGFP-N1.

4. تحويل الدائرة الاصطناعية في خلايا الإشريكية القولونية (E.coli) DH5α

  1. تحضير الخلايا المختصة E.coli DH5α
    ملاحظة: يوصى بتعقيم الكواشف. يمكن تخزين الكواشف عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    1. استزراع 1 مل من اللقاح الطازج في 50 مل من مرق لوريا (LB) عند 37 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة. تنمو الخلايا لمدة 2 ساعة تقريبا حتى يتم تحقيق كثافة بصرية (OD) من 0.4-0.6 عند 600 نانومتر.
    2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4696 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية يدويا في قارورة التجاهل عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل وحصاد حبيبات الخلية.
    3. أعد تعليق الحبيبات برفق في 2 مل من كلوريد المغنيسيوم المثلج 0.1 متر (MgCl2) باستخدام ماصة سعة 1 مل. تشكل حجم يصل إلى 20 مل مع MgCl2 الجليد البارد.
    4. قم بطرد الأنبوب عند 4696 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة سعة 1 مل في 1 مل من كلوريد الكالسيوم المثلج 0.1 متر (CaCl2) واحتضانها على الثلج لمدة ساعتين. استخدم الخلايا المختصة حديثا للتحول.
  2. تحويل الخلايا المختصة مع بناء الدوائر الاصطناعية
    1. قم بقياس 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة وأضف الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل. ضع الأنبوب على الثلج. أضف 10 نانوغرام من بنية الدائرة الاصطناعية إلى القسمة واحفظها على الجليد لمدة 3 دقائق.
    2. خلايا الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على كتلة تسخين جافة. بمجرد اكتمال الحضانة على كتلة التسخين الجاف ، ضع الخلايا مرة أخرى على الثلج لمدة 3 دقائق ، وأضف 1 مل من LB إلى الخلايا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة.
    3. عند اكتمال الحضانة ، قم بطرد الخلايا عند 4,696 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 1 مل. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من LB وقم بوضعها على أجار LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين. اقلب اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

5. عزل بناء الدوائر الاصطناعية

  1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، خذ 10 مل من وسط LB وأضف 50 ميكروغرام / مل من الكانامايسين كمرق اختيار لزرع الخلايا المحولة لعزل البلازميد. التقط مستعمرة محولة باستخدام طرف 200 ميكرولتر وأضفه إلى مرق التحديد.
  2. باستخدام حلقة تلقيح ، حدد مستعمرة واحدة أخرى ، وقم بخط صفيحة باستخدام التقنية الخماسية ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة من أجل الحفاظ على عزلات مستعمرة واحدة.
  3. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 180 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، يقوم جهاز الطرد المركزي بزراعة 4696 × جم لمدة 20 دقيقة عند 24 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب وإضافة 1 مل من محلول إعادة التعليق (50 مللي متر تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl) ، 10 مللي متر حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) ، 100 ميكروغرام / مل RNase A (pH-8.0)) إلى الحبيبات وإعادة تعليق الخلايا عن طريق السحب برفق.
    ملاحظة: لإعادة تعليق المخزن المؤقت ، أضف RNase A 5 دقائق قبل إضافة المزيج إلى حبيبات الخلية.
  4. احتضن المزيج لمدة 5 دقائق في RT. أضف 1 مل من محلول التحلل (0.2 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)) إلى الخلايا واخلطها عن طريق قلب الأنبوب لمدة دقيقتين. احتضان الأنبوب لمدة 5 دقائق في RT.
  5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحييد إلى الخلايا (3 M خلات البوتاسيوم (CH3CO2K)) واخلطها عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. قم بطرد الخلايا عند 4,696 × جم لمدة 20 دقيقة في RT وجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 1.5 مل.
  6. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى المادة الطافية واخلطها جيدا عن طريق التقليب. احتضان المادة الطافية على الجليد لمدة 15 دقيقة ثم الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن تتراوح الحضانة من 5 دقائق إلى 1 ساعة. خلال هذا ، ينصح بخلط المحتويات برفق عن طريق قلبها كل 5 دقائق.
  7. تخلص من المادة الطافية ، أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ (مبرد) إلى الحبيبات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  8. قم بتجفيف الحبيبات في الهواء وإعادة تعليق البلازميد الذي تم الحصول عليه في 20 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النيوكلياز (NFW). قياس تركيز البلازميد على مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 260/280 نانومتر.
    ملاحظة: أضف المزيد من NFW إذا كان تركيز البلازميد مرتفعا جدا ليتم تقديره من خلال nanodrop. يجب إجراء عملية تخفيف البلازميد في غطاء رقائقي.

6. الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز (AGE) من الدائرة الاصطناعية

  1. تحضير عينة البلازميد ل AGE
    1. في أنبوب سعة 1.5 مل ، قم بقياس 20 ميكرولتر من 1x Tris-acetate-EDTA (TAE). أضف 4 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 6x واخلطه جيدا عن طريق الماصة.
    2. أعط دورانا سريعا للأنبوب ، أضف 1 ميكروغرام من ناقل بلازميد الدائرة الاصطناعية واخلطه جيدا عن طريق سحب الخليط. يمكن تحميل خليط التفاعل هذا على هلام الأغاروز.
      ملاحظة: تجنب السحب الصارم لأنه قد يتلف بنية البلازميد. بدلا من ذلك ، قم بتدوير سريع لخلط الكواشف.
  2. تقييد هضم الدائرة الاصطناعية
    1. في أنبوب سعة 1.5 مل ، أضف 2 ميكرولتر من محلول تقييد 10x ، و 1 ميكرولتر من NotI ، و 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد XhoI ، واخلطه جيدا عن طريق إعطاء المحتويات دورة سريعة. أضف 1 ميكروغرام من ناقل بلازميد الدائرة الاصطناعية وإعطاء المحتويات تدور سريع.
    2. قم بتكوين حجم الأنبوب إلى 20 ميكرولتر عن طريق إضافة NFW إلى المحتويات وإعطاء الأنبوب دورة سريعة. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. بعد الحضانة ، احتفظ بالأنبوب عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة تسخين جافة لإلغاء تنشيط إنزيمات التقييد. قم بتبريد محتويات الأنبوب وإضافة 6 ميكرولتر من مخزن التحميل إلى خليط التفاعل. امزج المحتويات عن طريق إعطاء الأنبوب دورة سريعة. يمكن تحميل خليط التفاعل هذا على هلام الأغاروز.
    4. قم بإعداد هلام الأغاروز وتشغيل الجل باستخدام البروتوكول16 الموصوف مسبقا. باختصار ، قم بتحميل عينات 20 ميكرولتر لكل بئر ، وقم بتحميل 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت ، وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت. افصل مصدر الطاقة بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، واحصل على الجل على جهاز تصوير هلامي ، وقم بتشغيل خيار التألق لعرض النطاقات.

7. نقل بناء الدوائر الاصطناعية في خط خلية RAW264.7

  1. تحضير العينات
    1. تحضير العينات لتحديد تأثير القضاء على الطفيليات عن طريق الدائرة الاصطناعية المستحثة. العينة الأولى عبارة عن خلايا RAW264.7 غير منقولة (تحكم) ، والثانية هي خلايا RAW264.7 المصابة ب L. promastigotes الرئيسية لمدة 6 ساعات (6 ساعات مصابة) ، وكانت العينة الثالثة عبارة عن خلايا RAW264.7 منقولة بدائرة اصطناعية ومستحثة باستخدام dox (IMT) ، وعينات النقطة الزمنية للعدوى هي خلايا RAW264.7 منقولة بدائرة اصطناعية ومستحثة ب dox المصابة ب L. major promastigotes (IMTI) لنقاط زمنية مختلفة 6 ساعات (6 ساعات IMTI) ، 12 ساعة (12 ساعة IMTI) ، 18 ساعة (18 ساعة IMTI) و 24 ساعة (24 ساعة IMTI).
    2. لتحضير جميع العينات ، اكشط خلايا RAW264.7من قارورة 25 سم 2 وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    3. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط DMEM الكامل. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها في أنبوب 100 ميكرولتر ، أضف 10 ميكرولتر من 0.5٪ تريبان أزرق إلى الخلايا واخلطها جيدا.
    4. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخلية والمزيج الأزرق التريبان على شريحة غرفة عد الخلايا وأخذ عدد الخلايا من 4 غرف.
    5. خلايا لوحة في أسفل غطاء 96 لوحات بئر في 2 × 104 خلايا لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. هذه العينة هي عينة التحكم. تظل هذه الخطوة ثابتة لإعداد عينات أخرى.
      ملاحظة: قم بتسخين الوسائط مسبقا على درجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
    6. لتحضير عينة مصابة لمدة 6 ساعات ، جهاز طرد مركزي 1 مل من المرحلة الثابتة L. promastigotes الرئيسية عند 7,273 × g لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الوسط الكامل DMEM وأخذ عدد الخلايا في غرفة عد الخلايا باتباع الخطوات 7.1.3-7.1.4.
    7. أضف 2 × 105لتر من البروماستيغوت الرئيسية إلى البئر واحتضانها بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني.
    8. لتحضير عينة IMT ، قم بزرع الخلايا باتباع الخطوات (7.1.2-7.1.5) وتنفيذ خطوات النقل 7.2.1-7.2.6.
    9. لإعداد عينات من النقاط الزمنية للحركة الدولية للإشارات الطبية الدولية، اتبع الخطوات 7.1.2-7.1.5 وقم بتنفيذ خطوات النقل 7.2.1-7.2.6. تخلص من الوسائط الكاملة DMEM التي تحتوي على 500 ميكروغرام / مل من الجينيتاسين (G418) و 1 ميكروغرام / ميكرولتر دوكس واغسل الخلايا 3x مع 1x PBS.
    10. أضف 2 × 105لتر من promastigotes الرئيسية إلى الآبار واحتضانها لمدة 6 ساعات و 12 ساعة و 18 ساعة و 24 ساعة. بعد الإصابة ، تخلص من promastigotes التي تحتوي على وسائط كاملة DMEM واغسل الآبار 3x مع 1x PBS. أضف 200 ميكرولتر من الوسائط الكاملة DMEM التي تحتوي على 500 ميكروغرام / مل من Geneticin (G418) و 1 ميكروغرام / ميكرولتر dox إلى الخلايا واحتضانها لمدة 24 ساعة.
  2. نقل الدائرة الاصطناعية
    1. في أنبوب سعة 1.5 مل ، أضف 24 ميكرولتر من وسط المصل المخفض ، وهو وسط أساسي مصغر محسن. إلى الوسائط ، أضف 1 ميكروغرام من ناقل pEGFP-N1 المستنسخ ببلازميد الدائرة الاصطناعية.
    2. في أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، أضف 24 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي وأضف 1 ميكرولتر من البولي إيثيلين (PEI ؛ 1 ميكروغرام / ميكرولتر). تخلط جيدا عن طريق سحب المزيج 10x على الأقل واحتضانه في RT لمدة 5 دقائق.
    3. انقل مزيج PEI إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على مزيج الحمض النووي. تخلط جيدا عن طريق سحب قطرة حكيمة على الأقل 10x. احتضان الحمض النووي: مزيج جزيرة الأمير إدوارد في RT لمدة 10 دقائق.
    4. تخلص من الوسائط من الآبار الموجودة على الألواح السفلية ذات الغطاء المنزلق المكون من 96 بئرا واغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة ، أضف الحمض النووي: PEI برفق إلى الخلايا وهز اللوحة برفق. احتضان الخلايا مع 5 ٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    5. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي الطازج إلى الخلايا ، وهز الطبق برفق ، واحتضنه لمدة 24 ساعة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: جزيرة الأمير إدوارد سامة للخلايا. وبالتالي ، يوصى بعدم احتضان الخلايا بعد النقل لأكثر من 24 ساعة.
    6. في اليوم التالي ، تخلص من الوسائط واغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف وسائط DMEM الكاملة التي تحتوي على 500 ميكروغرام / مل من الجينات (G418) و 1 ميكروغرام / ميكرولتر دوكس إلى الخلايا واحتضانها لمدة 24 ساعة.
  3. تثبيت العينات للفحص المجهري متحد البؤر
    1. لإصلاح جميع العينات ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS 3x ، وأضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى الخلايا ، واحتضانها في RT لمدة 10 دقائق.
    2. اغسل الخلايا باستخدام PBS 3x. بعد اكتمال الغسيل ، أضف 1 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) إلى الخلايا واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    3. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. راقب الخلايا تحت المجهر متحد البؤر لتعبير GFP وتلطيخ DAPI.

8. اقتناء الخلايا المنقولة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر والقياس الكمي

  1. نظف قاع غطاء الآبار باستخدام أنسجة ماصة. قم بتشغيل عناصر التحكم في مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. بعد ذلك ، قم بتشغيل الضاغط ومصباح الزئبق.
  2. لتشغيل الجهاز ، يجب تشغيل عناصر التحكم في المجهر ، والتحكم في رأس المسح الضوئي ، ومفتاح الليزر ، ووحدة الليزر ، والمصباح ، ووحدة التحكم في المجهر ، ووحدة المعالجة المركزية بالتتابع.
  3. على الكمبيوتر ، افتح البرنامج (جدول المواد) وانقر فوق تمكين التحكم في المرحلة XY. سيتم فتح نافذة منبثقة تطلب تنفيذ التنظيف ل 7S3. انقر فوق لا. أغلق الرسم البياني المباشر واضبط شاشات الإعداد.
  4. إلى هدف 60x ، أضف قطرة من زيت الغمر ، ضع اللوحة السفلية لغطاء البئر 96 على المسرح ، وحرك المرحلة في مستوى X-Y لضبط موضع الهدف على البئر. انقر فوق العين وحدد قناة Alexa-488. انقر فوق Shutter Off لتركيز الخلايا على العدسة. اضبط العدسة حسب التركيز الأساسي والدقيق.
  5. انقر فوق Shutter On present في مربع التحكم المجهري وحرك الهدف لضبط موضعه وتركيز منطقة الاهتمام لمراقبة الخلايا في تباين التداخل التفاضلي (DIC). قم بالتبديل إلى وضع EPI في صندوق التحكم المجهري لمراقبة الخلايا الموجودة في مرشح الطول الموجي Alexa-488 لتعبير GFP. يجب أن تظهر الخلايا باللون الأخضر.
  6. انقر فوق إيقاف الغالق ، وانتقل إلى تصوير LSM ، واختر دقة الصورة 1,024 × 1,024. انقر فوق إضافة مرحلة واسحب لإضافة قناة خضراء كمرحلة.
  7. في برنامج أوليمبوس ، انقر فوق LSM وانقر أيضا على Live Button لمراقبة الخلايا في تباين الطور وقناة Alexa 488nm. اضغط على Control وقم بالتمرير لتركيز الخلايا من البرنامج لالتقاط الصور.
  8. اضبط الكسب والإزاحة لضبط شدة التألق التي تم التقاطها بواسطة الكاشف. انقر فوق التقاط ، وقم بتسمية الصور ، وانقر فوق حفظ.
  9. في برنامج التصوير ، انقر فوق ملف ، وحدد جميع الصور ذات الامتداد .oir ، وانقر فوق فتح.
  10. انقر فوق عرض البلاط لتصور الصور في جميع القنوات. لإضافة شريط مقياس إلى الصور ، انقر فوق عرض ثم اختر خيار شريط المقياس .
  11. لحفظ الصور من قنوات فردية بتدرج رمادي 16 بت ، انقر فوق ملف وحدد تصدير الصورة. حدد الصورة وتحقق من علامات التجزئة على جميع القنوات. في صفحة تحديد الإطار في خيار العرض المقسم، اختر نعم. في علامة تبويب الإخراج ، اختر لون RGB 24 بت مع خيار معلومات النسخ واختر tiff كنوع ملف للصورة. في مجلد التصدير إلى ، اختر موقع الملف المناسب لحفظ الصور ثم انقر فوق موافق.
  12. لحفظ الصور المدمجة ، اتبع نفس الخطوات ، باستثناء ، في خيار العرض المقسم ، اختر لا ، وفي علامة تبويب الإخراج ، اختر القنوات المدمجة مع نسخ المعلومات.
  13. لتحليل تعبير GFP في الخلايا ، افتح فيجي في Windows وقم بتصدير ملف tiff. حدد اللون الأخضر لتحليل تعبير GFP.
  14. حدد منطقة الخلية باستخدام خيار الأداة اليدوية وانقر فوق تحليل لقياس شدة التألق. كرر العملية لمدة 3 صور.
  15. تصدير البيانات إلى برنامج تحليل وإجراء اختبارات إحصائية على البيانات الكمية.

9. فحص تحميل الطفيليات

  1. أثناء تصور الخلايا على مجهر متحد البؤر ، احسب العدد الإجمالي للطفيليات الموجودة في الضامة الفردية.
  2. فحص عشوائي 100 البلاعم ولاحظ عدد الطفيليات داخل الخلايا. اختبار إحصائي للأداء بين المصابين والنقاط الزمنية لعينات IMTI لفحص تأثير تعبير SDHA على عدد الطفيليات.

10. القياس الكمي ل IL-10 و IL-12 من خلال مقايسة المواد الماصة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

  1. قم بإعداد العينات وفقا للخطوتين 7.1 و 7.2 واجمع الوسائط في أنبوب سعة 1.5 مل. احتفظ بالوسائط على الثلج أو قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. اتبع تعليمات دليل مجموعة أدوات المستخدم وقم بإجراء ELISA ل IL-10 و IL-12.

11. تنميط السيتوكين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR)

  1. قم بإعداد العينات وفقا للخطوتين 7.1 و 7.2. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 500 ميكرولتر من كاشف TRIzol واحتضان الخلايا لمدة 2 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يجب تنفيذ خطوات عزل الحمض النووي الريبي في خزانة التدفق الصفحي كإجراء احترازي للسلامة ضد تلوث RNase.
  2. اجمع العينات في أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إليها ، واخلطها عن طريق قلب الأنابيب 5x-8x. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. سيتم ملاحظة ثلاث طبقات ، وجمع الطبقة العليا المائية الصافية في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى الطبقة المائية ، واخلطها جيدا عن طريق قلب 10x ، واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT. بعد كل 5 دقائق ، امزج العينات مرة أخرى عن طريق قلب الأنابيب.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات 2x بإيثانول 75٪ مصنوع في 0.1٪ ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) يحتوي على الماء لمدة 5 دقائق وأجهزة طرد مركزي عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: DEPC يحتوي على الماء يحلل RNases ، وبالتالي ، يوصى باستخدامه لعزل الحمض النووي الريبي.
  5. أخيرا ، قم بتجفيف الحبيبات في الهواء لمدة 5 دقائق في RT ، وقم بإذابتها في 20 ميكرولتر من الماء المحتوي على DEPC ، وقم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المعزول ، بنسبة 260/280 و 260/230 ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: يجب أن تكون نسبة 260/280 حوالي 2.0 ، وهو ما يدل بشكل عام على شكل نقي من الحمض النووي الريبي ، ويجب أن تكون نسبة 260/230 بين 2.0-2.2 من أجل اعتبار أن الحمض النووي الريبي المعزول خال من المركبات الكيميائية غير المرغوب فيها مثل TRIzole.
  6. لتحضير 20 ميكرولتر من كل عينة cDNA ، قم بإذابة الكواشف على الجليد وامنحها دورة قصيرة لمدة 15 ثانية في RT. أعط دورة قصيرة لجميع الكواشف وحتى لعينات الحمض النووي الريبي قبل الاستخدام.
  7. في أنبوب 100 ميكرولتر معقم ، خذ 0.8 ميكرولتر من 25x dNTP ، 2 ميكرولتر من 10x التمهيدي ، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x. أضف 1 ميكروغرام / ميكرولتر تركيز الحمض النووي الريبي وأضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي. قم بتكوين الحجم إلى 20 ميكرولتر باستخدام الماء المحتوي على DEPC.
  8. امنح عينات cDNA دورة قصيرة لمدة 1 دقيقة في RT. احتفظ بالعينات على الجليد.
  9. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري ، وقم بفك اللوحة العلوية لفك الحامل ، وضع العينات على الكتلة. بعد وضع العينات ، قم بلف الغطاء بإحكام.
  10. بمجرد تشغيل النظام ، انقر فوق تشغيل. حدد الخيار الرئيسي ، ثم أدخل قائمة البرامج وحدد خيار CDNA . حدد حجم العينة على أنه 20 ميكرولتر وانقر فوق RUN. يقوم cycler الحراري بتشغيل البرنامج في أربع خطوات. الخطوة الأولى هي 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والثانية هي 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، والثالثة 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والخطوة الأخيرة هي 4 درجات مئوية إلى الأبد.
  11. بمجرد دخول الدورة إلى الخطوة الرابعة ، انقر فوق Enter وإنهاء الدورة. اجمع العينات وانتقل إلى qRT-PCR. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية وعينات cDNA عند -20 درجة مئوية.
  12. للكشف عن السيتوكينات ، قم بإذابة الكواشف المطلوبة 2x PCR Master mix و cDNA ومجسات TNF-α و IFN-γ و TGF-β و NFW على الجليد.
    ملاحظة: يجب حفظ جميع الكواشف ومخاليط التفاعل والعينات على الجليد.
  13. في أنبوب 100 ميكرولتر ، قم بإعداد عينة cDNA بإضافة 1 ميكرولتر من cDNA و 3.5 ميكرولتر من NFW. لتحضير المزيج الرئيسي ، خذ 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي وأضف 0.5 ميكرولتر من المسبار في أنبوب 100 ميكرولتر. امزج المحتويات عن طريق إعطاء دوران قصير. احسب عدد العينات والجينات المستهدفة وقم بإعداد مزيج التفاعل وفقا لذلك.
    ملاحظة: أضف NFW والمزيج الرئيسي إلى قاع أنبوب 100 ميكرولتر. أضف cDNA والمسبار إلى جدار أنبوب الطرد المركزي كإجراء احترازي لضمان إضافة الحجم وتجنب الاختلاط المتبادل لأي كاشف.
  14. ضع شرائط 8 آبار في مبرد PCR. انقل 5.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي والقارورة المحتوية على مسبار إلى قاع كل بئر في شرائط 8 آبار. وفقا لذلك ، كرر الخطوة لجميع الجينات المستهدفة.
  15. انقل 4.5 ميكرولتر من مزيج cDNA و NFW إلى جدار البئر في شرائط ذات 8 آبار. وفقا لذلك ، كرر الخطوة لجميع العينات.
  16. أغلق الشرائط بالأغطية وأعط دورة قصيرة مدتها 10 ثوان لخلط الجينات والعينات في البئر. ضع الشريط في فتحة عينة qRT-PCR وأغلق الفتحة.
  17. على سطح المكتب ، قم بتشغيل البرنامج وتسجيل الدخول كضيف. ستظهر نافذة منبثقة على الشاشة. انقر فوق متابعة بدون اتصال.
  18. في قائمة الإعداد ، انقر فوق إعداد متقدم. في خصائص التجربة، اكتب اسم التجربة في علامة التبويب اسم التجربة. في أي نوع من التجربة تريد إعداد الخيار ، حدد الكمية-CT المقارنة (Δδ CT).
  19. في أي سرعة منحدر تريد استخدامها في الأداة؟ علامة التبويب ، انقر فوق سريع (~ 40 دقيقة لإكمال التشغيل). في قائمة إعداد اللوحة، قم بتعريف أسماء الجينات في خيار تعريف الأهداف واكتب أسماء العينات في تعريف العينات.
  20. في علامة التبويب أسلوب التشغيل ، اكتب 10 ميكرولتر في حجم التفاعل لكل بئر. قبل عقد المرحلة مباشرة ، انقر فوق إضافة مرحلة وحدد مرحلة الانتظار. تغيير درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية والوقت إلى 2 دقيقة. في مرحلة الحجز الثانية ، لا تقم بإجراء أي تغييرات ، والتي ستكون 95 درجة مئوية لمدة 1 ثانية.
  21. في مرحلة ركوب الدراجات الخطوة 1 ، قم بتغيير درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية والوقت إلى 3 ثوان. في الخطوة 2 ، قم بتغيير درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية والوقت إلى 30 ثانية. انقر فوق تشغيل لبدء دورة qRT-PCR.

12. التحليل الإحصائي

ملاحظة: بالنسبة لجميع البيانات ، يتم تمثيل المتوسط كشريط ، ويمثل الانحراف المعياري شريط الخطأ في الرسم البياني الشريطي (القيمة p< 0.05 يعتبر مهما).

  1. افتح برنامج تحليل البيانات وأدخل البيانات التي تم الحصول عليها من التجربة البؤرية.
  2. لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر ، قم بتطبيق ANOVA العادي أحادي الاتجاه مع اختبار تصحيح Tukey لمقارنة مجموعات متعددة لتعبير GFP. ضع في اعتبارك البيانات التي تحتوي على p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. قم بإعداد تمثيل بياني للبيانات مع تمثيل المتوسط كشريط والانحراف المعياري الذي يمثل شريط الخطأ.
  3. لفحص تحميل الطفيليات ، قم بإنشاء ورقة جديدة وأدخل بيانات عدد الطفيليات ل 100 بلاعم. قم بتطبيق ANOVA العادي أحادي الاتجاه مع تصحيح Tukey بين جميع العينات. ضع في اعتبارك البيانات ذات القيمة الاحتمالية < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
  4. بالنسبة إلى ELISA ، قم بإجراء ANOVA ثنائي الاتجاه باستخدام اختبار المقارنات المتعددة من Tukey. بالنسبة إلى qRT-PCR ، قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام اختبار تصحيح Tukey.

النتائج

يوضح ترتيب الأجزاء الوراثية التي تشكل الدائرة الاصطناعية للتعبير عن الدائرة الاصطناعية (الشكل 1 أ). تم استنساخ الأجزاء المقابلة في متجه pEGFP-N1 بطريقة متعامدة ومعيارية ، والتي يتم تمثيلها في الشكل 1B. كشفت محاكاة الدائرة الاصطناعية عن ديناميكيات تذبذبية في كل ...

Discussion

تؤكد النتائج التي تم الحصول عليها على كفاءة خط الأنابيب ، الذي تم توجيهه لتصميم وتنفيذ دائرة اصطناعية. كان بناء هذه الدائرة الاصطناعية خطوة نحو تطوير الطب الدقيق للأمراض المعدية مثل داء الليشمانيات. من خلال التجميع السيليكو للأجزاء الجينية والمحاكاة الحتمية ، تم رصد التأثير التعديل...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا مدير مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والابتكار - المركز الوطني لعلوم الخلية (BRIC-NCCS) ، بيون لدعم أبحاثنا ومرفق المعلوماتية الحيوية BRIC-NCCS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestriction digestion
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFischer ScientificD1306nuclear staining
50mL tubeCorning352070
60mm platesFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plateThermoFischer Scientific160376For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539For AGE
Agarose gel electrophoresis assemblyGeNei93For AGE
Bacterial laminar flowESCO Lifesciences2120765For transformation
Calcium chlorideMerckC4901Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flowThermoFischer Scientific1323TSFor cell culture
Cell scraperGenetix90020For cell culture
Cell spreaderFischer Scientific12822775
Centrifuge for 1.5mL tubesEppendorfEP5404000537
Centrifuge for 50mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3For RNA isolation
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110For cell culture
CuvetteEppendorf6138000018Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023For RNA isolation
DoxycyclineMerck33429For induction of transfected cells
Dry heating blockLabnetFor transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle MediumNational centre for cell scienceFor cell culture
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromideSigmaE7637For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acidFischer Scientific12635Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscopeThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine SerumGibco16000-044For cell culture
FV31S-SW softwareOlypmusImage acquisition
GeneticinGibco1563411for transfection
Gibson assembly method for cloningBIOMATIKConstruction of synthetic circuit
Graphpad prismGraphpadStatistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814for cDNA synthesis
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagent preparation
KanamycinSigma60615For transformation and colony selection
Luria Bertini brothHimediaM1245For culturing E.coli
Magnesium chlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032For qRT-PCR
Microwave ovenLGMC-7649DWFor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPFor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker AgitatorDIAB
National centre for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfor contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamberMarienfeld superior640010For cell count
Non-vented 25cm2 flaskCorning353014For culturing parasite
NotIBioLabsR3189MRestriction enzyme
Nuclease free waterBiodesign1QIAReagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusImage processing
Olympus FV 3000OlympusFor confocal imaging
OPTI-MEM mediaGibco31985070media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuitBiomatik
PenicillinThermoFischer Scientific15070063For cell culture
PolyethylenimineMERCK764965for transfection
Potassium AcetateFischer ScientificYBP364500Buffer /Reagent preparation
Potassium ChlorideFischer ScientificBP366Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate MonobasicSigmaP5655Buffer /Reagent preparation
Power supply packBIORAD1645070For AGE
Registry of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefor contruction of synthetic circuit
RNAiso PlusTakara38220090For RNA isolation
RNase AThermoFischer Scientific12091021Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute MediumNational centre for cell scienceFor culturing parasite
Shaker incubatorREMICIS 24 plusFor culturing E.coli
Sodium chlorideQualigensQ27605Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771Buffer /Reagent preparation
Sodium HydroxideFischer Scientific15895Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Buffer /Reagent preparation
SpectrophotometerEppendorfEstimation of plasmid concentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR systemLife technologies272006777For qRT-PCR
StepOne software version 2.3Life technologiesFor qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellSynthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFischer Scientific10488085For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorideHimediaMB029Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Buffer /Reagent preparation
Trypan blueSigmaT8154For cell count
XhoIBioLabsR0146SRestriction enzyme

References

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241 (2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588 (2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670 (2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125 (2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749 (2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431 (2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276 (2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118 (2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132 (2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763 (2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466 (2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823 (2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. . The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908 (2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031 (2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315 (2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved