Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para projetar, construir e fornecer circuito sintético induzível baseado em tetraciclina controlado. O efeito dos circuitos sintéticos na eliminação do parasita e na expressão de citocinas pode ser estudado canalizando o pipeline apresentado. Este protocolo é relevante para pesquisadores que estudam a terapêutica baseada em circuitos sintéticos em doenças infecciosas.

Resumo

O imunometabolismo é um determinante fundamental na progressão da leishmaniose. A abordagem baseada na biologia sintética atraiu atenção significativa como um passo em direção à intervenção terapêutica direcionada aos fatores associados ao hospedeiro que impulsionam a leishmaniose. A biologia sintética envolve a engenharia de componentes genéticos de maneira ortogonal e modular para modular com precisão No estudo apresentado, a elucidação de um pipeline sistemático para o desenvolvimento de um circuito sintético controlado por tetraciclina induzível (TetON) teve como objetivo fornecer succinato desidrogenase como agente terapêutico para facilitar a eliminação de parasitas intracelulares de Leishmania . O protocolo descrito descreve o projeto de um circuito sintético e sua posterior validação. A estratégia proposta também se concentra na incorporação de circuitos sintéticos no esqueleto do plasmídeo como veículo de entrega. Além disso, máquinas de entrega empregando nanopartículas baseadas em poliplexos para a entrega de circuitos sintéticos foram usadas em linhagens celulares de macrófagos murinos sem comprometer a morfologia celular. A padronização do método foi conduzida para selecionar células transfectadas e determinar a concentração de indução ótima para a expressão do circuito sintético. As observações revelam uma redução distinta na carga parasitária intracelular em células transfectadas em comparação com células infectadas. Citocinas pró-inflamatórias foram expressas pós-infecção em células transfectadas e induzidas em circuito sintético como um mecanismo para promover a eliminação do parasita. Isso ressalta o método baseado em biologia sintética como uma abordagem potente na leishmaniose, visando os fatores do hospedeiro associados à progressão da doença.

Introdução

O avanço da medicina holística e integrativa é uma ligação significativa que foi identificada entre alterações metabólicas nas células imunes e sua capacidade de modular o fenótipo das células imunes em doenças infecciosas. O imunometabolismo oferece novas perspectivas para elucidar a patogênese das doenças infecciosas prevalentes em humanos. Além disso, fornece técnicas promissoras para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos, identificando novos alvos para intervenção¹. A reprogramação metabólica das células imunes é identificada em várias doenças infecciosas, incluindo a leishmaniose. Leishmania spp. é responsável por causar leishmaniose, sendo que Leishmania major (L. major) causa leishmaniose tegumentar (LC). Os parasitas L. major provocam um impacto significativo no metabolismo das células hospedeiras, particularmente em macrófagos, para proliferação e sobrevivência como parasitas intracelulares². Os macrófagos podem normalmente polarizar em subconjuntos classicamente ativados (M1) ou alternativamente ativados (M2), onde as células M1 possuem alta secreção de citocinas pró-inflamatórias e produção de óxido nítrico (NO) através do metabolismo de espécies de nitrogênio. As células M2 exibem níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e exibem alta atividade de arginase através do metabolismo do nitrogênio³. Assim, ambos os fenótipos diferem não apenas por sua resposta imune, mas também por suas vias metabólicas.

A biologia de sistemas da leishmaniose visa identificar alvos moleculares para o design de novas terapêuticas por meio do design e desenvolvimento de medicamentos. A reconstrução de redes de sinalização e vias metabólicas auxilia na compreensão da leishmaniose como um modelo holístico e extrai insights para a identificação do principal componente que impulsiona o estado de doença. A modelagem matemática é uma das abordagens analíticas aplicadas mais favorecidas para a compreensão das complexidades da leishmaniose⁴. Redes imunometabólicas e modelos matemáticos permitiram a identificação da succinato desidrogenase (SDHA) como um componente chave do fenótipo M1, que é expresso para eliminar o parasita⁵. A biologia sintética tem aplicações em diagnósticos, desenvolvimento de vacinas e terapêutica na leishmaniose. O metabolismo direcionado à modulação da resposta imune pode ser alcançado por meio de ferramentas de biologia sintética. Para a modulação da inositol fosforil ceramida sintase, que regula o metabolismo esfingolipídico e altera a sinalização imune do hospedeiro, um circuito genético que possuía comportamento biestável foi usado para ajustar sinteticamente a robustez intrínseca do modelo de infecção por L. major ^6,7. Assim, os sistemas e a biologia sintética podem fornecer uma plataforma de engenharia genética baseada em modelo para o desenvolvimento da medicina de precisão no sistema modelo de Leishmania.

O fenótipo M1 é marcado pela expressão de redes de sinalização imunometabólica onde a produção de citocinas inflamatórias e vias metabólicas aumenta sinergicamente a eliminação do parasita. A polarização M1 significa a produção de citocinas pró-inflamatórias, como Interleucina-12 (IL-12), interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). As vias metabólicas altamente enriquecidas no fenótipo M1 incluem glicólise, via da pentose fosfato e ciclo truncado do ácido tricarboxílico (ciclo TCA)⁵. O ciclo truncado do TCA direciona o maquinário de eliminação de parasitas por meio do aumento dos níveis de succinato e citrato, que orientam a produção de NO³. O acúmulo de succinato pelo SDHA leva à ativação do fator de transcrição induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-1α), que induz a produção de IL-1β⁸. No fenótipo M2, observa-se oxidação de ácidos graxos, aumento da utilização de glutamina e aumento da fosforilação oxidativa da glicose, juntamente com a produção de citocinas anti-inflamatórias, como Interleucina-10 (IL-10), Fator de crescimento transformador beta (TGF-β), Interleucina-4 (IL-4) e Interleucina-13 (IL-13)³. M2 exibe mitocôndrias alongadas como uma característica distintiva, levando a uma maior eficiência na geração de energia. Eles utilizam ácidos graxos, glicose e glutamina como substratos para alimentar o ciclo do TCA, gerando ATP por meio da fosforilação oxidativa a uma taxa mais alta para promover o crescimento e a proliferação do parasita⁹. A enzima SDHA responsável pelo acúmulo de succinato por meio de TCA truncado pode não apenas promover a produção de NO, mas também iniciar um consumo de oxigênio dependente de succinato por meio do transporte de elétrons¹⁰. Em macrófagos infectados por Leishmania, o SDHA é regulado negativamente em 2,17 vezes, indicando que a respiração aeróbica também pode ser regulada negativamente¹¹. Para aumentar o consumo de succinato para induzir a produção de NO mediada por citocinas pró-inflamatórias e promover a eliminação do parasita, a expressão de SDHA é essencial.

O circuito sintético oferece terapias direcionadas com precisão que podem alterar o sistema doente para alcançar uma oscilação biestável que pode restaurar o fenótipo saudável no nível espaço-temporal. A entrega e expressão do circuito sintético tornam o sistema dinâmico e robusto. Um fator fundamental que contribui para o avanço da biologia sintética reside na capacidade de montar partes e elementos genéticos de forma modular para permitir a geração de arquiteturas intrincadas e funcionalidades personalizadas¹². As restrições associadas às técnicas tradicionais de expressão estimularam o surgimento de circuitos sintéticos de plasmídeo induzíveis baseados em operon de tetraciclina, permitindo assim uma avaliação rápida do plasmídeo e fácil entrega em vários tipos de células¹³. A proteína repressora responsiva à tetraciclina (TetR), quando existente como dímero, exibe forte afinidade de ligação ao operon tet (TetO), suprimindo efetivamente a transcrição. No entanto, após a interação de seu ligante, a doxiciclina (dox), o TetR sofre uma alteração estrutural, resultando em sua dissociação do TetO, consequentemente permitindo que a transcrição prossiga sem impedimentos. Este circuito pode exibir controle de tradução de proteínas¹⁴. Portanto, por meio da metodologia definida, o circuito sintético de plasmídeo induzível baseado em operon de tetraciclina projetado foi habilitado a expressar SDHA no vetor pEGFP-N1. A avaliação da eficiência de transformação do circuito e seu rendimento forneceu informações sobre a competência de entrega. Através da digestão restrita do vetor, a determinação da eficiência de clonagem foi confirmada. Além disso, uma linha celular de macrófagos de camundongo RAW264.7 transfectada derivada de macrófagos peritoneais de camundongos Balb / c foi observada para a expressão da proteína fluorescente verde dependente da dose de doxiciclina (GFP) em células transfectadas. Além disso, o efeito de eliminação do parasita em células transfectadas foi corroborado com uma expressão do circuito sintético. Além disso, foram observadas indução e expressão de citocinas pró-inflamatórias, que foi direcionada por um aumento no momento da infecção no circuito sintético transfectado e induzido pelas células, o que foi diretamente associado ao funcionamento do circuito sintético.

Protocolo

1. Cultura celular de células RAW264.7

NOTA: Use números de passagem baixos para experimentação. A linhagem celular RAW264.7 foi adquirida do repositório nacional de células do Conselho de Inovação em Pesquisa em Biotecnologia-Centro Nacional de Ciências Celulares (BRIC-NCCS), Pune. Como a linhagem celular RAW264.7 é uma linhagem celular de macrófagos, ela pode começar a se diferenciar com o aumento das passagens. Depois de reviver as células, use a linha celular para transfecção após 2 passagens.

1. Semear 5 x 10⁵ células da linhagem celular RAW264.7 em um frasco de 25 cm² suplementado com 5 mL de Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 100 UI / mL de penicilina como meio completo.
2. Manter as células para crescimento e proliferação em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 °C até que 90% de confluência seja alcançada.
3. Descarte a mídia e lave 3x com 1x tampão fosfato salino (PBS). Adicione 1 mL de PBS ao frasco, raspe as células usando um raspador e colete as células em um tubo de 1,5 mL.
4. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min a 24 °C e ressuspenda o pellet utilizando uma pipeta de 1 ml em 1 ml de meio DMEM completo.
5. Conte as células na câmara de contagem de células usando azul de tripano a 0,5% para identificar a porcentagem de células vivas.

2. Cultura celular do parasita L. major

NOTA: Promastigotas de L. major (MHOM/Su73/5ASKH) foi um presente do BRIC-NCCS. As promastigotas devem ter um número de passagem menor que 10. O menor número de passagens garante que o parasita esteja saudável e sua capacidade de infectar macrófagos seja maior.

1. Cultive promastigotas de L. major (MHOM/Su73/5ASKH) em Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) suplementado com 20% de FBS como meio completo.
2. Semear 1 x 10⁶ promastigotas em balão não ventilado^{de 25 cm 2} contendo 5 ml de meio completo. Incubar o frasco a 27 °C durante 5 dias e observar a fase estacionária do parasita promastigota L. major a 20x num microscópio de campo claro.
   NOTA: Os promastigotas em fase estacionária podem ser alcançados em 4-7 dias após o cultivo. Eles são caracterizados por seu estado flagelado alongado e motilidade reduzida.

3. Projetando um circuito sintético em plasmídeo como vetor de entrega

1. Projetando partes do circuito sintético
   1. Abra o software da célula Tinker e prossiga para a guia Peças. Selecione o componente Promotor na biblioteca e coloque-o na tela para simbolizar o promotor do citomegalovírus (CMV) dentro do circuito sintético. Recupere o local de ligação do repressor, análogo ao TetO, na guia Peças e posicione-o adjacente ao promotor na tela, integrando-o perfeitamente ao promotor CMV.
   2. Incorpore o operador de tetraciclina (TetO), os locais de entrada do ribossomo interno (IRES) e a região de codificação arrastando e soltando o local de ligação do repressor, o local de ligação do ribossomo (rbs) e a região de codificação na tela, integrando-os aos componentes genéticos existentes.
   3. Renomeie a região de codificação como TetR, denotando o repressor responsivo à tetraciclina, que funciona como um suposto regulador negativo dentro do circuito sintético. Mescle esses elementos genéticos para facilitar a construção das peças sintéticas.
   4. Incorpore uma região espaçadora (sd1) na tela, projetada para ser clivável por proteases celulares como o teschovírus-1 suíno 2A (P2A). Introduza uma região codificante adicional representando o gene de interesse, rotule-o como SDHA, para a construção sintética e integre-o com os outros elementos.
   5. Adjacente à região codificadora SDHA, integre outra região espaçadora clivável de protease (sd2), que será clivável pela protease celular P2A. Introduza uma região codificante que represente o gene repórter e rotule-a como GFP na construção.
      NOTA: A expressão GFP pode fornecer uma estimativa para a produção de SDHA e garantir que o circuito sintético tenha um funcionamento lógico¹³.
   6. Ao lado de GFP, anexe um terminador (ter1) e verifique as peças montadas verificando se todas as peças estão conectadas. O circuito deve aparecer em vermelho ao clicar em qualquer peça. Isso confirma a formação de um circuito genético funcional.
   7. Na guia Reação, atribua taxas regulatórias, que incluem parâmetros e valores iniciais para a produção de proteínas, a TetR, SDHA e GFP para delinear a reação de tradução dentro do circuito sintético.
   8. Adicione uma pequena molécula da guia Peças, nomeie-a como Doxiciclina (dox) e atribua uma função de onda a ela selecionando Entrada na guia Peças e Conexão e, em seguida, clicando em Entrada de onda.
   9. Na guia Regulamento , clique em Reação de Repressão. Arraste e solte a Taxa de Reação na tela entre dox e TetR. Defina a cinética de reação entre dox e TetR clicando duas vezes no ícone Wave Function em dox e ajustando Doxyxycline.sin.amplitude para 10.
   10. Implemente a reação regulatória transcricional entre a proteína TetR e o local de ligação do repressor selecionando a reação na guia Regulação e colocando-a na tela entre TetR e TetO.
   11. Ao clicar duas vezes em cada componente e reação, defina uma concentração inicial e um parâmetro para simulação. Clique em Simulação, escolha Determinístico e simule o circuito para 100 unidades de tempo. Ajuste o gráfico de simulação no painel de controle, que aparece com o gráfico, e observe o padrão do gráfico para as proteínas SDHA e TetR.
2. Identificação de componentes genéticos a partir do registro de peças iGEM
   1. Abra o Registro de Peças Biológicas Padrão (Tabela de Materiais) e clique em Pesquisar. Digite o nome do componente genético, por exemplo, promotor do CMV.
      NOTA: O processo de pesquisa do iGEM ID deve ser realizado para todos os componentes genéticos do circuito sintético. As etapas para identificar o ID iGEM do promotor do CMV estão listadas; Posteriormente, as etapas devem ser repetidas para outros componentes.
   2. Para obter a sequência de nucleotídeos do promotor do CMV, clique na opção Obter sequência de peças e salve o arquivo como um arquivo de texto.
      NOTA: É crucial observar que estoques de todas as partes genéticas estão disponíveis.
   3. Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2 para todas as partes genéticas (operador de tetraciclina, sequência de Kozak, TetR, P2A e GFP), exceto SDHA.
   4. Para obter a sequência codificadora de proteínas do SDHA, abra o NCBI e escolha Nucleotídeo no menu suspenso ao lado da janela de pesquisa. Digite Succinato desidrogenase e Mus musculus e procure a sequência de nucleotídeos.
   5. Clique na opção CDS para obter a sequência de codificação do SDHA e salve a sequência em um arquivo de texto.
   6. Mescle a sequência de nucleotídeos de todas as partes reguladoras genéticas em um arquivo sequencialmente. Adicione o códon de início (ATG) logo após a sequência de Kozak e remova os códons de parada internos para evitar a formação de polipeptídeos nascentes.
   7. Abra o site¹⁵ do ExPASy e cole a sequência de nucleotídeos. Clique na opção Traduzir a sequência . Selecione 5'3' Quadro 1 e remova os códons de parada, que serão destacados em vermelho na seção de resultados.
      NOTA: Para identificar se a sequência de nucleotídeos está efetivamente se traduzindo na sequência polipeptídica desejada, uma ferramenta de tradução como o ExPASy pode ser empregada. Isso garante a prevenção de polipeptídeos nascentes indesejados. A seleção do vetor pEGFP-N1 para expressar o circuito sintético é ótima, uma vez que o promotor do CMV e o gene GFP eram pré-existentes dentro do vetor. Todas as partes genéticas foram montadas usando um protocolo de clonagem (que foi terceirizado). As enzimas de restrição utilizadas para clonar as inserções são NotI e XhoI. Esses sítios de enzimas de restrição estão localizados dentro do sítio de clonagem múltipla do vetor pEGFP-N1.

4. Transformação do circuito sintético em células DH5α de Escherichia coli (E.coli)

1. Preparação de células competentes para E.coli DH5α
   NOTA: Recomenda-se a autoclavagem dos reagentes. Os reagentes podem ser armazenados a 4 °C até à utilização.
   1. Cultive 1 mL de inóculo fresco em 50 mL de Caldo Luria (LB) a 37 °C, 180 rpm. Cultive as células por aproximadamente 2 h até que uma densidade óptica (OD) de 0,4-0,6 seja alcançada a 600 nm.
   2. Centrifugar as células a 4.696 x g a 4 °C durante 15 min. Rejeitar manualmente o sobrenadante no balão de descarte, invertendo o tubo de centrifugação de 50 ml e colhendo o sedimento celular.
   3. Ressuspenda suavemente o pellet em 2 mL de cloreto de magnésio 0,1 M gelado (MgCl2) usando uma pipeta de 1 mL. Aumente o volume até 20 mL com MgCl 2 gelado_.
   4. Centrifugar o tubo a 4,696 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda suavemente as células usando uma pipeta de 1 mL em 1 mL de cloreto de cálcio 0,1M gelado (CaCl₂) e incube em gelo por 2 h. Use as células competentes recém-feitas para transformação.
2. Transformação de células competentes com construção de circuito sintético
   1. Meça 50 μL de células competentes e adicione as células em um tubo de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo. Adicione 10 ng de construção de circuito sintético à alíquota e mantenha no gelo por 3 min.
   2. Aquecer as células de choque a 42 °C durante 3 minutos num bloco de aquecimento seco. Quando a incubação no bloco de aquecimento seco estiver concluída, coloque as células de volta no gelo por 3 min, adicione 1 mL de LB às células e incube a 37 ° C por 1 h a 250 rpm.
   3. Quando a incubação estiver completa, centrifugue as células a 4.696 x g à temperatura ambiente (RT) por 5 min e descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL. Ressuspenda as células em 100 μL de LB e coloque-as em ágar LB contendo 50 μg / mL de canamicina. Inverter a placa e incubar a 37 °C durante 24 h.

5. Isolamento da construção do circuito sintético

1. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, pegue 10 mL de meio LB e adicione 50 μg / mL de canamicina como um caldo de seleção para cultivar células transformadas para isolamento de plasmídeo. Pegue uma colônia transformada usando uma ponta de 200 μL e adicione-a ao caldo de seleção.
2. Utilizando uma alça de inoculação, seleccionar outra colónia única, riscar uma placa utilizando a técnica pentagonal e incubar a 37 °C durante 24 h para manter isolados de colónia única.
3. Cultive as células durante a noite a 180 rpm a 37 °C. No dia seguinte, centrifugue a cultura a 4.696 x g por 20 min a 24 °C. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante invertendo o tubo e adicionar 1 ml de tampão de ressuspensão [cloridrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl) 50 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10 mM), 100 μg/ml de RNase A (pH-8,0)] ao sedimento e ressuspender as células pipetando suavemente.
   NOTA: Para ressuspender o tampão, adicione RNase A 5 min antes de adicionar a mistura ao pellet celular.
4. Incubar a mistura durante 5 min em RT. Adicionar 1 ml de tampão de lise [hidróxido de sódio (NaOH) a 0,2 N, dodecil sulfato de sódio a 1% (SDS)] às células e misturar invertendo o tubo durante 2 min. Incube o tubo por 5 min em RT.
5. Adicione 1 mL de tampão de neutralização às células (acetato de potássio 3 M (CH₃CO₂K)) e misture invertendo o tubo várias vezes. Centrifugar as células a 4.696 x g durante 20 min à RT e recolher o sobrenadante num tubo de 1,5 ml.
6. Adicione 500 μL de isopropanol ao sobrenadante e misture bem invertendo. Incubar o sobrenadante no gelo durante 15 min e depois centrifugar a 12.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   NOTA: A incubação pode variar de 5 min a 1h. Durante isso, é aconselhável misturar suavemente o conteúdo invertendo a cada 5 min.
7. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de etanol a 70% (refrigerado) ao pellet e centrifugar a 12000 x g durante 5 min a 4 °C. Repita esta etapa mais uma vez.
8. Seque o pellet e ressuspenda o plasmídeo obtido em 20 μL de água estéril livre de nuclease (NFW). Medir a concentração de plasmídeo num espectrofotómetro no comprimento de onda de 260/280 nm.
   NOTA: Adicione mais NFW se a concentração de plasmídeo for muito alta para ser estimada através de nanodrop. O processo de diluição do plasmídeo deve ser realizado em uma capela laminar.

6. Eletroforese em gel de agarose (AGE) do circuito sintético

1. Preparação de amostra de plasmídeo para AGE
   1. Em um tubo de 1,5 mL, meça 20 μL de 1x Tris-acetato-EDTA (TAE). Adicione 4 μL de tampão de carga 6x e misture bem pipetando.
   2. Dê uma rotação rápida ao tubo, adicione 1 μg do vetor plasmídeo do circuito sintético e misture bem pipetando a mistura. Esta mistura de reação pode ser carregada em gel de agarose.
      NOTA: Evite pipetagem rigorosa, pois pode danificar a estrutura do plasmídeo. Em vez disso, dê uma volta rápida para misturar reagentes.
2. Digestão de restrição do circuito sintético
   1. Em um tubo de 1,5 mL, adicione 2 μL de tampão de restrição 10x, 1 μL de NotI e 1 μL de enzima de restrição XhoI e misture bem, girando rapidamente o conteúdo. Adicione 1 μg de vetor de plasmídeo de circuito sintético e gire rapidamente o conteúdo.
   2. Aumente o volume do tubo para 20 μL adicionando NFW ao conteúdo e girando rapidamente o tubo. Incubar o tubo a 37 °C durante 1 h.
   3. Após a incubação, manter o tubo a 70 °C durante 15 min num bloco de aquecimento seco para desativar as enzimas de restrição. Resfrie o conteúdo do tubo e adicione 6 μL de tampão de carga à mistura de reação. Misture o conteúdo dando uma rotação rápida no tubo. Esta mistura de reação pode ser carregada em gel de agarose.
   4. Configure o gel de agarose e execute-o usando um protocolo descrito anteriormente¹⁶. Resumidamente, carregue 20 μL de amostras em cada poço, carregue 5 μL de escada de DNA de 1 Kb e execute o gel a 100V. Desconecte a fonte de alimentação após a conclusão da eletroforese, adquira o gel em um gerador de imagens de gel e ative a opção de fluorescência para visualizar as bandas.

7. Transfecção da construção do circuito sintético na linhagem celular RAW264.7

1. Preparação das amostras
   1. Preparar amostras para determinar o efeito de eliminação do parasita por circuito sintético induzido. A primeira amostra são células RAW264.7 não transfectadas (controle), a segunda são células RAW264.7 infectadas com promastigotas de L. major por 6 h (6 h infectadas), a terceira amostra foi de células RAW264.7 transfectadas com circuito sintético e induzidas com dox (IMT), as amostras de ponto de tempo de infecção são células RAW264.7 transfectadas com circuito sintético e induzidas com dox infectado com L. major promastigotas (IMTI) para diferentes momentos 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) e 24 h (24 h IMTI).
   2. Para preparar todas as amostras, raspar as células RAW264.7 de um balão de 25 cm² e centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT.
   3. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo DMEM. Pegue 10 μL das células ressuspensas em um tubo de 100 μL, adicione 10 μL de azul de tripano a 0,5% às células e misture bem.
   4. Carregue 10 μL de mistura de célula e azul de tripano na lâmina da câmara de contagem de células e tire a contagem de células de 4 câmaras.
   5. Células da placa no fundo da lamínula 96 placas de poço a 2 x 10⁴ células por poço e incubar as células por 24 h. Esta amostra é a amostra de controle. Esta etapa permanece constante para a preparação de outras amostras.
      NOTA: Pré-aqueça o meio a 37 °C em banho-maria antes de usar.
   6. Para preparar uma amostra infectada de 6 h, centrifugue 1 mL de promastigotas L . major em fase estacionária a 7.273 x g por 10 min. Ressuspenda o pellet em 500 μL de meio completo DMEM e faça a contagem de células em uma câmara de contagem de células seguindo as etapas 7.1.3-7.1.4.
   7. Adicione 2 x 10⁵L. promastigotas principais ao poço e incube-os com 5% de CO₂ a 37 ° C por 6 h. Após a incubação, lave as células 3x com PBS.
   8. Para preparar a amostra IMT, semeie as células seguindo as etapas (7.1.2-7.1.5) e execute as etapas de transfecção 7.2.1-7.2.6.
   9. Para preparar amostras de pontos de tempo de IMTI, siga as etapas 7.1.2-7.1.5 e execute as etapas de transfecção 7.2.1-7.2.6. Descarte o meio completo DMEM contendo 500 μg / mL de Geneticina (G418) e 1 μg / μL dox e lave as células 3x com 1x PBS.
   10. Adicione 2 x 10⁵L. promastigotas principais aos poços e incube-os por 6 h, 12 h, 18 h e 24 h. Pós-infecção, descartar as promastigotas contendo meio completo de DMEM e lavar os poços 3x com 1x PBS. Adicione 200 μL de meio completo DMEM contendo 500 μg / mL de Geneticina (G418) e 1 μg / μL de dox às células e incube por 24 h.
2. Transfecção de circuito sintético
   1. Em um tubo de 1,5 mL, adicione 24 μL de meio de soro reduzido, que é um meio essencial mínimo aprimorado. Ao meio, adicione 1 μg de vetor pEGFP-N1 clonado com plasmídeo de circuito sintético.
   2. Em um tubo novo de 1,5 mL, adicione 24 μL de meio essencial mínimo e adicione 1 μL de polietilenonimina (PEI; 1 μg / μL). Misture bem pipetando a mistura pelo menos 10x e incube em RT por 5 min.
   3. Transfira a mistura de PEI para o tubo de 1,5 ml que contém a mistura de ADN. Misture bem pipetando gota a gota pelo menos 10x. Incube o DNA: mistura PEI em RT por 10 min.
   4. Descarte a mídia dos poços nas placas inferiores da lamínula de 96 poços e lave as células 3x com PBS. Usando uma pipeta, adicione suavemente o DNA: PEI gota a gota às células e agite suavemente a placa. Incubar as células com 5% de CO₂ a 37 °C durante 3 h.
   5. Após a incubação, adicione 200 μL de meio essencial mínimo fresco às células, agite suavemente a placa e incube por 24 h com 5% de CO₂ a 37 ° C.
      NOTA: PEI é citotóxico; portanto, recomenda-se não incubar células após a transfecção por mais de 24 h.
   6. No dia seguinte, descarte a mídia e lave as células 2x com PBS. Adicione meios completos de DMEM contendo 500 μg / mL de Geneticina (G418) e 1 μg / μL de dox às células e incube por 24 h.
3. Fixação das amostras para microscopia confocal
   1. Para fixar todas as amostras, lave as células com 1x PBS 3x, adicione 100 μL de paraformaldeído a 4% às células e incube em RT por 10 min.
   2. Lave as células com PBS 3x. Após a conclusão da lavagem, adicione 1 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) às células e incube em RT por 15 min no escuro.
   3. Após a incubação, lave as células 3x com PBS. Observe as células sob um microscópio confocal para expressão de GFP e coloração DAPI.

8. Aquisição de células transfectadas por microscopia confocal e quantificação

1. Limpe o fundo da lamínula dos poços com lenço absorvente. Ligue os controles do microscópio confocal de varredura a laser. Em seguida, ligue o compressor e a lâmpada de mercúrio.
2. Para operar a máquina, os controles do microscópio, o controle do cabeçote de varredura, a chave laser, o módulo laser, a lâmpada, o controlador do microscópio e a CPU devem ser ligados sequencialmente.
3. No computador, abra o software (Tabela de Materiais) e clique em Ativar Controle de Estágio XY. Um pop-up será aberto solicitando a execução da limpeza para o 7S3. Clique em Não. Feche o gráfico ao vivo e ajuste as telas de configuração.
4. Para a objetiva 60x, adicione uma gota de óleo de imersão, coloque a placa inferior da lamínula da placa de 96 poços no platina e mova a platina no plano XY para ajustar a posição da objetiva no poço. Clique na Ocular e selecione Canal Alexa-488. Clique em Obturador desligado para focar as células na ocular. Ajuste a ocular por núcleo e foco fino.
5. Clique em Obturador Ligado presente na caixa de controle do microscópio e mova a objetiva para ajustar sua posição e focar a área de interesse para observar as células em Contraste de Interferência Diferencial (DIC). Mude para o modo EPI na caixa de controle do microscópio para observar as células no filtro de comprimento de onda Alexa-488 para expressão de GFP. As células devem aparecer verdes.
6. Clique em Obturador desligado, vá para a imagem LSM e escolha a resolução da imagem como 1.024 x 1.024. Clique em Adicionar fase e arraste para adicionar um canal verde como uma fase.
7. No programa Olympus, clique em LSM e clique no botão Live para observar as células em contraste de fase e o canal Alexa 488nm. Pressione Control e role para focar as células do software para capturar imagens.
8. Ajuste o ganho e o deslocamento para ajustar a intensidade de fluorescência capturada pelo detector. Clique em Capturar, nomeie as imagens e clique em Salvar.
9. No software de imagem, clique em Arquivo, selecione todas as imagens com a extensão .oir e clique em Abrir.
10. Clique em Tile View para visualizar imagens em todos os canais. Para adicionar uma barra de escala às imagens, clique em Exibir e escolha a opção Barra de escala .
11. Para salvar imagens de canais únicos como tons de cinza de 16 bits, clique em Arquivo e selecione Exportar imagem. Selecione a imagem e verifique as marcas de verificação em todos os canais. Na guia selecionar quadro na opção de exibição dividida, escolha Sim. Na guia de saída, escolha a cor RGB de 24 bits com a opção de informações de gravação e escolha tiff como o tipo de arquivo para a imagem. Na pasta exportar para, escolha o local de arquivo apropriado para salvar as imagens e clique em OK.
12. Para salvar imagens mescladas, siga as mesmas etapas, exceto, na opção de visualização dividida, escolha Não e, na guia de saída, escolha Canais mesclados com informações de gravação.
13. Para analisar a expressão de GFP nas células, abra Fiji no Windows e exporte o arquivo tiff. Selecione a cor verde para analisar a expressão GFP.
14. Selecione a área da célula usando a opção de ferramenta à mão livre e clique em Analisar para medir a intensidade da fluorescência. Repita o processo para 3 imagens.
15. Exporte os dados para um software de análise e realize testes estatísticos nos dados quantificados.

9. Ensaio de carga parasitária

1. Ao visualizar as células em um microscópio confocal, conte o número total de parasitas presentes em macrófagos individuais.
2. Examine aleatoriamente 100 macrófagos e observe o número de parasitas intracelulares. Teste estatístico realizado entre infectados e pontos de tempo de amostras IMTI para examinar o efeito da expressão de SDHA na contagem de parasitas.

10. Quantificação de IL-10 e IL-12 por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA)

1. Prepare as amostras de acordo com as etapas 7.1 e 7.2 e colete o meio em um tubo de 1,5 mL. Mantenha a mídia congelada ou armazene-a a -20 °C até uso posterior. Siga as instruções do manual do kit do usuário e execute o ELISA para IL-10 e IL-12.

11. Perfil de citocinas usando PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR)

1. Prepare as amostras de acordo com as etapas 7.1 e 7.2. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta e adicionar 500 μL de reagente TRIzol e incubar as células durante 2 min em RT.
   NOTA: As etapas de isolamento de RNA devem ser executadas em um gabinete de fluxo laminar como precaução de segurança contra contaminação por RNase.
2. Colete as amostras em um tubo de 1,5 mL, adicione 100 μL de clorofórmio a elas e misture invertendo os tubos 5x-8x. Incubar as amostras durante 15 min a RT. Centrifugar as amostras a 12 000 x g durante 15 min a 4 °C.
3. Três camadas serão observadas, coletar a camada superior aquosa transparente em um tubo fresco de 1,5 mL. Adicione 500 μL de isopropanol à camada aquosa, misture bem invertendo 10x e incube as amostras por 15 min em RT. A cada 5 minutos, misture as amostras novamente invertendo os tubos.
4. Centrifugue as amostras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e lave o pellet 2x com etanol 75% feito em pirocarbonato de dietila a 0,1% (DEPC) contendo água por 5 min e centrifugue a 8.000 x g a 4 °C.
   NOTA: DEPC contendo água degrada RNases e, portanto, é recomendável usá-lo para isolamento de RNA.
5. Por fim, secar ao ar o pellet durante 5 min a RT, dissolver-se em 20 μL de DEPC contendo água e medir a concentração de RNA isolado, proporção 260/280 e 260/230, utilizando um espectrofotómetro.
   NOTA: A proporção 260/280 deve ser de aproximadamente 2,0, o que geralmente é indicativo de uma forma pura de RNA, e a proporção 260/230 deve estar entre 2,0-2,2 para considerar que o RNA isolado está livre de compostos químicos indesejados, como o TRIzol.
6. Para a preparação de 20 μL de cada amostra de cDNA, descongele os reagentes no gelo e dê-lhes uma rotação curta por 15 s em RT. Dê uma rotação curta a todos os reagentes e até mesmo às amostras de RNA antes de usar.
7. Em um tubo autoclavado de 100 μL, tome 0,8 μL de 25x dNTP, 2 μL de 10x Primer, 2 μL de tampão 10x. Adicione 1 μg / μL de concentração de RNA e adicione 0,5 μL de enzima transcriptase reversa. Completar o volume para 20 μL usando DEPC contendo água.
8. Dê uma pequena rotação às amostras de cDNA por 1 minuto em RT. Mantenha as amostras no gelo.
9. Ligue o termociclador, desparafuse o painel superior para soltar o suporte e coloque as amostras no bloco. Depois de colocar as amostras, aperte bem a tampa.
10. Quando o sistema estiver ligado, clique em Executar. Selecione a opção Principal , entre no menu Programas e selecione a opção CDNA . Defina o volume de amostra como 20 μL e clique em EXECUTAR. O termociclador executa o programa em quatro etapas. O primeiro passo é de 25 °C por 10 min, o segundo é de 37 °C por 2 h, o terceiro é de 85 °C por 5 min e o passo final é de 4 °C para sempre.
11. Assim que o ciclo entrar na quarta etapa, clique em Enter e termine o ciclo. Colete as amostras e prossiga para qRT-PCR. Armazene amostras de RNA a -80 °C e amostras de cDNA a -20 °C.
12. Para detecção de citocinas, descongele os reagentes necessários 2x PCR Master mix, cDNA e sondas para TNF-α, IFN-γ, TGF-β e NFW no gelo.
    NOTA: Todos os reagentes, misturas de reação e amostras devem ser mantidos no gelo.
13. Em um tubo de 100 μL, prepare uma amostra de cDNA adicionando 1 μL de cDNA e 3,5 μL de NFW. Para preparar a mistura principal, pegue 5 μL de mistura principal e adicione 0,5 μL de sonda em um tubo de 100 μL. Misture o conteúdo dando uma volta curta. Calcule o número de amostras e genes-alvo e prepare a mistura de reação de acordo.
    NOTA: Adicione NFW e master mix ao fundo do tubo de 100 μL. Adicione cDNA e sonda à parede do tubo da centrífuga como precaução para garantir que o volume seja adicionado e para evitar a mistura cruzada de qualquer reagente.
14. Coloque as tiras de 8 poços no resfriador de PCR. Transfira 5,5 μL da mistura principal e do frasco contendo sonda para o fundo de cada poço nas tiras de 8 poços. Assim, repita a etapa para todos os genes-alvo.
15. Transfira 4,5 μL da mistura de cDNA e NFW para a parede do poço em tiras de 8 poços. Assim, repita a etapa para todas as amostras.
16. Sele as tiras com as tampas e dê uma pequena rotação de 10 s para misturar os genes e amostras no poço. Coloque a tira no slot de amostra qRT-PCR e feche o slot.
17. Na área de trabalho, inicie o software e faça login como convidado. Um pop-up aparecerá na tela. Clique em Continuar sem conexão.
18. No menu Configuração, clique em Configuração avançada. Em Propriedades do Experimento, escreva o nome do experimento na guia Nome do Experimento . Em que tipo de experimento você deseja configurar a opção, selecione TC comparativo de quantificação (TC ΔΔ).
19. Em Qual velocidade de rampa você deseja usar no instrumento? , clique em Rápido (~ 40 minutos para completar uma corrida). No menu de configuração da placa, defina os nomes dos genes na opção Definir alvos e digite os nomes das amostras em Definir amostras.
20. Na guia Método de execução, digite 10 μL em Volume de reação por poço. Logo antes de segurar o palco, clique em Adicionar estágio e selecione Segurando estágio. Altere a temperatura para 50 °C e o tempo para 2 min. Na segunda fase de espera, não faça nenhuma alteração, que será de 95 °C por 1 s.
21. No ciclo stage Etapa 1, mude a temperatura para 95 °C e o tempo para 3 s. Na etapa 2, altere a temperatura para 60 °C e o tempo para 30 s. Clique em Executar para iniciar o ciclo qRT-PCR.

12. Análise estatística

NOTA: Para todos os dados, a média é representada como uma barra e o desvio padrão representa a barra de erro em um gráfico de barras (valor de p< 0,05 é considerado significativo).

1. Abra o software de análise de dados e insira os dados obtidos do experimento confocal.
2. Para análise de microscopia confocal, aplique ANOVA unidirecional comum com teste de correção de Tukey para comparação de vários grupos para expressão de GFP. Considere-se estatisticamente significante os dados com p < 0,05. Prepare uma representação gráfica dos dados com a média representada como uma barra e o desvio padrão representando a barra de erro.
3. Para o ensaio de carga parasitária, crie uma nova planilha e insira os dados de contagem de parasitas para 100 macrófagos. Aplique ANOVA unidirecional comum com correção de Tukey entre todas as amostras. Considera-se estatisticamente significante os dados com valor de p< 0,05.
4. Para ELISA, realize ANOVA de duas vias com o teste de comparações múltiplas de Tukey. Para qRT-PCR, execute ANOVA de uma via com o teste de correção de Tukey.

Resultados

O arranjo das partes genéticas que formam o circuito sintético para expressar o circuito sintético é mostrado na (Figura 1A). As partes correspondentes foram clonadas no vetor pEGFP-N1 de forma ortogonal e modular, que é representada na Figura 1B. A simulação do circuito sintético revelou dinâmica oscilatória tanto no SDHA quanto no repressor de tetraciclina. Esta observação sugere um padrão de expressão recíproca caracterizado por funções de on...

Discussão

Os resultados obtidos ressaltam a eficiência do duto, que foi canalizado para o projeto e implementação de um circuito sintético. A construção desse circuito sintético foi um passo para o desenvolvimento da medicina de precisão para doenças infecciosas como a leishmaniose. Através da montagem in silico de partes genéticas e simulação determinística, o efeito modulatório diferenciado do sistema TetON foi monitorado. O efeito do circuito, notavelmente, pode ter levado à expressão biestável recíp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL tips	Tarson	521050
10X restriction buffer	BioLabs	R0146S	Restriction digestion
1mL tips	Tarson	521016
1mL tube	Eppendorf	30121023
200 μL tips	Tarson	521010
25cm2 flask	Corning	430639	For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFischer Scientific	D1306	nuclear staining
50mL tube	Corning	352070
60mm plates	Falcon	353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading buffer	ThermoFischer Scientific	10488085	Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plate	ThermoFischer Scientific	160376	For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wells	Tarson	941196
Agarose	Sigma	A9539	For AGE
Agarose gel electrophoresis assembly	GeNei	93	For AGE
Bacterial laminar flow	ESCO Lifesciences	2120765	For transformation
Calcium chloride	Merck	C4901	Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flow	ThermoFischer Scientific	1323TS	For cell culture
Cell scraper	Genetix	90020	For cell culture
Cell spreader	Fischer Scientific	12822775
Centrifuge for 1.5mL tubes	Eppendorf	EP5404000537
Centrifuge for 50mL falcon	ThermoFischer Scientific	75004210
Chlorofrom	Fischer Scientific	67-66-3	For RNA isolation
CO2 incubator	ThermoFischer Scientific	3110	For cell culture
Cuvette	Eppendorf	6138000018	Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imager	Cytiva	29655893	For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	For RNA isolation
Doxycycline	Merck	33429	For induction of transfected cells
Dry heating block	Labnet		For transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle Medium	National centre for cell science		For cell culture
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00983	Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromide	Sigma	E7637	For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acid	Fischer Scientific	12635	Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscope	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-044	For cell culture
FV31S-SW software	Olypmus		Image acquisition
Geneticin	Gibco	1563411	for transfection
Gibson assembly method for cloning	BIOMATIK		Construction of synthetic circuit
Graphpad prism	Graphpad		Statistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFischer Scientific	4368814	for cDNA synthesis
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	Buffer /Reagent preparation
Kanamycin	Sigma	60615	For transformation and colony selection
Luria Bertini broth	Himedia	M1245	For culturing E.coli
Magnesium chloride	Fischer Scientific	BP214	Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air Flow	Microfilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap Strips	ThermoFischer Scientific	4323032	For qRT-PCR
Microwave oven	LG	MC-7649DW	For AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop Plate	ThermoFischer Scientific	51119600DP	For ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker Agitator	DIAB
National centre for Biotechnology Information	https://www.ncbi.nlm.nih.gov		for contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamber	Marienfeld superior	640010	For cell count
Non-vented 25cm2 flask	Corning	353014	For culturing parasite
NotI	BioLabs	R3189M	Restriction enzyme
Nuclease free water	Biodesign	1QIA	Reagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software	Olypmus		Image processing
Olympus FV 3000	Olympus		For confocal imaging
OPTI-MEM media	Gibco	31985070	media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuit	Biomatik
Penicillin	ThermoFischer Scientific	15070063	For cell culture
Polyethylenimine	MERCK	764965	for transfection
Potassium Acetate	Fischer Scientific	YBP364500	Buffer /Reagent preparation
Potassium Chloride	Fischer Scientific	BP366	Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	Buffer /Reagent preparation
Power supply pack	BIORAD	1645070	For AGE
Registry of Standard Biological parts	https://parts.igem.org/Main_Page		for contruction of synthetic circuit
RNAiso Plus	Takara	38220090	For RNA isolation
RNase A	ThermoFischer Scientific	12091021	Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute Medium	National centre for cell science		For culturing parasite
Shaker incubator	REMI	CIS 24 plus	For culturing E.coli
Sodium chloride	Qualigens	Q27605	Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Buffer /Reagent preparation
Sodium Hydroxide	Fischer Scientific	15895	Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Buffer /Reagent preparation
Spectrophotometer	Eppendorf		Estimation of plasmid concentration
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Real Time PCR system	Life technologies	272006777	For qRT-PCR
StepOne software version 2.3	Life technologies		For qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Synthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride	Himedia	MB029	Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTA	SERVA	42549.1	Buffer /Reagent preparation
Trypan blue	Sigma	T8154	For cell count
XhoI	BioLabs	R0146S	Restriction enzyme