Circuits immunométaboliques dans l’infection pour faire progresser les thérapies dirigées vers l’hôte

Résumé

Ici, un protocole pour la conception, la construction et l’administration d’un circuit synthétique inductible à base de tétracycline contrôlé par la tétracycline est présenté. L’effet des circuits synthétiques sur l’élimination des parasites et l’expression des cytokines peut être étudié en canalisant le pipeline présenté. Ce protocole est pertinent pour les chercheurs qui étudient les thérapies basées sur des circuits synthétiques dans les maladies infectieuses.

Résumé

L’immunométabolisme est un déterminant essentiel de la progression de la leishmaniose. L’approche basée sur la biologie synthétique a suscité beaucoup d’attention en tant qu’étape vers une intervention thérapeutique ciblant les facteurs associés à l’hôte qui sont à l’origine de la leishmaniose. La biologie synthétique implique l’ingénierie de composants génétiques de manière orthogonale et modulaire pour moduler avec précision les systèmes biologiques, conférant de nouvelles fonctions aux cellules. Dans l’étude présentée, l’élucidation d’un pipeline systématique pour le développement d’un circuit synthétique inductible contrôlé par la tétracycline (TetON) visait à délivrer de la succinate déshydrogénase en tant qu’agent thérapeutique pour faciliter l’élimination des parasites Leishmania intracellulaires. Le protocole décrit décrit la conception d’un circuit synthétique et sa validation ultérieure. La stratégie proposée se concentre également sur l’incorporation de circuits synthétiques dans le squelette plasmidique en tant que véhicule d’administration. De plus, des machines d’administration utilisant des nanoparticules à base de polyplexes pour l’administration de circuits synthétiques ont été utilisées dans des lignées cellulaires de macrophages murins sans compromettre la morphologie cellulaire. La standardisation de la méthode a été effectuée pour sélectionner les cellules transfectées et déterminer la concentration d’induction optimale pour l’expression en circuit synthétique. Les observations révèlent une nette réduction de la charge parasitaire intracellulaire dans les cellules transfectées par rapport aux cellules infectées. Les cytokines pro-inflammatoires ont été exprimées après l’infection dans des cellules transfectées et induites par un circuit synthétique comme mécanisme pour favoriser l’élimination du parasite. Cela souligne que la méthode basée sur la biologie synthétique est une approche puissante dans la leishmaniose en ciblant les facteurs de l’hôte associés à la progression de la maladie.

Introduction

L’avancement de la médecine holistique et intégrative est un lien important qui a été identifié entre les altérations métaboliques dans les cellules immunitaires et leur capacité à moduler le phénotype des cellules immunitaires dans les maladies infectieuses. L’immunométabolisme offre de nouvelles perspectives pour élucider la pathogenèse des maladies infectieuses prévalentes chez l’homme. De plus, il fournit des techniques prometteuses pour le développement de vaccins et de médicaments en identifiant de nouvelles cibles d’intervention¹. La reprogrammation métabolique des cellules immunitaires est identifiée dans diverses maladies infectieuses,....

Protocole

1. Culture cellulaire de cellules RAW264.7

REMARQUE : Utilisez un faible nombre de passages pour l’expérimentation. La lignée cellulaire RAW264.7 a été obtenue à partir du dépôt national de cellules du Conseil d’innovation en biotechnologie du Centre national des sciences cellulaires (BRIC-NCCS), à Pune. Comme la lignée cellulaire RAW264.7 est une lignée cellulaire de macrophage, elle peut commencer à se différencier avec l’augmentation des passages. Après avoir ranimé les cellules, utilisez la lignée cellulaire pour la transfection après 2 passages.

1. Semez 5 x 10⁵ cellules de la lignée cellulaire RAW264....

Résultats

La disposition des parties génétiques formant le circuit synthétique pour exprimer le circuit synthétique est illustrée (Figure 1A). Les parties correspondantes ont été clonées dans le vecteur pEGFP-N1 de manière orthogonale et modulaire, ce qui est représenté sur la figure 1B. La simulation du circuit synthétique a révélé une dynamique oscillatoire à la fois dans le SDHA et le répresseur de tétracycline. Cette observation suggère un modèle d.......

Discussion

Les résultats obtenus soulignent l’efficacité du pipeline, qui a été canalisé pour la conception et la mise en œuvre d’un circuit synthétique. La construction de ce circuit synthétique a été une étape vers le développement d’une médecine de précision pour les maladies infectieuses comme la leishmaniose. Grâce à l’assemblage in silico de parties génétiques et à la simulation déterministe, l’effet modulatoire distingué du système TetON a été surveillé. L’effet du circuit, notam.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL tips	Tarson	521050
10X restriction buffer	BioLabs	R0146S	Restriction digestion
1mL tips	Tarson	521016
1mL tube	Eppendorf	30121023
200 μL tips	Tarson	521010
25cm2 flask	Corning	430639	For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFischer Scientific	D1306	nuclear staining
50mL tube	Corning	352070
60mm plates	Falcon	353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading buffer	ThermoFischer Scientific	10488085	Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plate	ThermoFischer Scientific	160376	For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wells	Tarson	941196
Agarose	Sigma	A9539	For AGE
Agarose gel electrophoresis assembly	GeNei	93	For AGE
Bacterial laminar flow	ESCO Lifesciences	2120765	For transformation
Calcium chloride	Merck	C4901	Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flow	ThermoFischer Scientific	1323TS	For cell culture
Cell scraper	Genetix	90020	For cell culture
Cell spreader	Fischer Scientific	12822775
Centrifuge for 1.5mL tubes	Eppendorf	EP5404000537
Centrifuge for 50mL falcon	ThermoFischer Scientific	75004210
Chlorofrom	Fischer Scientific	67-66-3	For RNA isolation
CO2 incubator	ThermoFischer Scientific	3110	For cell culture
Cuvette	Eppendorf	6138000018	Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imager	Cytiva	29655893	For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	For RNA isolation
Doxycycline	Merck	33429	For induction of transfected cells
Dry heating block	Labnet		For transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle Medium	National centre for cell science		For cell culture
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00983	Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromide	Sigma	E7637	For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acid	Fischer Scientific	12635	Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscope	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-044	For cell culture
FV31S-SW software	Olypmus		Image acquisition
Geneticin	Gibco	1563411	for transfection
Gibson assembly method for cloning	BIOMATIK		Construction of synthetic circuit
Graphpad prism	Graphpad		Statistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFischer Scientific	4368814	for cDNA synthesis
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	Buffer /Reagent preparation
Kanamycin	Sigma	60615	For transformation and colony selection
Luria Bertini broth	Himedia	M1245	For culturing E.coli
Magnesium chloride	Fischer Scientific	BP214	Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air Flow	Microfilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap Strips	ThermoFischer Scientific	4323032	For qRT-PCR
Microwave oven	LG	MC-7649DW	For AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop Plate	ThermoFischer Scientific	51119600DP	For ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker Agitator	DIAB
National centre for Biotechnology Information	https://www.ncbi.nlm.nih.gov		for contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamber	Marienfeld superior	640010	For cell count
Non-vented 25cm2 flask	Corning	353014	For culturing parasite
NotI	BioLabs	R3189M	Restriction enzyme
Nuclease free water	Biodesign	1QIA	Reagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software	Olypmus		Image processing
Olympus FV 3000	Olympus		For confocal imaging
OPTI-MEM media	Gibco	31985070	media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuit	Biomatik
Penicillin	ThermoFischer Scientific	15070063	For cell culture
Polyethylenimine	MERCK	764965	for transfection
Potassium Acetate	Fischer Scientific	YBP364500	Buffer /Reagent preparation
Potassium Chloride	Fischer Scientific	BP366	Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	Buffer /Reagent preparation
Power supply pack	BIORAD	1645070	For AGE
Registry of Standard Biological parts	https://parts.igem.org/Main_Page		for contruction of synthetic circuit
RNAiso Plus	Takara	38220090	For RNA isolation
RNase A	ThermoFischer Scientific	12091021	Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute Medium	National centre for cell science		For culturing parasite
Shaker incubator	REMI	CIS 24 plus	For culturing E.coli
Sodium chloride	Qualigens	Q27605	Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Buffer /Reagent preparation
Sodium Hydroxide	Fischer Scientific	15895	Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Buffer /Reagent preparation
Spectrophotometer	Eppendorf		Estimation of plasmid concentration
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Real Time PCR system	Life technologies	272006777	For qRT-PCR
StepOne software version 2.3	Life technologies		For qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Synthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride	Himedia	MB029	Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTA	SERVA	42549.1	Buffer /Reagent preparation
Trypan blue	Sigma	T8154	For cell count
XhoI	BioLabs	R0146S	Restriction enzyme