JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לתכנון, בנייה ואספקה של מעגל סינתטי מבוסס טטרציקלין מבוקר טטרציקלין. ניתן ללמוד את השפעת המעגלים הסינתטיים על סילוק טפילים וביטוי ציטוקינים על ידי תיעול הצינור המוצג. פרוטוקול זה רלוונטי לחוקרים החוקרים טיפולים מבוססי מעגלים סינתטיים במחלות זיהומיות.

Abstract

אימונומטבוליזם הוא גורם מכריע בהתקדמות הלישמניאזיס. גישה המבוססת על ביולוגיה סינתטית זכתה לתשומת לב משמעותית כצעד לקראת התערבות טיפולית המתמקדת בגורמים הקשורים למארח המניעים לישמניאזיס. ביולוגיה סינתטית כרוכה בהנדסה של רכיבים גנטיים באופן אורתוגונלי ומודולרי כדי לווסת במדויק מערכות ביולוגיות, תוך הקניית פונקציות חדשות לתאים. במחקר המוצג, הבהרה של צינור שיטתי לפיתוח מעגל סינתטי מבוסס טטרציקלין אינדוקטיבי (TetON) נועדה לספק דהידרוגנאז סוקצינאט כסוכן טיפולי כדי להקל על חיסול טפילי לישמניה תוך תאיים. הפרוטוקול המתואר מתאר את התכנון של מעגל סינתטי ואת האימות הבא שלו. האסטרטגיה המוצעת מתרכזת גם בשילוב מעגלים סינתטיים בעמוד השדרה של הפלסמיד כרכב משלוח. בנוסף, מכונות משלוח המשתמשות בננו-חלקיקים מבוססי פוליפלקסים להעברת מעגלים סינתטיים שימשו בקווי תאי מקרופאגים מורינים מבלי לפגוע במורפולוגיה התאית. נעשתה סטנדרטיזציה של השיטה לבחירת תאים נגועים וקביעת ריכוז אינדוקציה אופטימלי לביטוי מעגלים סינתטיים. תצפיות חושפות הפחתה מובהקת בעומס הטפיל התוך-תאי בתאים נגועים בהשוואה לתאים נגועים. ציטוקינים מעודדי דלקת באו לידי ביטוי לאחר ההדבקה בתאים סינתטיים שעברו זיהוק וגרמו להם כמנגנון לקידום סילוק טפילים. זה מדגיש את השיטה המבוססת על ביולוגיה סינתטית כגישה חזקה בלישמניאזיס על ידי התמקדות בגורמים מארחים הקשורים להתקדמות המחלה.

Introduction

התקדמות הרפואה ההוליסטית והאינטגרטיבית מהווה קשר משמעותי שזוהה בין שינויים מטבוליים בתאי מערכת החיסון לבין יכולתם לווסת את הפנוטיפ של תאי מערכת החיסון במחלות זיהומיות. מטבוליזם חיסוני מציע פרספקטיבות חדשות להבהרת הפתוגנזה של מחלות זיהומיות נפוצות בבני אדם. יתר על כן, הוא מספק טכניקות מבטיחות לפיתוח חיסונים ותרופות על ידי זיהוי מטרות חדשות להתערבות1. תכנות מחדש מטבולי של תאי מערכת החיסון מזוהה במחלות זיהומיות שונות, כולל לישמניאזיס. לישמניה spp. אחראי לגרימת לישמניאזיס, אשר לישמניה מז'ור (L. major) גורמת ללישמניאזיס עורי (CL). L. טפילים עיקריים גורמים להשפעה משמעותית על חילוף החומרים של תאים מארחים, במיוחד במקרופאגים, לצורך התרבות והישרדות כטפילים תוך-תאיים2. מקרופאגים יכולים בדרך כלל להתקוטב לתת-קבוצות המופעלות באופן קלאסי (M1) או לחילופין מופעלות (M2) שבהן תאי M1 מכילים הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתית גבוהה וייצור של תחמוצת החנקן (NO) באמצעות חילוף החומרים של מיני חנקן. תאי M2 מפגינים רמות גבוהות של ציטוקינים אנטי דלקתיים ומפגינים פעילות ארגינאז גבוהה באמצעות מטבוליזם של חנקן3. לכן, שני הפנוטיפים לא רק נבדלים זה מזה בתגובה החיסונית שלהם, אלא גם במסלולים המטבוליים שלהם.

ביולוגיה מערכתית של לישמניאזיס שואפת לזהות מטרות מולקולריות לתכנון טיפולים חדשניים באמצעות תכנון ופיתוח תרופות. שחזור רשתות איתות ומסלולים מטבוליים מסייע בהבנת הלישמניאזיס כמודל הוליסטי ומפיק תובנות לזיהוי המרכיב העיקרי המניע את המצב החולה. מודלים מתמטיים הם אחת הגישות האנליטיות השימושיות המועדפות ביותר להבנת המורכבות של לישמניאזיס4. רשתות אימונומטבוליות ומודלים מתמטיים אפשרו זיהוי של סוקצינאט דהידרוגנאז (SDHA) כמרכיב מרכזי בפנוטיפ M1, המתבטא בחיסול הטפיל5. לביולוגיה סינתטית יש יישומים באבחון, פיתוח חיסונים וטיפולים בלישמניאזיס. מטבוליזם הממוקד באפנון תגובה חיסונית יכול להיות מושג באמצעות כלים ביולוגיים סינתטיים. עבור אפנון של סינתאז אינוזיטול פוספוריל סרמיד המווסת את חילוף החומרים של ספינגולפידים ומשנה את האיתות החיסוני של המאכסן, נעשה שימוש במעגל גנטי בעל התנהגות דו-יציבה כדי לכוונן באופן סינתטי את החוסן הפנימי של L. מודל זיהום מז'ורי 6,7. לפיכך, מערכות וביולוגיה סינתטית יכולות לספק פלטפורמה מבוססת מודל להנדסה גנטית לפיתוח רפואה מדויקת במערכת מודל לישמניה.

פנוטיפ M1 מסומן על ידי ביטוי של רשתות איתות אימונו-מטבוליות שבהן הייצור של ציטוקינים דלקתיים ומסלולים מטבוליים משפר באופן סינרגטי את חיסול הטפילים. קיטוב M1 מסמל ייצור של ציטוקינים מעודדי דלקת כגון אינטרלוקין-12 (IL-12), אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α). מסלולים מטבוליים המועשרים מאוד בפנוטיפ M1 כוללים גליקוליזה, מסלול פנטוז פוספט ומחזור חומצה טריקרבוקסילית קטועה (מחזור TCA)5. מחזור TCA הקטוע מכוון את מכונות סילוק הטפילים באמצעות רמות סוקצינאט וציטראט מוגברות, המדריכות את הייצור של NO3. הצטברות של סוקצינאט על ידי SDHA מובילה להפעלה של גורם שעתוק גורם היפוקסיה-אינדוקציה 1-אלפא (HIF-1α), אשר גורם לייצור של IL-1β8. בפנוטיפ M2 נצפים חמצון חומצות שומן, עלייה בניצול גלוטמין וזרחן חמצוני משופר של גלוקוז יחד עם ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים כגון אינטרלוקין-10 (IL-10), התמרת גורם גדילה בטא (TGF-β), אינטרלוקין-4 (IL-4) ואינטרלוקין-13 (IL-13)3. M2 מציג מיטוכונדריה מוארכים כתכונה ייחודית, המובילה ליעילות משופרת בייצור אנרגיה. הם משתמשים בחומצות שומן, גלוקוז וגלוטמין כמצעים כדי לתדלק את מחזור TCA, ובכך מייצרים ATP באמצעות זרחן חמצוני בקצב גבוה יותר כדי לקדם צמיחה ושגשוג של טפילים9. אנזים SDHA האחראי להצטברות סוקצינאט באמצעות TCA קטוע יכול לא רק לקדם ייצור NO אלא גם ליזום צריכת חמצן תלוית סוקצינאט באמצעות הובלת אלקטרונים10. במקרופאגים נגועים בלישמניה, SDHA מווסת פי 2.17, מה שמצביע על כך שגם הנשימה האירובית עשויה להיות מופחתת11. על מנת להגביר את צריכת הסוקצינאט כדי לגרום לייצור NO בתיווך ציטוקינים מעודדי דלקת ולקדם סילוק טפילים, ביטוי של SDHA הוא חיוני.

המעגל הסינתטי מציע טיפולים מדויקים וממוקדים שעשויים לשנות את המערכת החולה כדי להשיג תנודה דו-יציבה שעשויה לשחזר פנוטיפ בריא ברמה המרחבית-טמפורלית. העברת המעגל הסינתטי והביטוי הופכים את המערכת לדינמית וחזקה. גורם מרכזי אחד התורם לקידום הביולוגיה הסינתטית טמון ביכולת להרכיב חלקים ואלמנטים גנטיים באופן מודולרי כדי לאפשר יצירת ארכיטקטורות מורכבות ופונקציות מותאמותאישית 12. אילוצים הקשורים לטכניקות ביטוי מסורתיות דרבנו את הופעתם של מעגלים סינתטיים אינדוקטיביים מבוססי אופרון טטרציקלין, ובכך אפשרו הערכה מהירה של פלסמיד והעברה קלה בין סוגי תאים שונים13. חלבון TetR, כאשר הוא קיים כדימר, מפגין זיקה חזקה לאופרון טט (TetO), ומדכא למעשה שעתוק. עם זאת, עם האינטראקציה של הליגנד שלו, דוקסיציקלין (dox), TetR עובר שינוי מבני, וכתוצאה מכך ניתוקו מ-TetO, וכתוצאה מכך מאפשר לשעתוק להתקדם ללא הפרעה. מעגל זה יכול להציג בקרת תרגום חלבונים14. לכן, באמצעות המתודולוגיה שהוגדרה, המעגל הסינתטי המתוכנן מבוסס אופרון טטרציקלין איפשר לבטא SDHA בווקטור pEGFP-N1. הערכת יעילות הטרנספורמציה של המעגל ותפוקתו סיפקה תובנות לגבי יכולת המסירה. באמצעות הגבלת העיכול של הווקטור, אושרה קביעת יעילות השיבוט. יתר על כן, קו תאי מקרופאג עכבר RAW264.7 נגוע שמקורו במקרופאגים פריטוניאליים של עכברי Balb/c נצפה עבור ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק תלוי מינון דוקסיציקלין (GFP) בתאים נגועים. בנוסף, אפקט חיסול הטפיל בתאים נגועים אומת עם ביטוי של המעגל הסינתטי. יתר על כן, נצפו אינדוקציה וביטוי של ציטוקינים פרו דלקתיים, אשר כוונו באמצעות עלייה בנקודת הזמן של זיהום במעגל הסינתטי נגוע ומושרה תאים, אשר היה קשור ישירות עם תפקוד של המעגל הסינתטי.

Protocol

1. תרבית תאים של תאי RAW264.7

הערה: השתמש במספרי מעברים נמוכים לניסויים. קו התאים RAW264.7 נרכש ממאגר התאים הלאומי של המועצה לחדשנות במחקר ביוטכנולוגי - המרכז הלאומי למדעי התא (BRIC-NCCS), פונה. מכיוון שקו התאים RAW264.7 הוא קו תאי מקרופאגים, הוא עשוי להתחיל להתמיין עם מעברים הולכים וגדלים. לאחר החייאת התאים להשתמש בקו התא עבור transfection לאחר 2 מעברים.

  1. זרע 5 x 105 תאים של קו התאים RAW264.7 בבקבוק25 ס"מ 2 בתוספת 5 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 100 IU / מ"ל פניצילין כמדיום שלם.
  2. שמור תאים לצמיחה ושגשוג באינקובטור עם 5% CO2 ב 37 ° C עד 90% מפגש מושגת.
  3. יש להשליך את המדיה ולשטוף 3x עם 1x מלח חיץ פוספט (PBS). הוסף 1 מ"ל PBS לצלוחית, גרד את התאים באמצעות מגרד, ולאסוף את התאים בצינור 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 24 ° C ולהשעות מחדש את הגלולה באמצעות פיפטה 1 מ"ל ב 1 מ"ל של מדיום DMEM מלא.
  5. ספרו את התאים בתא ספירת התאים באמצעות 0.5% טריפאן כחול כדי לזהות את אחוז התאים החיים.

2. תרבית תאים של הטפיל L. major

הערה: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) היה מתנה מ BRIC-NCCS. פרומסטיגוטים צריכים להיות בעלי מספר מעבר קטן מ-10. מספר המעבר הנמוך מבטיח שהטפיל בריא ויכולתו להדביק מקרופאגים גבוהה יותר.

  1. Grow L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) ב-Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) בתוספת 20% FBS כמדיום שלם.
  2. זרעים 1 x 106 promastigotes ב לא מאוורר 25 ס"מ2 בקבוק המכיל 5 מ"ל של מדיום שלם. לדגור את הבקבוק ב 27 ° C במשך 5 ימים ולצפות בשלב נייח promastigote L. טפיל גדול ב 20x במיקרוסקופ שדה בהיר.
    הערה: ניתן להשיג פרומסטיגוטות בשלב נייח תוך 4-7 ימים לאחר התרבית. הם מאופיינים במצבם המוארך והתנועתיות המופחתת.

3. תכנון מעגל סינטטי בפלסמיד כווקטור מסירה

  1. תכנון חלקים מהמעגל הסינטטי
    1. פתחו את תוכנת תא ה-Tinker והמשיכו לכרטיסייה חלקים. בחר את רכיב המקדם מהספרייה ומקם אותו על בד הציור כדי לסמל את מקדם Cytomegalovirus (CMV) בתוך המעגל הסינתטי. אחזר את אתר כריכת המדחק, המקביל ל- TetO, מהכרטיסייה חלקים ומקם אותו בסמוך למקדם על בד הציור, תוך שילובו בצורה חלקה עם מקדם CMV.
    2. שלבו את אופרטור הטטרציקלין (TetO), את אתרי הכניסה הפנימיים של הריבוזום (IRES) ואת אזור הקידוד על ידי גרירה ושחרור של אתר קשירת מדכא, אתר קשירת ריבוזום (RBS) ואזור קידוד על הבד, ושילבם עם המרכיבים הגנטיים הקיימים.
    3. שנה את שם אזור הקידוד ל- TetR, המציין את המדכא המגיב לטטרציקלין, המתפקד כמווסת שלילי משוער בתוך המעגל הסינתטי. מיזוג אלמנטים גנטיים אלה כדי להקל על בניית החלקים הסינתטיים.
    4. שלבו על בד הציור אזור ספייסר (sd1), שתוכנן להיות ניתן לפיצול על ידי פרוטאזות תאיות כמו טסכו-וירוס חזירי-1 2A (P2A). הציגו אזור קידוד נוסף המייצג את הגן המעניין, תייגו אותו כ-SDHA למבנה הסינתטי ושלבו אותו עם שאר האלמנטים.
    5. בסמוך לאזור קידוד SDHA, שלבו אזור ספייסר נוסף (sd2), שיהיה ניתן לפיצול על ידי פרוטאז תאי P2A. הציגו אזור קידוד המייצג את גן המדווח ותייגו אותו כ-GFP לתוך המבנה.
      הערה: ביטוי GFP עשוי לספק הערכה לייצור SDHA ולהבטיח שלמעגל הסינתטי יש תפקוד לוגי13.
    6. לצד GFP, צרף מסיים (ter1) ואמת את החלקים שהורכבו על ידי בדיקה אם כל החלקים מחוברים. המעגל חייב להופיע באדום בעת לחיצה על חלק כלשהו. זה מאשר את היווצרות של מעגל גנטי פונקציונלי.
    7. מהכרטיסייה תגובה, הקצה שיעורי ויסות, הכוללים פרמטרים וערכים התחלתיים לייצור חלבונים, ל- TetR, SDHA ו- GFP כדי להגדיר את תגובת התרגום בתוך המעגל הסינתטי.
    8. הוסף מולקולה קטנה מהכרטיסייה חלקים, קרא לה דוקסיציקלין (dox), והקצה לה פונקציית גל על ידי בחירת קלט מהכרטיסייה חלקים וחיבור ולאחר מכן על ידי לחיצה על קלט גל.
    9. בלשונית רגולציה , לחץ על תגובת דיכוי. גרור ושחרר את קצב התגובה על בד ציור בין dox ו- TetR. הגדר את קינטיקה התגובה בין dox ו- TetR על ידי לחיצה כפולה על סמל פונקציית הגל ב- dox והתאמת Doxyxycline.sin.amplitude ל- 10.
    10. יישם את תגובת ויסות השעתוק בין חלבון TetR לבין אתר הקישור המדכא על ידי בחירת התגובה מהכרטיסייה רגולציה והצבתה על בד הציור בין TetR ו- TetO.
    11. על ידי לחיצה כפולה על כל רכיב ותגובה, הגדר ריכוז ופרמטר ראשוניים לסימולציה. לחץ על סימולציה, בחר דטרמיניסטי והדמיה את המעגל עבור 100 יחידות זמן. התאימו את גרף הסימולציה מלוח הבקרה, שמופיע עם הגרף, והתבוננו בתבנית הגרף של חלבוני SDHA ו-TetR.
  2. זיהוי רכיבים גנטיים מרישום חלקי iGEM
    1. פתח את הרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים (רשימת חומרים) ולחץ על חיפוש. הזן את שם הרכיב הגנטי, למשל, מקדם CMV.
      הערה: התהליך לחיפוש מזהה iGEM חייב להתבצע עבור כל המרכיבים הגנטיים של המעגל הסינתטי. השלבים לזיהוי מזהה iGEM של מקדם CMV מגויסים; לאחר מכן, יש לחזור על השלבים עבור רכיבים אחרים.
    2. כדי לקבל את רצף הנוקלאוטידים של מקדם CMV, לחץ על קבל רצף חלקים אפשרות ושמור את הקובץ כקובץ טקסט.
      הערה: חשוב לציין כי מלאי של כל החלקים הגנטיים זמין.
    3. חזור על שלב 3.2.1 ושלב 3.2.2 עבור כל החלקים הגנטיים (אופרטור טטרציקלין, רצף קוזאק, TetR, P2A ו- GFP) למעט SDHA.
    4. כדי לקבל רצף קידוד חלבונים של SDHA, פתח את NCBI ובחר נוקלאוטיד מהתפריט הנפתח לצד חלון החיפוש. הקלד Succinate dehydrogenase ו - Mus musculus וחפש רצף נוקלאוטידים.
    5. לחץ על CDS אפשרות כדי לקבל את רצף הקידוד של SDHA ולשמור את הרצף בקובץ טקסט.
    6. מיזוג רצף הנוקלאוטידים של כל חלקי הבקרה הגנטית בקובץ אחד ברצף. הוסף קודון התחלה (ATG) מיד לאחר רצף קוזאק והסר קודוני עצירה פנימיים כדי למנוע היווצרות של פוליפפטידים מתהווים.
    7. פתח את אתר ExPASy15 והדבק את רצף הנוקלאוטידים. לחץ על תרגם את רצף אופציה. בחר 5'3' מסגרת 1 והסר את קודוני העצירה, אשר יודגשו באדום בסעיף התוצאות.
      הערה: כדי לזהות אם רצף הנוקלאוטידים מתורגם ביעילות לרצף הפוליפפטיד הרצוי, ניתן להשתמש בכלי תרגום כגון ExPASy. זה מבטיח מניעה של פוליפפטידים מתהווים לא רצויים. הבחירה בווקטור pEGFP-N1 לביטוי המעגל הסינתטי היא אופטימלית, בהתחשב בכך שמקדם CMV וגן GFP היו קיימים מראש בתוך הווקטור. כל החלקים הגנטיים הורכבו באמצעות פרוטוקול שיבוט (שנעשה במיקור חוץ). אנזימי ההגבלה המשמשים לשיבוט התוספות הם NotI ו-XhoI. אתרי אנזימי הגבלה אלה ממוקמים בתוך אתר השיבוט המרובה של וקטור pEGFP-N1.

4. טרנספורמציה של המעגל הסינתטי בתאי Escherichia coli (E.coli) DH5α

  1. הכנת תאים מוכשרים E.coli DH5α
    הערה: מומלץ לבצע אוטוקלאבינג של הריאגנטים. ריאגנטים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
    1. תרבית 1 מ"ל של inoculum טרי ב 50 מ"ל של מרק לוריא (LB) ב 37 ° C, 180 סל"ד. גדל את התאים במשך כשעתיים עד שתושג צפיפות אופטית (OD) של 0.4-0.6 ב- 600 ננומטר.
    2. צנטריפוגה את התאים ב 4,696 x גרם ב 4 ° C במשך 15 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ידנית בבקבוק ההשלכה על ידי היפוך צינור הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל וקצירת כדורית התא.
    3. יש להשהות מחדש בעדינות את הגלולה ב-2 מ"ל מגנזיום כלוריד קר כקרח (MgCl2) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. לפצות את נפח עד 20 מ"ל עם קר כקרח MgCl2.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב 4,696 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant. יש להשהות מחדש בעדינות את התאים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל ב-1 מ"ל של סידן כלורי 0.1M קר כקרח (CaCl2) ולדגור על קרח למשך שעתיים. השתמש בתאים המוכשרים שזה עתה נוצרו לצורך טרנספורמציה.
  2. טרנספורמציה של תאים מוכשרים עם מבנה מעגל סינתטי
    1. למדוד 50 μL של תאים מוכשרים ולהוסיף את התאים בצינור 1.5 מ"ל. מניחים את הצינור על קרח. הוסיפו 10 ננוגרם של מבנה מעגל סינטטי לאליקוט ושמרו על קרח למשך 3 דקות.
    2. יש לחמם תאי הלם בטמפרטורה של 42°C למשך 3 דקות על בלוק חימום יבש. לאחר השלמת הדגירה על גוש החימום היבש, הניחו את התאים בחזרה על קרח למשך 3 דקות, הוסיפו 1 מ"ל LB לתאים, ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ב-250 סל"ד.
    3. כאשר הדגירה הושלמה, צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 4,696 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. להשהות את התאים ב 100 μL של LB וצלחת אותו על LB אגר המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. הפוך את הצלחת ודגר ב 37 ° C במשך 24 שעות.

5. בידוד מבנה מעגל סינתטי

  1. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, קח 10 מ"ל של LB בינוני והוסף 50 מיקרוגרם / מ"ל של קנמיצין כמרק בחירה לתרבית תאים מותמרים לבידוד פלסמיד. הרימו מושבה שעברה טרנספורמציה בעזרת קצה של 200 מיקרוליטר והוסיפו אותה לציר הבחירה.
  2. באמצעות לולאת חיסון, בחרו מושבה בודדת נוספת, פזרו צלחת בטכניקה מחומשת, ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות על מנת לשמור על בידוד מושבה אחת.
  3. לגדל את התאים בן לילה ב 180 סל"ד ב 37 ° C. למחרת, צנטריפוגה את התרבית ב 4,696 x גרם במשך 20 דקות ב 24 °C (75 °F). לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ תרחיף (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), 10 mM Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 100 μg / mL RNase A (pH-8.0)) לגלולה ולהשהות מחדש את התאים על ידי pipetting בעדינות.
    הערה: למאגר ההשעיה יש להוסיף RNase A 5 דקות לפני הוספת התערובת לכדורית התא.
  4. דוגרים על התערובת במשך 5 דקות ב-RT. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ ליזיס (0.2 N נתרן הידרוקסידי (NaOH), 1% נתרן דודציל סולפט (SDS)) לתאים ומערבבים על ידי היפוך הצינור למשך 2 דקות. לדגור על הצינור במשך 5 דקות ב- RT.
  5. הוסף 1 מ"ל של חיץ נטרול לתאים (3 M אשלגן אצטט (CH3CO2K)) וערבב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. צנטריפוגו את התאים במהירות של 4,696 x גרם למשך 20 דקות ב-RT ואספו את הסופרנאטנט בצינור של 1.5 מ"ל.
  6. מוסיפים 500 μL של איזופרופנול לסופרנאטנט ומערבבים היטב על ידי היפוך. לדגור את supernatant על קרח במשך 15 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    הערה: הדגירה יכולה לנוע בין 5 דקות לשעה. במהלך זה, מומלץ לערבב בעדינות את התוכן על ידי היפוך כל 5 דקות.
  7. יש להשליך את הסופרנטנט, להוסיף 1 מ"ל אתנול 70% אתנול (מקורר) לכדור, ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 12000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. חזור על שלב זה פעם נוספת.
  8. יבש באוויר את הגלולה והשהה מחדש את הפלסמיד המתקבל ב -20 מיקרוליטר של מים סטריליים ללא נוקלאז (NFW). למדוד את ריכוז הפלסמיד על ספקטרופוטומטר באורך גל של 260/280 ננומטר.
    הערה: הוסף NFW נוסף אם ריכוז הפלסמיד גבוה מאוד כדי להיות מוערך באמצעות nanodrop. תהליך דילול פלסמיד חייב להתבצע במכסה מנוע למינרי.

6. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (AGE) של מעגל סינתטי

  1. הכנת דגימת פלסמיד ל- AGE
    1. בצינור של 1.5 מ"ל, למדוד 20 μL של 1x Tris-אצטט-EDTA (TAE). מוסיפים 4 μL של מאגר העמסה 6x ומערבבים היטב על ידי פיפטינג.
    2. תן סיבוב מהיר לצינור, הוסף 1 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד מעגל סינתטי ומערבבים היטב על ידי pipetting התערובת. ניתן להעמיס תערובת תגובה זו על ג'ל אגרוז.
      הערה: הימנעו מצנרת קפדנית מכיוון שהיא עלולה לפגוע במבנה הפלסמיד. במקום זאת, תן סיבוב מהיר לערבוב ריאגנטים.
  2. הגבלת העיכול של מעגל סינתטי
    1. בצינור של 1.5 מ"ל, הוסף 2 μL של 10x restriction buffer, 1 μL של NotI, ו- 1 μL של אנזים הגבלת XhoI, וערבב היטב על ידי מתן סיבוב מהיר לתוכן. הוסף 1 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד מעגל סינתטי ותן לתוכן סיבוב מהיר.
    2. לפצות את נפח הצינור ל 20 μL על ידי הוספת NFW לתוכן ולתת לצינור סיבוב מהיר. לדגור על הצינור ב 37 ° C במשך 1 שעה.
    3. לאחר הדגירה, יש לשמור את הצינור בטמפרטורה של 70°C למשך 15 דקות בבלוק חימום יבש כדי להשבית אנזימי הגבלה. מצננים את תכולת הצינור ומוסיפים 6 μL של חיץ העמסה לתערובת התגובה. מערבבים את התוכן על ידי סיבוב מהיר של הצינור. ניתן להעמיס תערובת תגובה זו על ג'ל אגרוז.
    4. הגדר את ג'ל האגרוז והפעל את הג'ל באמצעות פרוטוקול16 שתואר קודם לכן. בקצרה, לטעון 20 μL דגימות לכל באר, לטעון 5 μL של 1 Kb DNA סולם, ולהפעיל את הג'ל ב 100V. נתק את ספק הכוח לאחר השלמת האלקטרופורזה, רכוש את הג'ל במצלמת ג'ל והפעל את אפשרות הפלואורסצנטיות כדי להציג את הפסים.

7. טרנספקציה של מבנה מעגל סינתטי בקו תאים RAW264.7

  1. הכנת דוגמאות
    1. הכינו דגימות כדי לקבוע את אפקט סילוק הטפילים על ידי מעגל סינתטי מושרה. הדגימה הראשונה היא תאי RAW264.7 לא נגועים (בקרה), השנייה היא תאי RAW264.7 הנגועים ב- L. major promastigotes במשך 6 שעות (6 שעות נגועים), הדגימה השלישית הייתה תאי RAW264.7 הנגועים במעגל סינתטי ומושרים בדוקס (IMT), דגימות נקודת הזמן של ההדבקה הן תאי RAW264.7 הנגועים במעגל סינתטי ומושרים בדוקס הנגוע ב- L. major promastigotes (IMTI) עבור נקודות זמן שונות 6 שעות (6 שעות IMTI), 12 שעות (12 שעות IMTI), 18 שעות (18 שעות IMTI) ו 24 שעות (24 שעות IMTI).
    2. כדי להכין את כל הדגימות, גרדו את תאי RAW264.7 מבקבוק25 ס"מ 2 וצנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
    3. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של DMEM בינוני מלא. קח 10 μL של תאים מרחפים בצינור 100 μL, להוסיף 10 μL של 0.5% טריפאן כחול לתאים ולערבב היטב.
    4. טען 10 μL של תערובת תאים וטריפאן כחול על תא ספירת התאים להחליק ולקחת ספירת תאים מ 4 תאים.
    5. תאי צלחת בתחתית מכסה 96 צלחות באר ב 2 x 104 תאים לכל באר לדגור את התאים במשך 24 שעות. מדגם זה הוא מדגם הבקרה. שלב זה נשאר קבוע להכנת דגימות אחרות.
      הערה: יש לחמם מראש את המדיה ב-37°C באמבט מים לפני השימוש.
    6. כדי להכין דגימה נגועה 6 שעות, צנטריפוגה 1 מ"ל של שלב נייח L. promastigotes ב 7,273 x גרם במשך 10 דקות. השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של DMEM להשלים בינוני ולקחת את ספירת התאים על תא ספירת תאים על ידי ביצוע שלבים 7.1.3-7.1.4.
    7. הוסף 2 x 105L. promastigotes גדולים לבאר לדגור אותם עם 5% CO2 ב 37 ° C במשך 6 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים 3x עם PBS.
    8. כדי להכין את דוגמת IMT, זרע את התאים על-ידי ביצוע השלבים (7.1.2-7.1.5) ובצע את שלבי הטרנספקציה 7.2.1-7.2.6.
    9. כדי להכין דוגמאות של נקודות זמן של IMTI, בצע את השלבים 7.1.2-7.1.5 ובצע את שלבי הטרנספקציה 7.2.1-7.2.6. השליכו את המדיה המלאה של DMEM המכילה 500 מיקרוגרם/מ"ל גנטיקין (G418) ו-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר דוקס ושטפו תאים 3x עם 1x PBS.
    10. הוסף 2 x 105L. promastigotes גדולים לבארות ולדגור אותם במשך 6 שעות, 12 שעות, 18 שעות ו 24 שעות. לאחר ההדבקה, להשליך את promastigotes המכילים DMEM מדיה מלאה ולשטוף בארות 3x עם 1x PBS. הוסף 200 μL של מדיה מלאה DMEM המכילה 500 מיקרוגרם / מ"ל גנטיקין (G418) ו 1 מיקרוגרם / μL dox לתאים ולדגור במשך 24 שעות.
  2. טרנספקציה של מעגל סינתטי
    1. בצינור של 1.5 מ"ל, הוסף 24 μL של מדיום סרום מופחת, שהוא מדיום חיוני מינימלי משופר. למדיה, הוסף 1 מיקרוגרם של וקטור pEGFP-N1 משובט עם פלסמיד מעגל סינתטי.
    2. בצינור טרי של 1.5 מ"ל, הוסף 24 μL של Minimal Essential Medium והוסף 1 μL של פוליאתילנימין (PEI; 1 מיקרוגרם / μL). מערבבים היטב על ידי זילוף התערובת לפחות פי 10 ודוגרים ב-RT במשך 5 דקות.
    3. העבר את תערובת PEI לצינור 1.5 מ"ל המכיל את תערובת ה- DNA. מערבבים היטב על ידי פיפטינג טיפה חכם לפחות פי 10. לדגור על הדנ"א: תערובת PEI ב-RT למשך 10 דקות.
    4. השליכו את המדיה מהבארות על לוחות הכיסוי התחתונים של 96 בארות ושטפו את התאים פי 3 עם PBS. בעזרת פיפטה, הוסיפו בעדינות את ה-DNA:PEI לתאים ונערו בעדינות את הצלחת. לדגור על התאים עם 5% CO2 ב 37 ° C במשך 3 שעות.
    5. לאחר הדגירה, יש להוסיף 200 μL של מדיום חיוני מינימלי טרי לתאים, לנער בעדינות את הצלחת ולדגור במשך 24 שעות עם 5% CO2 ב-37°C.
      הערה: PEI הוא ציטוטוקסי; לפיכך, מומלץ לא לדגור על תאים לאחר transfection במשך יותר מ 24 שעות.
    6. למחרת, השליכו את המדיה ושטפו תאים 2x עם PBS. הוסף מדיה מלאה DMEM המכילה 500 מיקרוגרם / מ"ל גנטיקין (G418) ו 1 מיקרוגרם / μL dox לתאים ולדגור במשך 24 שעות.
  3. תיקון הדגימות למיקרוסקופ קונפוקלי
    1. כדי לתקן את כל הדגימות, לשטוף את התאים עם 1x PBS 3x, להוסיף 100 μL של 4% paraformaldehyde לתאים, ולדגור ב RT במשך 10 דקות.
    2. שטפו את התאים עם PBS 3x. לאחר השלמת הכביסה, יש להוסיף 1 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לתאים ולדגור ב-RT למשך 15 דקות בחושך.
    3. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים 3x עם PBS. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לביטוי GFP וצביעת DAPI.

8. רכישת תאים נגועים במיקרוסקופ קונפוקלי וכימות

  1. נקו את תחתית הכיסוי של הבארות באמצעות רקמה סופגת. הפעל את הפקדים של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. לאחר מכן, הפעל את המדחס ואת מנורת כספית.
  2. כדי להפעיל את המכונה, יש להפעיל ברצף פקדי מיקרוסקופ, בקרת ראש סריקה, מפתח לייזר, מודול לייזר, מנורה, בקר מיקרוסקופ ומעבד.
  3. במחשב, פתח את התוכנה (רשימת חומרים) ולחץ על הפעל בקרת שלב XY. ייפתח פופ-אפ שיבקש ביצוע ניקוי עבור 7S3. לחץ על לא. סגור את הגרף החי וכוונן את מסכי ההגדרות.
  4. למטרה של 60x, הוסיפו טיפה של שמן טבילה, הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות על הבמה, והזיזו את הבמה במישור X-Y כדי להתאים את מיקום המטרה על הבאר. לחץ על העין ובחר ערוץ Alexa-488. לחץ על Shutter Off כדי למקד את התאים בעינית. כוונן את העינית לפי ליבה ומיקוד עדין.
  5. לחץ על Shutter On נוכח בתיבת הבקרה של המיקרוסקופ והזז את המטרה כדי להתאים את מיקומו ולמקד את אזור העניין כדי לצפות בתאים בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC). עבור למצב EPI בתיבת הבקרה של המיקרוסקופ כדי לצפות בתאים במסנן אורך הגל Alexa-488 עבור ביטוי GFP. התאים אמורים להופיע בירוק.
  6. לחץ על Shutter Off, עבור אל הדמיית LSM ובחר את הרזולוציה עבור התמונה כ- 1,024 x 1,024. לחץ על הוסף שלב וגרור כדי להוסיף ערוץ ירוק כשלב.
  7. בתוכנית אולימפוס לחץ על LSM ולחץ נוסף על כפתור חי כדי לצפות בתאים בניגודיות פאזה ובערוץ Alexa 488nm. הקש Control וגלול כדי למקד את התאים מהתוכנה ללכידת תמונות.
  8. כוונן את הרווח וההיסט כדי להתאים את עוצמת הפלואורסצנטיות שנלכדה על ידי הגלאי. לחץ על לכידה, תן שם לתמונות ולחץ על שמור.
  9. בתוכנת הדמיה, לחץ על קובץ, בחר את כל התמונות עם הסיומת .oir, ולחץ על פתח.
  10. לחץ על תצוגת אריחים כדי להמחיש תמונות בכל הערוצים. כדי להוסיף סרגל קנה מידה לתמונות, לחץ על תצוגה ולאחר מכן בחר באפשרות סרגל קנה מידה .
  11. לשמירת תמונות מערוצים בודדים בגווני אפור של 16 סיביות, לחצו על 'קובץ' ובחרו 'יצא תמונה'. בחר את התמונה ובדוק את סימוני השנתות בכל הערוצים. בכרטיסיה בחירת מסגרת באפשרות התצוגה המפוצלת, בחר כן. בכרטיסייה 'פלט', בחרו בצבע RGB של 24 סיביות עם אפשרות פרטי הצריבה ובחרו tiff כסוג הקובץ של התמונה. בייצוא לתיקייה, בחר את מיקום הקובץ המתאים לשמירת התמונות ולאחר מכן לחץ על אישור.
  12. כדי לשמור תמונות ממוזגות, בצע את אותם השלבים, למעט, באפשרות התצוגה המפוצלת, בחר לא, ובכרטיסייה פלט, בחר ערוצים ממוזגים עם מידע צריבה.
  13. כדי לנתח את הביטוי של GFP בתאים, פתח את פיג'י ב- Windows וייצא את קובץ tiff. בחר בצבע ירוק כדי לנתח ביטוי GFP.
  14. בחרו באזור התא בעזרת הכלי החופשי ולחצו על 'אנליזה' למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות. חזור על התהליך עבור 3 תמונות.
  15. לייצא את הנתונים לתוכנת ניתוח ולבצע בדיקות סטטיסטיות על הנתונים המכומתים.

9. בדיקת עומס טפילים

  1. תוך כדי הדמיה של התאים במיקרוסקופ קונפוקלי, ספרו את המספר הכולל של הטפילים הקיימים במקרופאגים בודדים.
  2. בדקו באופן אקראי 100 מקרופאגים ושימו לב למספר הטפילים התוך-תאיים. בדיקה סטטיסטית Perfom בין נקודות זמן נגועות לנקודות זמן של דגימות IMTI כדי לבחון את ההשפעה של ביטוי SDHA על ספירת הטפילים.

10. כימות של IL-10 ו- IL-12 באמצעות בדיקת Immuno Sorbent Assay מקושרת אנזים (ELISA)

  1. הכינו דגימות לפי שלבים 7.1 ו-7.2 ואספו את המדיה בצינור של 1.5 מ"ל. שמור את המדיה על קרח או לאחסן אותה ב -20 ° C עד לשימוש חדש. בצע את ההוראות הידניות של ערכת המשתמש ובצע ELISA עבור IL-10 ו- IL-12.

11. פרופיל ציטוקינים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת בשעתוק לאחור (qRT-PCR)

  1. הכינו את הדגימות לפי שלבים 7.1 ו-7.2. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה ולהוסיף 500 μL של מגיב TRIzol ולדגור על התאים למשך 2 דקות ב-RT.
    הערה: שלבי בידוד RNA יבוצעו בארון זרימה למינרית כאמצעי זהירות מפני זיהום RNase.
  2. לאסוף את הדגימות בצינור 1.5 מ"ל, להוסיף 100 μL של כלורופורם להם, ולערבב על ידי היפוך צינורות 5x-8x. לדגור על הדגימות במשך 15 דקות ב- RT. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  3. שלוש שכבות ייצפו, לאסוף את השכבה העליונה מימית שקופה בצינור טרי 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של איזופרופנול לשכבה המימית, ערבב היטב על ידי היפוך 10x, ודגר על הדגימות במשך 15 דקות ב RT. לאחר כל 5 דקות מערבבים שוב את הדגימות על ידי היפוך הצינורות.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף את הגלולה 2x עם 75% אתנול המיוצר ב-0.1% Diethyl pyrocarbonate (DEPC) המכיל מים למשך 5 דקות וצנטריפוגה ב-8,000 x גרם ב-4°C.
    הערה: DEPC המכיל מים מפרק RNases, ולכן מומלץ להשתמש בו לבידוד RNA.
  5. לבסוף, יש לייבש את הגלולה באוויר למשך 5 דקות ב-RT, להמיס אותה ב-20 מיקרוליטר של DEPC המכיל מים, ולמדוד את ריכוז הרנ"א המבודד, יחס 260/280 ו-260/230, באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: יחס 260/280 צריך להיות בערך 2.0, אשר בדרך כלל מעיד על צורה טהורה של RNA, ואת היחס 260/230 צריך להיות בין 2.0-2.2 על מנת לשקול כי RNA מבודד הוא ללא תרכובות כימיות לא רצויות כגון TRIzole.
  6. להכנת 20 μL מכל דגימת cDNA, הפשירו את הריאגנטים על קרח ותנו להם סיבוב קצר במשך 15 שניות ב-RT. תנו סיבוב קצר לכל הריאגנטים ואפילו לדגימות הרנ"א לפני השימוש.
  7. בצינור אוטוקלאבי של 100 μL, קח 0.8 μL של 25x dNTP, 2 μL של 10x Primer, 2 μL של 10x buffer. הוסף ריכוז של 1 מיקרוגרם/μL של RNA והוסף 0.5 μL של אנזים שעתוק הפוך. לפצות את נפח עד 20 μL באמצעות DEPC המכיל מים.
  8. תן לדגימות cDNA סיבוב קצר למשך דקה אחת ב- RT. שמור את הדגימות על קרח.
  9. הפעל את המחזור התרמי, פתח את הבורג בלוח העליון כדי לשחרר את המחזיק, והנח את הדגימות על הבלוק. לאחר הנחת הדגימות, הבריגו את המכסה בחוזקה.
  10. לאחר הפעלת המערכת, לחץ על הפעל. בחר באפשרות Main ולאחר מכן היכנס לתפריט Programs ובחר באפשרות CDNA . הגדר את נפח הדגימה כ- 20 μL ולחץ על RUN. המחזור התרמי מפעיל את התוכנית בארבעה שלבים. הצעד הראשון הוא 25 ° C במשך 10 דקות, השני הוא 37 ° C במשך 2 שעות, השלישי הוא 85 ° C במשך 5 דקות, ואת השלב האחרון הוא 4 ° C לנצח.
  11. לאחר שהמחזור נכנס לשלב הרביעי, לחץ על Enter וסיים את המחזור. אסוף את הדגימות והמשך ל- qRT-PCR. אחסן דגימות RNA ב -80 ° C ודגימות cDNA ב -20 ° C.
  12. לזיהוי ציטוקינים, הפשירו את הריאגנטים הנדרשים 2x PCR Master mix, cDNA ובדיקות עבור TNF-α, IFN-γ, TGF-β ו-NFW על קרח.
    הערה: כל הריאגנטים, תערובות התגובה והדגימות חייבים להישמר על קרח.
  13. בצינור של 100 μL, הכינו דגימת cDNA על ידי הוספת 1 μL של cDNA ו-3.5 μL של NFW. כדי להכין את תערובת המאסטר, לקחת 5 μL של תערובת מאסטר ולהוסיף 0.5 μL של בדיקה בצינור 100 μL. מערבבים את התוכן על ידי סיבוב קצר. חישוב מספר הדגימות וגני המטרה והכן את תמהיל התגובה בהתאם.
    הערה: הוסף NFW ותערובת מאסטר לתחתית הצינור של 100 μL. הוסף cDNA ובדיקה לדופן צינור הצנטריפוגה כאמצעי זהירות כדי להבטיח את הוספת הנפח וכדי למנוע ערבוב צולב של מגיב כלשהו.
  14. מניחים את רצועות 8 הבארות במקרר PCR. מעבירים 5.5 מיקרוליטר של תערובת אב ובקבוקון המכיל בדיקה לתחתית כל באר ברצועות 8 הקידוחים. לפיכך, חזור על השלב עבור כל גני המטרה.
  15. מעבירים 4.5 μL של תערובת cDNA ו-NFW לדופן הבאר ברצועות של 8 בארות. לפיכך, חזור על השלב עבור כל הדגימות.
  16. אוטמים את הרצועות עם המכסים ונותנים סיבוב קצר של 10 שניות כדי לערבב את הגנים והדגימות בבאר. מקם את הרצועה בחריץ הדגימה qRT-PCR וסגור את החריץ.
  17. בשולחן העבודה, הפעל את התוכנה והתחבר כאורח. חלון קופץ יופיע על המסך. לחץ על המשך ללא חיבור.
  18. בתפריט Setup, לחץ על Advanced Setup. במאפייני ניסוי, כתוב את שם הניסוי בכרטיסיה שם ניסוי. באיזה סוג ניסוי ברצונך להגדיר אפשרות, בחר Quantitation-Comparative CT (ΔΔ CT).
  19. באיזו מהירות רמפה אתה רוצה להשתמש במכשיר? לחץ על מהיר (~ 40 דקות להשלמת ריצה). בתפריט הגדרת הלוחות, הגדר שמות גנים באפשרות Define Targets והקלד את שמות הדגימות ב- Define Samples.
  20. בכרטיסייה שיטת הפעלה, הקלד 10 μL בנפח התגובה לכל באר. ממש לפני החזקת הבמה לחץ על הוסף במה ובחר שלב החזקה. שנה את הטמפרטורה ל 50 ° C ואת הזמן ל 2 דקות. בשלב ההחזקה השני לא לבצע שינויים, אשר יהיה 95 ° C עבור 1 שניות.
  21. בשלב הרכיבה שלב 1, שנה את הטמפרטורה ל 95 ° C ואת הזמן ל 3 שניות. בשלב 2, שנה את הטמפרטורה ל 60 ° C ואת הזמן ל 30 שניות. לחץ על הפעל כדי להתחיל את מחזור qRT-PCR.

12. ניתוח סטטיסטי

הערה: עבור כל הנתונים, הממוצע מיוצג כעמודה, וסטיית התקן מייצגת את סרגל השגיאה בגרף עמודות (ערך p< 0.05 נחשב משמעותי).

  1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים והכנס את הנתונים המתקבלים מהניסוי הקונפוקלי.
  2. לניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית, החל ANOVA חד-כיווני רגיל עם מבחן התיקון של Tukey להשוואה בין קבוצות מרובות עבור ביטוי GFP. שקול את הנתונים עם p < 0.05 כמובהקים סטטיסטית. הכן ייצוג גרפי של הנתונים כאשר הממוצע מיוצג כסרגל וסטיית התקן מייצגת את סרגל השגיאה.
  3. לבדיקת עומס טפילים, צרו גיליון חדש והזינו את נתוני ספירת הטפילים עבור 100 מקרופאגים. החל ANOVA חד-כיווני רגיל עם תיקון של Tukey בין כל הדגימות. שקול את הנתונים עם ערך p< 0.05 כמובהקים סטטיסטית.
  4. עבור ELISA, בצע ANOVA דו-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey. עבור qRT-PCR, בצע ANOVA בכיוון אחד עם בדיקת התיקון של Tukey.

תוצאות

סידור החלקים הגנטיים המרכיבים את המעגל הסינתטי לביטוי המעגל הסינתטי מוצג באיור 1A. החלקים המתאימים שוכפלו בווקטור pEGFP-N1 בצורה אורתוגונלית ומודולרית, המיוצגת באיור 1B. הסימולציה של המעגל הסינתטי חשפה דינמיקה תנודתית הן ב-SDHA והן במדכא הטטרציקלין. תצפית זו מצב?...

Discussion

התוצאות המתקבלות מדגישות את היעילות של הצינור, אשר כבר מתועל לתכנון ויישום של מעגל סינתטי. בניית המעגל הסינתטי הזה הייתה צעד לקראת פיתוח רפואה מדויקת למחלות זיהומיות כמו לישמניאזיס. באמצעות הרכבה בסיליקו של חלקים גנטיים וסימולציה דטרמיניסטית, נוטרה ההשפעה המודולרית הייחודית של מער?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות למנהל המועצה למחקר וחדשנות ביוטכנולוגיה - המרכז הלאומי למדעי התא (BRIC-NCCS), פונה על התמיכה במחקר שלנו ובמתקן הביואינפורמטיקה BRIC-NCCS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestriction digestion
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFischer ScientificD1306nuclear staining
50mL tubeCorning352070
60mm platesFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plateThermoFischer Scientific160376For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539For AGE
Agarose gel electrophoresis assemblyGeNei93For AGE
Bacterial laminar flowESCO Lifesciences2120765For transformation
Calcium chlorideMerckC4901Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flowThermoFischer Scientific1323TSFor cell culture
Cell scraperGenetix90020For cell culture
Cell spreaderFischer Scientific12822775
Centrifuge for 1.5mL tubesEppendorfEP5404000537
Centrifuge for 50mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3For RNA isolation
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110For cell culture
CuvetteEppendorf6138000018Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023For RNA isolation
DoxycyclineMerck33429For induction of transfected cells
Dry heating blockLabnetFor transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle MediumNational centre for cell scienceFor cell culture
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromideSigmaE7637For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acidFischer Scientific12635Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscopeThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine SerumGibco16000-044For cell culture
FV31S-SW softwareOlypmusImage acquisition
GeneticinGibco1563411for transfection
Gibson assembly method for cloningBIOMATIKConstruction of synthetic circuit
Graphpad prismGraphpadStatistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814for cDNA synthesis
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagent preparation
KanamycinSigma60615For transformation and colony selection
Luria Bertini brothHimediaM1245For culturing E.coli
Magnesium chlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032For qRT-PCR
Microwave ovenLGMC-7649DWFor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPFor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker AgitatorDIAB
National centre for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfor contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamberMarienfeld superior640010For cell count
Non-vented 25cm2 flaskCorning353014For culturing parasite
NotIBioLabsR3189MRestriction enzyme
Nuclease free waterBiodesign1QIAReagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusImage processing
Olympus FV 3000OlympusFor confocal imaging
OPTI-MEM mediaGibco31985070media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuitBiomatik
PenicillinThermoFischer Scientific15070063For cell culture
PolyethylenimineMERCK764965for transfection
Potassium AcetateFischer ScientificYBP364500Buffer /Reagent preparation
Potassium ChlorideFischer ScientificBP366Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate MonobasicSigmaP5655Buffer /Reagent preparation
Power supply packBIORAD1645070For AGE
Registry of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefor contruction of synthetic circuit
RNAiso PlusTakara38220090For RNA isolation
RNase AThermoFischer Scientific12091021Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute MediumNational centre for cell scienceFor culturing parasite
Shaker incubatorREMICIS 24 plusFor culturing E.coli
Sodium chlorideQualigensQ27605Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771Buffer /Reagent preparation
Sodium HydroxideFischer Scientific15895Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Buffer /Reagent preparation
SpectrophotometerEppendorfEstimation of plasmid concentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR systemLife technologies272006777For qRT-PCR
StepOne software version 2.3Life technologiesFor qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellSynthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFischer Scientific10488085For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorideHimediaMB029Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Buffer /Reagent preparation
Trypan blueSigmaT8154For cell count
XhoIBioLabsR0146SRestriction enzyme

References

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241 (2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588 (2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670 (2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125 (2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749 (2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431 (2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276 (2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118 (2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132 (2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763 (2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466 (2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823 (2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. . The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908 (2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031 (2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315 (2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved