JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Özet

İmmüno-metabolizma, leishmaniasis'in ilerlemesinde çok önemli bir belirleyicidir. Sentetik biyoloji temelli yaklaşım, leishmaniasis'i tetikleyen konakçı ile ilişkili faktörleri hedef alan terapötik müdahaleye yönelik bir adım olarak büyük ilgi görmüştür. Sentetik biyoloji, biyolojik sistemleri hassas bir şekilde modüle etmek ve hücrelere yeni işlevler kazandırmak için genetik bileşenlerin ortogonal ve modüler bir şekilde mühendisliğini gerektirir. Sunulan çalışmada, indüklenebilir tetrasiklin kontrollü (TetON) bazlı bir sentetik devrenin geliştirilmesi için sistematik bir boru hattının aydınlatılması, hücre içi Leishmania parazitlerinin ortadan kaldırılmasını kolaylaştırmak için terapötik bir ajan olarak süksinat dehidrojenazın verilmesini amaçlamıştır. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, sentetik bir devrenin tasarımını ve müteakip doğrulamasını açıklar. Önerilen strateji aynı zamanda sentetik devrelerin plazmit omurgasına bir dağıtım aracı olarak dahil edilmesine odaklanmaktadır. Ek olarak, sentetik devrelerin iletimi için poliks bazlı nano parçacıklar kullanan dağıtım makineleri, hücresel morfolojiden ödün vermeden murin makrofaj hücre hatlarında kullanıldı. Yöntemin standardizasyonu, transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi ve sentetik devre ekspresyonu için optimal indüksiyon konsantrasyonunun belirlenmesi için yapılmıştır. Gözlemler, enfekte hücrelere kıyasla transfekte edilmiş hücrelerde hücre içi parazit yükünde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Pro-inflamatuar sitokinler, parazit eliminasyonunu teşvik etmek için bir mekanizma olarak sentetik devre transfekte edilmiş ve indüklenmiş hücrelerde enfeksiyon sonrası eksprese edildi. Bu, hastalığın ilerlemesi ile ilişkili konakçı faktörleri hedef alarak leishmaniasis'te güçlü bir yaklaşım olarak sentetik biyoloji temelli yöntemin altını çizmektedir.

Giriş

Bütüncül, bütünleştirici tıbbın ilerlemesi, bağışıklık hücrelerindeki metabolik değişiklikler ile bulaşıcı hastalıklarda bağışıklık hücresi fenotipini modüle etme yetenekleri arasında tanımlanan önemli bir bağlantıdır. İmmüno-metabolizma, insanlarda yaygın bulaşıcı hastalıkların patogenezini aydınlatmak için yeni bakış açıları sunar. Ayrıca, müdahale1 için yeni hedefler belirleyerek aşıların ve ilaçların geliştirilmesi için umut verici teknikler sağlar. Bağışıklık hücrelerinin metabolik olarak yeniden programlanması, leishmaniasis dahil olmak üzere çeşitli bulaşıcı hastalıklarda tanımlanır. Leishmania spp. Leishmania majör (L. majör) kutanöz leishmaniasis'e (CL) neden olan leishmaniasis'e neden olmaktan sorumludur. L. majör parazitler, hücre içi parazitler olarak çoğalma ve hayatta kalma için, özellikle makrofajlarda, konakçı hücrelerin metabolizması üzerinde önemli bir etki ortaya çıkarır2. Makrofajlar tipik olarak, M1 hücrelerinin nitrojen türlerinin metabolizması yoluyla yüksek proinflamatuar sitokin sekresyonuna ve nitrik oksit (NO) üretimine sahip olduğu klasik olarak aktive edilmiş (M1) veya alternatif olarak aktive edilmiş (M2) alt kümelere polarize olabilir. M2 hücreleri, yüksek seviyelerde anti-inflamatuar sitokinler sergiler ve nitrojen metabolizması3 yoluyla yüksek arginaz aktivitesi gösterir. Bu nedenle, her iki fenotip de sadece bağışıklık tepkileri ile değil, aynı zamanda metabolik yolakları açısından da farklılık gösterir.

Leishmaniasis'in sistem biyolojisi, ilaç tasarımı ve geliştirilmesi yoluyla yeni terapötikler tasarlamak için moleküler hedefleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Sinyal ağlarının ve metabolik yolakların yeniden yapılandırılması, leishmaniasis'in bütüncül bir model olarak anlaşılmasına yardımcı olur ve hastalıklı durumu yönlendiren temel bileşenin tanımlanması için içgörü sağlar. Matematiksel modelleme, leishmaniasis4'ün karmaşıklıklarını anlamak için en çok tercih edilen uygulamalı analitik yaklaşımlardan biridir. İmmünometabolik ağlar ve matematiksel modeller, paraziti ortadan kaldırmak için ifade edilen M1 fenotipinin önemli bir bileşeni olarak süksinat dehidrojenazın (SDHA)tanımlanmasını sağladı 5. Sentetik biyolojinin leishmaniasis'te teşhis, aşı geliştirme ve terapötiklerde uygulamaları vardır. İmmün yanıt modülasyonunu hedefleyen metabolizma, sentetik biyoloji araçları ile sağlanabilir. Sfingolipid metabolizmasını düzenleyen ve konak immün sinyalizasyonunu değiştiren inositol fosforil seramid sentazın modülasyonu için, L. majör enfeksiyon modeli 6,7'nin içsel sağlamlığını sentetik olarak ayarlamak için iki durumlu davranışa sahip bir genetik devre kullanıldı. Bu nedenle, sistemler ve sentetik biyoloji, Leishmania model sisteminde hassas tıbbın geliştirilmesi için model tabanlı bir genetik mühendisliği platformu sağlayabilir.

M1 fenotipi, inflamatuar sitokinlerin ve metabolik yolların üretiminin parazit eliminasyonunu sinerjik olarak arttırdığı immüno-metabolik sinyal ağlarının ekspresyonu ile işaretlenir. M1 polarizasyonu, İnterlökin-12 (IL-12), interferon-gama (IFN-γ) ve Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi proinflamatuar sitokinlerin üretimini gösterir. M1 fenotipinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metabolik yollar arasında glikoliz, pentoz fosfat yolu ve kesik trikarboksilik asit döngüsü (TCA döngüsü) bulunur5. Kesilmiş TCA döngüsü, parazit eliminasyon makinelerini artan süksinat ve sitrat seviyeleri yoluyla yönlendirir ve bu da NO3 üretimine rehberlik eder. SDHA ile süksinat birikimi, IL-1β8 üretimini indükleyen transkripsiyon faktörü hipoksi ile indüklenebilir faktör 1-alfa'nın (HIF-1α) aktivasyonuna yol açar. M2 fenotipinde, İnterlökin-10 (IL-10), Transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β), İnterlökin-4 (IL-4) ve İnterlökin-13 (IL-13) gibi anti-inflamatuar sitokinlerin üretimi ile birlikte yağ asidi oksidasyonu, glutamin kullanımında artış ve glikozun artmış oksidatif fosforilasyonu gözlenir3. M2, ayırt edici bir özellik olarak uzamış mitokondri sergiler ve bu da enerji üretiminde verimliliğin artmasına yol açar. TCA döngüsünü beslemek için substrat olarak yağ asitleri, glikoz ve glutamin kullanırlar, böylece parazit büyümesini ve çoğalmasını teşvik etmek için daha yüksek oranda oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretirler9. Kesilmiş TCA yoluyla süksinat birikiminden sorumlu SDHA enzimi, yalnızca NO üretimini teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda elektron taşınması yoluyla süksinat bağımlı bir oksijen tüketimini de başlatır10. Leishmania ile enfekte makrofajlarda, SDHA 2.17 kat aşağı regüle edilir, bu da aerobik solunumun da aşağı regüle edilebileceğini gösterir11. Proinflamatuar sitokin aracılı NO üretimini indüklemek ve parazit eliminasyonunu teşvik etmek için süksinat tüketimini artırmak için SDHA ekspresyonu esastır.

Sentetik devre, uzay-zamansal düzeyde sağlıklı fenotipi geri yükleyebilecek iki durumlu bir salınım elde etmek için hastalıklı sistemi değiştirebilecek hassas hedefli tedaviler sunar. Sentetik devre iletimi ve ifadesi, sistemi dinamik ve sağlam hale getirir. Sentetik biyolojinin ilerlemesine katkıda bulunan önemli bir faktör, karmaşık mimarilerin ve özel işlevlerin oluşturulmasını sağlamak için genetik parçaları ve elementleri modüler bir şekilde bir araya getirme yeteneğinde yatmaktadır12. Geleneksel ekspresyon teknikleriyle ilişkili kısıtlamalar, tetrasiklin operon bazlı indüklenebilir plazmit sentetik devrelerinin ortaya çıkmasını teşvik etmiş, böylece plazmitin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine ve çeşitli hücre tipleri arasında kolay dağıtıma izin vermiştir13. Tetrasikline duyarlı baskılayıcı (TetR) proteini, bir dimer olarak mevcut olduğunda, tet operonuna (TetO) güçlü bağlanma afinitesi gösterir ve transkripsiyonu etkili bir şekilde baskılar. Bununla birlikte, ligandı olan doksisiklin (dox) etkileşimi üzerine, TetR yapısal bir değişikliğe uğrar, bu da TetO'dan ayrışmasına neden olur ve sonuç olarak transkripsiyonun engellenmeden ilerlemesine izin verir. Bu devre, protein translasyon kontrolü14 sergileyebilir. Bu nedenle, tanımlanan metodoloji aracılığıyla, tasarlanan tetrasiklin operon tabanlı indüklenebilir plazmit sentetik devresinin pEGFP-N1 vektöründe SDHA'yı eksprese etmesi sağlandı. Devrenin dönüşüm verimliliğinin ve veriminin değerlendirilmesi, teslimatın yeterliliği hakkında içgörüler sağladı. Vektörün kısıtlama sindirimi yoluyla, klonlama verimliliğinin belirlenmesi doğrulandı. Ayrıca, Transfekte edilmiş hücrelerde doksisiklin dozuna bağlı yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu için Balb / c farelerinin peritoneal makrofajlarından türetilen transfekte edilmiş bir RAW264.7 fare makrofaj hücre hattı gözlenmiştir. Ek olarak, transfekte edilmiş hücrelerdeki parazit eliminasyon etkisi, sentetik devrenin bir ifadesi ile doğrulandı. Ayrıca, pro-inflamatuar sitokinlerin indüksiyonu ve ekspresyonu gözlendi, bu da sentetik devrenin işleyişi ile doğrudan ilişkili olan sentetik devre transfekte edilmiş ve indüklenmiş hücrelerde enfeksiyon zaman noktasında bir artış yoluyla yönlendirildi.

Protokol

1. RAW264.7 hücrelerinin hücre kültürü

NOT: Deneme için düşük pasaj numaraları kullanın. RAW264.7 hücre hattı, Pune'daki Biyoteknoloji Araştırma İnovasyon Konseyi-Ulusal Hücre Bilimleri Merkezi'nin (BRIC-NCCS) Ulusal Hücre deposundan temin edildi. RAW264.7 hücre hattı bir makrofaj hücre hattı olduğundan, artan geçişlerle farklılaşmaya başlayabilir. Hücreleri canlandırdıktan sonra, 2 geçişten sonra transfeksiyon için hücre hattını kullanın.

  1. 25 cm'lik 2 bir şişede RAW264.7 hücre hattının 5 x10 5 hücresini tohumlayın, 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve tam bir ortam olarak 100 IU / mL penisilin ile desteklenmiştir.
  2. Büyüme ve çoğalma için hücreleri, %90 birleşme sağlanana kadar 37 ° C'de% 5 CO2 içeren bir inkübatörde tutun.
  3. Ortamı atın ve 3x'i 1x Fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın. Şişeye 1 mL PBS ekleyin, hücreleri bir kazıyıcı kullanarak kazıyın ve hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
  4. Hücreleri 24 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 1 mL DMEM tam ortamında 1 mL pipet kullanarak yeniden süspanse edin.
  5. Canlı hücrelerin yüzdesini belirlemek için %0,5 tripan mavisi kullanarak hücre sayma odasındaki hücreleri sayın.

2. L. majör parazitin hücre kültürü

NOT: L. major promastigotlar (MHOM/Su73/5ASKH) BRIC-NCCS'nin bir hediyesiydi. Promastigotların geçiş numarası 10'dan az olmalıdır. Daha düşük geçiş sayısı, parazitin sağlıklı olmasını ve makrofajları enfekte etme yeteneğinin daha yüksek olmasını sağlar.

  1. Roswell Park Memorial Institute Medium'da (RPMI) L . major promastigotları (MHOM / Su73 / 5ASKH) tam bir ortam olarak% 20 FBS ile desteklenmiştir.
  2. 5 mL tam ortam içeren havalandırılmamış 25 cm'lik2 şişede 1 x 106 promastigot tohumlayın. Şişeyi 5 gün boyunca 27 ° C'de inkübe edin ve parlak alan mikroskobunda 20x'te sabit faz promastigot L. majör parazitini gözlemleyin.
    NOT: Sabit faz promastigotları, kültürlemeden 4-7 gün sonra elde edilebilir. Uzamış kamçılı durumları ve azalmış motiliteleri ile karakterize edilirler.

3. Plazmidde bir dağıtım vektörü olarak sentetik bir devre tasarlama

  1. Sentetik devrenin parçalarının tasarlanması
    1. Tinker hücre yazılımını açın ve Parçalar sekmesine ilerleyin. Kitaplıktan Promotör bileşenini seçin ve sentetik devre içindeki Sitomegalovirüs (CMV) promotörünü sembolize etmek için tuval üzerine yerleştirin. Parçalar sekmesinden TetO'ya benzer baskılayıcı bağlama bölgesini alın ve CMV promotörü ile sorunsuz bir şekilde entegre ederek tuval üzerindeki promotöre bitişik olarak konumlandırın.
    2. Tetrasiklin operatörünü (TetO), Dahili Ribozom Giriş Bölgelerini (IRES) ve kodlama bölgesini, baskılayıcı bağlanma bölgesini, ribozom bağlanma bölgesini (rbs) ve kodlama bölgesini tuval üzerine sürükleyip bırakarak birleştirin ve bunları mevcut genetik bileşenlerle entegre edin.
    3. Kodlama bölgesini, sentetik devre içinde varsayılan bir negatif düzenleyici olarak işlev gören tetrasikline duyarlı baskılayıcıyı belirten TetR olarak yeniden adlandırın. Sentetik parçaların yapımını kolaylaştırmak için bu genetik elementleri birleştirin.
    4. Tuval üzerine, domuz teskovirüsü-1 2A (P2A) gibi hücresel proteazlar tarafından bölünebilecek şekilde tasarlanmış bir ara bölge (sd1) ekleyin. İlgilenilen geni temsil eden ek bir kodlama bölgesi ekleyin, onu sentetik yapıya SDHA olarak etiketleyin ve diğer elementlerle entegre edin.
    5. SDHA kodlama bölgesine bitişik, hücresel proteaz P2A tarafından bölünebilecek başka bir proteaz bölünebilir aralayıcı bölgesini (sd2) entegre edin. Raportör geni temsil eden bir kodlama bölgesi tanıtın ve bunu yapıya GFP olarak etiketleyin.
      NOT: GFP ifadesi, SDHA üretimi için bir tahmin sağlayabilir ve sentetik devrenin mantıksal bir işleyişesahip olmasını sağlayabilir 13.
    6. GFP'nin yanına bir sonlandırıcı (ter1) ekleyin ve tüm parçaların bağlı olup olmadığını kontrol ederek monte edilen parçaları doğrulayın. Herhangi bir parçaya tıklandığında devre kırmızı görünmelidir. Bu, işlevsel bir genetik devrenin oluşumunu doğrular.
    7. Reaksiyon sekmesinden, sentetik devre içindeki translasyon reaksiyonunu tanımlamak için protein üretimi için parametreleri ve başlangıç değerlerini içeren düzenleyici oranları TetR, SDHA ve GFP'ye atayın.
    8. Parçalar sekmesinden küçük bir molekül ekleyin, Doksisiklin (dox) olarak adlandırın ve Parçalar ve Bağlantı sekmesinden Giriş'i seçerek ve ardından Dalga Girişi'ne tıklayarak ona bir dalga fonksiyonu atayın.
    9. Yönetmelik sekmesinden, Baskı Tepkisi'ne tıklayın. Reaksiyon Hızını tuval üzerinde dox ve TetR arasında sürükleyip bırakın. Dox üzerindeki Dalga Fonksiyonu simgesine çift tıklayarak ve Doxyxycline.sin.amplitude'u 10'a ayarlayarak dox ve TetR arasındaki reaksiyon kinetiğini ayarlayın.
    10. TetR proteini ile baskılayıcı bağlanma bölgesi arasındaki transkripsiyonel düzenleyici reaksiyonu, Düzenleme sekmesinden reaksiyonu seçerek ve TetR ile TetO arasındaki tuvale yerleştirerek uygulayın.
    11. Her bir Bileşen ve Reaksiyona çift tıklayarak, simülasyon için bir başlangıç konsantrasyonu ve parametresi ayarlayın. Simülasyon'a tıklayın, Deterministik'i seçin ve devreyi 100 zaman birimi için simüle edin. Grafikle birlikte açılan kontrol panelinden simülasyon grafiğini ayarlayın ve SDHA ve TetR proteinleri için grafik modelini gözlemleyin.
  2. iGEM parça kayıt defterinden genetik bileşenlerin tanımlanması
    1. Standart Biyolojik Parçaların Kayıt Defterini (Malzeme Tablosu) açın ve Ara'ya tıklayın. Genetik bileşenin adını girin, örneğin CMV promotörü.
      NOT: iGEM ID arama işlemi, sentetik devrenin tüm genetik bileşenleri için gerçekleştirilmelidir. CMV destekleyicisinin iGEM ID'sini belirleme adımları listelenmiştir; Daha sonra, diğer bileşenler için adımlar tekrarlanmalıdır.
    2. CMV promotörün nükleotid dizisini elde etmek için, Parça Sırasını Al seçeneğine tıklayın ve dosyayı bir metin dosyası olarak kaydedin.
      NOT: Tüm genetik parçaların stoklarının mevcut olduğuna dikkat etmek çok önemlidir.
    3. SDHA hariç tüm genetik parçalar (tetrasiklin operatörü, Kozak dizisi, TetR, P2A ve GFP) için adım 3.2.1 ve adım 3.2.2'yi tekrarlayın.
    4. SDHA'nın protein kodlama dizisini elde etmek için NCBI'yi açın ve arama penceresinin yanındaki açılır menüden Nucleotide'ı seçin. Süksinat dehidrojenaz ve Mus musculus yazın ve nükleotid dizisini arayın.
    5. SDHA'nın kodlama sırasını almak ve diziyi bir metin dosyasına kaydetmek için CDS seçeneğine tıklayın.
    6. Tüm genetik düzenleyici parçaların nükleotid dizisini sırayla tek bir dosyada birleştirin. Kozak dizisinden hemen sonra başlangıç kodonu (ATG) ekleyin ve yeni ortaya çıkan polipeptitlerin oluşumunu önlemek için dahili durdurma kodonlarını çıkarın.
    7. ExPASy web sitesini15 açın ve nükleotid dizisini yapıştırın. Diziyi Çevir seçeneğine tıklayın. 5'3' Çerçeve 1'i seçin ve sonuçlar bölümünde kırmızı ile vurgulanacak olan durdurma kodonlarını çıkarın.
      NOT: Nükleotid dizisinin istenen polipeptit dizisine etkili bir şekilde çevrilip çevrilmediğini belirlemek için ExPASy gibi bir çeviri aracı kullanılabilir. Bu, istenmeyen yeni ortaya çıkan polipeptitlerin önlenmesini sağlar. Sentetik devreyi ifade etmek için pEGFP-N1 vektörünün seçimi, CMV promotörü ve GFP geninin vektör içinde önceden var olduğu göz önüne alındığında optimaldir. Tüm genetik parçalar, bir klonlama protokolü (dış kaynaklı) kullanılarak bir araya getirildi. Ekleri klonlamak için kullanılan kısıtlama enzimleri NotI ve XhoI'dir. Bu restriksiyon enzim bölgeleri, pEGFP-N1 vektörünün çoklu klonlama bölgesi içinde bulunur.

4. Escherichia coli (E.coli) DH5α hücrelerinde sentetik devrenin dönüşümü

  1. E.coli DH5α yetkin hücrelerin hazırlanması
    NOT: Reaktiflerin otoklavlanması önerilir. Reaktifler kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
    1. 37 ° C, 180 rpm'de 50 mL Luria Suyu (LB) içinde 1 mL taze aşı kültürü. 600 nm'de 0.4-0.6'lık bir optik yoğunluk (OD) elde edilene kadar hücreleri yaklaşık 2 saat büyütün.
    2. Hücreleri 4,696 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. 50 mL santrifüj tüpünü ters çevirerek ve hücre peletini hasat ederek süpernatanı atma şişesine manuel olarak atın.
    3. Peleti 2 mL buz gibi 0.1 M Magnezyum klorür (MgCl2) 1 mL'lik bir pipet kullanarak nazikçe yeniden süspanse edin. Buz gibi soğuk MgCl 2 ile 20 mL'ye kadar ses seviyesini telafi edin.
    4. Tüpü 4,696 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 1 mL buz gibi soğuk 0.1M Kalsiyum klorür (CaCl2) içinde 1 mL'lik bir pipet kullanarak hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin ve 2 saat buz üzerinde inkübe edin. Dönüşüm için yeni yapılmış yetkin hücreleri kullanın.
  2. Sentetik devre yapısı ile yetkin hücrelerin dönüşümü
    1. 50 μL yetkin hücreleri ölçün ve hücreleri 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Alikota 10 ng sentetik devre yapısı ekleyin ve 3 dakika buz üzerinde tutun.
    2. Kuru bir ısıtma bloğunda 3 dakika boyunca 42 ° C'de ısı şoku hücreleri. Kuru ısıtma bloğu üzerindeki inkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri 3 dakika boyunca tekrar buzun üzerine koyun, hücrelere 1 mL LB ekleyin ve 37 ° C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.
    3. İnkübasyon tamamlandığında, hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 4.696 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı 1 mL'lik bir pipet kullanarak atın. Hücreleri 100 μL LB içinde yeniden süspanse edin ve 50 μg / mL kanamisin içeren LB agar üzerine koyun. Plakayı ters çevirin ve 37 °C'de 24 saat inkübe edin.

5. Sentetik devre yapısının izolasyonu

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 10 mL LB ortamı alın ve plazmit izolasyonu için kültüre dönüştürülmüş hücrelere bir seçim suyu olarak 50 μg / mL kanamisin ekleyin. 200 μL'lik bir uç kullanarak dönüştürülmüş bir koloniyi alın ve seçim suyuna ekleyin.
  2. Bir aşılama döngüsü kullanarak, başka bir tek koloni seçin, beşgen tekniği kullanarak bir plaka çizin ve tek koloni izolatlarını korumak için 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  3. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de 180 rpm'de büyütün. Ertesi gün, kültürü 24 ° C'de 20 dakika boyunca 4.696 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve 1 mL yeniden süspansiyon tamponu ekleyin (50 mM Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl), 10 mM Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), 100 μg/ mL RNaz A (pH-8.0)) pelete ve hafifçe pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
    NOT: Tamponu yeniden askıya almak için, karışımı hücre peletine eklemeden 5 dakika önce RNase A ekleyin.
  4. Karışımı RT'de 5 dakika inkübe edin. Hücrelere 1 mL lizis tamponu (0.2 N Sodyum Hidroksit (NaOH),% 1 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)) ekleyin ve tüpü 2 dakika ters çevirerek karıştırın. Tüpü RT'de 5 dakika inkübe edin.
  5. Hücrelere 1 mL nötralizasyon tamponu ekleyin (3 M Potasyum Asetat (CH3CO2K)) ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Hücreleri RT'de 20 dakika boyunca 4.696 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
  6. Süpernayana 500 μL izopropanol ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Süpernatanı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve ardından 12.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Kuluçka süresi 5 dakika ile 1 saat arasında değişebilir. Bu sırada, içeriğin her 5 dakikada bir ters çevrilerek nazikçe karıştırılması tavsiye edilir.
  7. Süpernatanı atın, pelete 1 mL %70 etanol (soğutulmuş) ekleyin ve 12000 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  8. Peleti havayla kurutun ve elde edilen plazmiti 20 μL steril nükleaz içermeyen su (NFW) içinde yeniden süspanse edin. 260/280 nm dalga boyunda bir spektrofotometrede plazmit konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: Plazmit konsantrasyonu nanodrop ile tahmin edilemeyecek kadar yüksekse daha fazla NFW ekleyin. Plazmid seyreltme işlemi laminer bir başlıkta gerçekleştirilmelidir.

6. Sentetik devrenin agaroz jel elektroforezi (AGE)

  1. AGE için plazmit örneğinin hazırlanması
    1. 1.5 mL'lik bir tüpte 20 μL 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) ölçün. 4 μL 6x yükleme tamponu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.
    2. Tüpe hızlı bir dönüş yapın, 1 μg sentetik devre plazmit vektörü ekleyin ve karışımı pipetleyerek iyice karıştırın. Bu reaksiyon karışımı agaroz jel üzerine yüklenebilir.
      NOT: Plazmit yapısına zarar verebileceğinden sıkı pipetlemeden kaçının. Bunun yerine, reaktifleri karıştırmak için hızlı bir dönüş yapın.
  2. Sentetik devrenin kısıtlama sindirimi
    1. 1.5 mL'lik bir tüpe 2 μL 10x kısıtlama tamponu, 1 μL NotI ve 1 μL XhoI kısıtlama enzimi ekleyin ve içeriğe hızlı bir dönüş yaparak iyice karıştırın. 1 μg sentetik devre plazmit vektörü ekleyin ve içeriğe hızlı bir dönüş yapın.
    2. İçeriğe NFW ekleyerek ve tüpe hızlı bir dönüş yaparak tüpün hacmini 20 μL'ye yükseltin. Tüpü 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    3. İnkübasyon sonrası, kısıtlama enzimlerini devre dışı bırakmak için tüpü kuru bir ısıtma bloğunda 15 dakika boyunca 70 ° C'de tutun. Tüpün içeriğini soğutun ve reaksiyon karışımına 6 μL yükleme tamponu ekleyin. Tüpe hızlı bir dönüş yaparak içindekileri karıştırın. Bu reaksiyon karışımı agaroz jel üzerine yüklenebilir.
    4. Agaroz jeli ayarlayın ve daha önce açıklanan bir protokol16 kullanarak jeli çalıştırın. Kısaca, her bir oyuğa 20 μL numune yükleyin, 5 μL 1 Kb DNA merdiveni yükleyin ve jeli 100V'de çalıştırın. Elektroforez tamamlandıktan sonra güç kaynağının bağlantısını kesin, jeli bir jel görüntüleyicide alın ve bantları görüntülemek için floresan seçeneğini açın.

7. RAW264.7 hücre hattında sentetik devre yapısının transfeksiyonu

  1. Numunelerin hazırlanması
    1. İndüklenmiş sentetik devre ile paraziti ortadan kaldıran etkiyi belirlemek için numuneler hazırlayın. İlk örnek transfekte edilmemiş RAW264.7 hücreleri (kontrol), ikincisi 6 saat (6 saat Enfekte) boyunca L. major promastigotları ile enfekte olmuş RAW264.7 hücreleri, üçüncü örnek sentetik devre ile transfekte edilmiş ve dox (IMT) ile indüklenmiş RAW264.7 hücreleri, enfeksiyon zaman noktası örnekleri sentetik devre ile transfekte edilmiş ve L. majör ile enfekte olmuş dox ile indüklenmiş RAW264.7 hücreleridir farklı zaman noktaları için promastigotlar (IMTI) 6 saat (6 saat IMTI), 12 saat (12 saat IMTI), 18 saat (18 saat IMTI) ve 24 saat (24 saat IMTI).
    2. Tüm numuneleri hazırlamak için, RAW264.7 hücrelerini 25cm2 şişeden kazıyın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    3. Peleti 1 mL DMEM tam ortamında yeniden süspanse edin. 100 μL'lik bir tüpte 10 μL yeniden süspanse edilmiş hücre alın, hücrelere 10 μL %0.5 tripan mavisi ekleyin ve iyice karıştırın.
    4. Hücre sayma haznesi sürgüsüne 10 μL hücre ve tripan mavisi karışımı yükleyin ve 4 hazneden hücre sayımı yapın.
    5. Lamel tabanındaki plaka hücreleri, oyuk başına 2 x 104 hücreli 96 oyuklu plakalar ve hücreleri 24 saat inkübe edin. Bu örnek kontrol örneğidir. Bu adım, diğer numunelerin hazırlanması için sabit kalır.
      NOT: Kullanmadan önce ortamı bir su banyosunda 37 °C'de önceden ısıtın.
    6. 6 saatlik bir Enfekte numune hazırlamak için, 1 mL sabit faz L. majör promastigotları 10 dakika boyunca 7.273 x g'da santrifüjleyin. Peleti 500 μL DMEM tam ortamında yeniden süspanse edin ve 7.1.3-7.1.4 adımlarını izleyerek bir hücre sayma odasında hücre sayımını alın.
    7. Kuyuya 2 x 105L. majör promastigot ekleyin ve bunları 37 ° C'de 6 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin. İnkübasyon sonrası, hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    8. IMT örneğini hazırlamak için, aşağıdaki adımları (7.1.2-7.1.5) izleyerek hücreleri tohumlayın ve 7.2.1-7.2.6 transfeksiyon adımlarını gerçekleştirin.
    9. IMTI'nin zaman noktalarının örneklerini hazırlamak için 7.1.2-7.1.5 adımlarını izleyin ve 7.2.1-7.2.6 transfeksiyon adımlarını gerçekleştirin. 500 μg/mL Geneticin (G418) ve 1 μg/μL dox içeren DMEM komple ortamını atın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın.
    10. Kuyucuklara 2 x 105L. majör promastigot ekleyin ve 6 saat, 12 saat, 18 saat ve 24 saat inkübe edin. Enfeksiyon sonrası, DMEM tam besiyeri içeren promastigotları atın ve kuyuları 3x 1x PBS ile yıkayın. Hücrelere 500 μg/mL Geneticin (G418) ve 1 μg/μL dox içeren 200 μL DMEM tam besiyeri ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
  2. Sentetik devrenin transfeksiyonu
    1. 1.5 mL'lik bir tüpe, geliştirilmiş bir Minimal Esansiyel Ortam olan 24 μL İndirgenmiş Serum ortamı ekleyin. Ortama, sentetik devre plazmidi ile klonlanmış 1 μg pEGFP-N1 vektörü ekleyin.
    2. 1.5 mL'lik taze bir tüpe 24 μL Minimal Esansiyel Ortam ekleyin ve 1 μL Polietilenimin (PEI; 1 μg / μL) ekleyin. Karışımı en az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
    3. PEI karışımını, DNA karışımını içeren 1.5 mL'lik tüpe aktarın. En az 10 kez damla damla pipetleyerek iyice karıştırın. DNA: PEI karışımını RT'de 10 dakika inkübe edin.
    4. Ortamı 96 oyuklu lamel alt plakalarındaki kuyulardan atın ve hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Bir pipet kullanarak, DNA: PEI'yi hücrelere damla damla ekleyin ve plakayı nazikçe sallayın. Hücreleri %5CO2 ile 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
    5. İnkübasyondan sonra, hücrelere 200 μL taze Minimal Esansiyel Ortam ekleyin, plakayı hafifçe sallayın ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saat inkübe edin.
      NOT: PEI sitotoksiktir; Bu nedenle, transfeksiyon sonrası hücrelerin 24 saatten fazla inkübe edilmemesi önerilir.
    6. Ertesi gün, ortamı atın ve hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın. Hücrelere 500 μg/mL Geneticin (G418) ve 1 μg/μL dox içeren DMEM tam besiyeri ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
  3. Konfokal mikroskopi için numunelerin sabitlenmesi
    1. Tüm örnekleri sabitlemek için hücreleri 1x PBS 3x ile yıkayın, hücrelere 100 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
    2. Hücreleri PBS 3x ile yıkayın. Yıkama tamamlandıktan sonra, hücrelere 1 μg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve karanlıkta 15 dakika boyunca RT'de inkübe edin.
    3. İnkübasyondan sonra, hücreleri 3x PBS ile yıkayın. GFP ekspresyonu ve DAPI boyaması için hücreleri konfokal mikroskop altında gözlemleyin.

8. Transfekte hücrelerin konfokal mikroskopi ve miktar tayini ile elde edilmesi

  1. Emici doku kullanarak kuyucukların lamel tabanını temizleyin. Konfokal lazer tarama mikroskobunun kontrollerini açın. Ardından, kompresörü ve cıva lambasını açın.
  2. Makineyi çalıştırmak için mikroskop kontrolleri, tarama kafası kontrolü, lazer anahtarı, lazer modülü, lamba, mikroskop kontrolörü ve CPU sırayla açılmalıdır.
  3. Bilgisayarda yazılımı açın (Malzeme Tablosu) ve XY Stage Control'ü Etkinleştir'e tıklayın. 7S3 için temizlik yapılmasını isteyen bir açılır pencere açılacaktır. Hayır'a tıklayın. Canlı grafiği kapatın ve ayar ekranlarını ayarlayın.
  4. 60x objektife bir damla daldırma yağı ekleyin, 96 oyuklu plaka lamel alt plakasını sahneye yerleştirin ve kuyu üzerindeki objektif konumunu ayarlamak için sahneyi XY düzleminde hareket ettirin. Oküler'e tıklayın ve Alexa-488 Kanalı'nı seçin. Hücreleri göz merceğine odaklamak için Deklanşör Kapalı'ya tıklayın. Göz merceğini çekirdeğe göre ayarlayın ve ince odaklama yapın.
  5. Mikroskop kontrol kutusunda bulunan Deklanşör Açık'a tıklayın ve konumunu ayarlamak için objektifi hareket ettirin ve Diferansiyel Girişim Kontrastındaki (DIC) hücreleri gözlemlemek için ilgilenilen alana odaklanın. GFP ifadesi için Alexa-488 dalga boyu filtresindeki hücreleri gözlemlemek için mikroskop kontrol kutusunda EPI moduna geçin. Hücreler yeşil görünmelidir.
  6. Shutter Off'a tıklayın, LSM görüntülemeye gidin ve görüntünün çözünürlüğünü 1,024 x 1,024 olarak seçin. Aşama Ekle'ye tıklayın ve yeşil bir kanalı aşama olarak eklemek için sürükleyin.
  7. Olympus programında LSM'ye tıklayın ve faz kontrastı ve Alexa 488nm kanalındaki hücreleri gözlemlemek için Canlı Düğmeye tıklayın. Görüntüleri yakalamak için yazılımdan hücreleri odaklamak için Kontrol'e basın ve kaydırın.
  8. Dedektör tarafından yakalanan floresan yoğunluğunu ayarlamak için kazancı ve ofseti ayarlayın. Yakala'ya tıklayın, görüntüleri adlandırın ve Kaydet'e tıklayın.
  9. Görüntüleme yazılımında Dosya'ya tıklayın, .oir uzantılı tüm görüntüleri seçin ve Aç'a tıklayın.
  10. Tüm kanallardaki görüntüleri görselleştirmek için Döşeme Görünümü'ne tıklayın. Görüntülere bir ölçek çubuğu eklemek için Görüntüle'ye tıklayın ve ardından Ölçek çubuğu seçeneğini seçin.
  11. Tek kanallardaki görüntüleri 16 bit gri tonlamalı olarak kaydetmek için Dosya'ya tıklayın ve Görüntüyü Dışa Aktar'ı seçin. Görüntüyü seçin ve tüm kanallardaki Onay İşaretlerini kontrol edin. Bölünmüş görünüm seçeneğindeki çerçeve seç sekmesinde Evet'i seçin. Çıktı sekmesinde, yazma bilgisi seçeneğiyle 24 bit RGB rengini seçin ve görüntü için dosya türü olarak tiff'i seçin. Dışa aktar klasöründe, görüntüleri kaydetmek için uygun dosya konumunu seçin ve ardından Tamam'a tıklayın.
  12. Birleştirilmiş görüntüleri kaydetmek için, bölünmüş görünüm seçeneğinde Hayır'ı seçin ve çıktı sekmesinde Yazma Bilgisi ile Birleştirilmiş Kanallar'ı seçin.
  13. Hücrelerdeki GFP ifadesini analiz etmek için, Windows'ta Fiji'yi açın ve tiff dosyasını dışa aktarın. GFP ifadesini analiz etmek için Yeşil Renk'i seçin.
  14. Serbest araç seçeneğini kullanarak hücre alanını seçin ve floresan yoğunluğunu ölçmek için Analiz Et'e tıklayın. İşlemi 3 görüntü için tekrarlayın.
  15. Verileri bir analiz yazılımına aktarın ve niceliksel veriler üzerinde istatistiksel testler gerçekleştirin.

9. Parazit yük tahlili

  1. Hücreleri konfokal bir mikroskopta görselleştirirken, tek tek makrofajlarda bulunan toplam parazit sayısını sayın.
  2. Rastgele 100 makrofajı inceleyin ve hücre içi parazitlerin sayısını not edin. SDHA ekspresyonunun parazit sayısı üzerindeki etkisini incelemek için IMTI örneklerinin enfekte ve zaman noktaları arasında performans istatistiksel testi.

10. Enzime Bağlı İmmüno Sorbent Testi (ELISA) ile IL-10 ve IL-12'nin miktar tayini

  1. Numuneleri adım 7.1 ve 7.2'ye göre hazırlayın ve ortamı 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın. Ortamı buz üzerinde tutun veya daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın. Kullanım kiti kılavuzundaki talimatları izleyin ve IL-10 ve IL-12 için ELISA gerçekleştirin.

11. Kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) kullanarak sitokin profili oluşturma

  1. Numuneleri adım 7.1 ve 7.2'ye göre hazırlayın. Süpernatanı pipet kullanarak atın ve 500 μL TRIzol reaktifi ekleyin ve hücreleri RT'de 2 dakika inkübe edin.
    NOT: RNA izolasyon adımları, RNase kontaminasyonuna karşı bir güvenlik önlemi olarak bir laminer akış kabininde gerçekleştirilmelidir.
  2. Numuneleri 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın, üzerlerine 100 μL kloroform ekleyin ve tüpleri 5x-8x ters çevirerek karıştırın. Numuneleri RT'de 15 dakika inkübe edin. Numuneleri 12.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  3. Üç katman gözlenecektir, berrak sulu üst tabakayı 1.5 mL'lik taze bir tüpte toplayın. Sulu tabakaya 500 μL izopropanol ekleyin, 10x ters çevirerek iyice karıştırın ve numuneleri RT'de 15 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir, tüpleri ters çevirerek numuneleri tekrar karıştırın.
  4. Numuneleri 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 2x'i su içeren %0.1 Dietil pirokarbonat (DEPC) içinde yapılan %75 etanol ile 5 dakika yıkayın ve 4 °C'de 8.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Su içeren DEPC, RNazları bozar ve bu nedenle RNA izolasyonu için kullanılması önerilir.
  5. Son olarak, peleti RT'de 5 dakika havayla kurutun, 20 μL DEPC içeren su içinde çözün ve bir spektrofotometre kullanarak izole edilmiş RNA, 260/280 ve 260/230 oranının konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: 260/280 oranı, genellikle saf bir RNA formunun göstergesi olan yaklaşık 2.0 olmalı ve izole RNA'nın TRİZOL gibi istenmeyen kimyasal bileşiklerden arınmış olduğunu düşünmek için 260/230 oranı 2.0-2.2 arasında olmalıdır.
  6. Her cDNA örneğinden 20 μL'nin hazırlanması için, reaktifleri buz üzerinde çözün ve RT'de 15 saniye boyunca kısa bir dönüş yapın. Kullanmadan önce tüm reaktiflere ve hatta RNA örneklerine kısa bir dönüş yapın.
  7. Otoklavlanmış 100 μL'lik bir tüpte 0.8 μL 25x dNTP, 2 μL 10x Primer, 2 μL 10x tampon alın. 1 μg/μL konsantrasyonda RNA ekleyin ve 0.5 μL ters transkriptaz enzimi ekleyin. DEPC içeren su kullanarak hacmi 20 μL'ye kadar tamamlayın.
  8. CTNA örneklerine RT'de 1 dakika boyunca kısa bir dönüş yapın. Örnekleri buz üzerinde tutun.
  9. Termal döngüleyiciyi açın, tutucuyu gevşetmek için üst paneli sökün ve numuneleri bloğun üzerine yerleştirin. Numuneleri yerleştirdikten sonra kapağı sıkıca vidalayın.
  10. Sistem açıldıktan sonra Çalıştır'a tıklayın. Ana seçeneğini seçin, ardından Programlar menüsüne girin ve CDNA seçeneğini seçin. Örnek hacmini 20 μL olarak tanımlayın ve RUN'a tıklayın. Termal döngüleyici programı dört adımda çalıştırır. İlk adım 10 dakika boyunca 25 ° C, ikincisi 2 saat boyunca 37 ° C, üçüncü adım 5 dakika boyunca 85 ° C ve son adım sonsuza kadar 4 ° C'dir.
  11. Döngü dördüncü adıma girdiğinde, Enter'a tıklayın ve döngüyü bitirin. Örnekleri toplayın ve qRT-PCR için devam edin. RNA örneklerini -80 °C'de ve cDNA örneklerini -20 °C'de saklayın.
  12. Sitokinlerin tespiti için, TNF-α, IFN-γ, TGF-β ve NFW için gerekli reaktifleri 2x PCR Master karışımı, cDNA ve probları buz üzerinde çözün.
    NOT: Tüm reaktifler, reaksiyon karışımları ve numuneler buz üzerinde tutulmalıdır.
  13. 100 μL'lik bir tüpte, 1 μL cDNA ve 3.5 μL NFW ekleyerek bir cDNA örneği hazırlayın. Ana karışımı hazırlamak için 5 μL ana karışım alın ve 100 μL'lik bir tüpe 0,5 μL prob ekleyin. Kısa bir dönüş yaparak içindekileri karıştırın. Numune sayısını ve hedef genleri hesaplayın ve reaksiyon karışımını buna göre hazırlayın.
    NOT: 100 μL'lik tüpün altına NFW ve ana karışımı ekleyin. Hacmin eklendiğinden emin olmak ve herhangi bir reaktifin çapraz karışmasını önlemek için bir önlem olarak santrifüj tüpünün duvarına cDNA ve prob ekleyin.
  14. 8 oyuklu şeritleri PCR soğutucusuna yerleştirin. 5.5 μL ana karışım ve prob içeren flakonu 8 oyuklu şeritler halinde her bir oyuğun dibine aktarın. Buna göre, tüm hedef genler için adımı tekrarlayın.
  15. 4.5 μL cDNA ve NFW karışımını 8 oyuklu şeritler halinde kuyu duvarına aktarın. Buna göre, tüm numuneler için adımı tekrarlayın.
  16. Şeritleri kapaklarla kapatın ve kuyucuktaki genleri ve örnekleri karıştırmak için 10 s'lik kısa bir dönüş yapın. Şeridi qRT-PCR s'ye yerleştirinampyuva ve yuvayı kapatın.
  17. Masaüstünde yazılımı başlatın ve misafir olarak oturum açın. Ekranda bir açılır pencere belirecektir. Bağlantı Olmadan Devam Et'e tıklayın.
  18. Kurulum menüsünde, Gelişmiş Kurulum'a tıklayın. Deney Özellikleri'nde, Deney Adı sekmesine deneyin adını yazın. Hangi tür bir deney ayarlamak istiyorsunuz seçeneğinde, Kantitasyon-Karşılaştırmalı CT (ΔΔ CT) öğesini seçin.
  19. Cihazda hangi rampa hızını kullanmak istiyorsunuz? sekmesinde, Hızlı'ya tıklayın (bir koşuyu tamamlamak için ~ 40 dakika). Plaka kurulum menüsünde Define Targets (Hedefleri Tanımla) seçeneğinde gen isimlerini tanımlayın ve Define Samples (Örnekleri Tanımla) kısmına numune isimlerini yazın.
  20. Çalışma Yöntemi sekmesinde, Kuyu Başına Reaksiyon Hacmi'ne 10 μL yazın. Sahneyi tutmadan hemen önce Sahne ekle'ye tıklayın ve Bekletme aşaması'nı seçin. Sıcaklığı 50 °C'ye ve süreyi 2 dakikaya değiştirin. İkinci bekletme aşamasında herhangi bir değişiklik yapmayın, bu da 1 saniye boyunca 95 °C olacaktır.
  21. Döngü aşamasında Adım 1, sıcaklığı 95 °C'ye ve süreyi 3 saniyeye değiştirin. 2. adımda, sıcaklığı 60 °C'ye ve süreyi 30 saniyeye değiştirin. qRT-PCR döngüsünü başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.

12. İstatistiksel analiz

NOT: Tüm veriler için, ortalama bir çubuk olarak temsil edilir ve standart sapma, bir çubuk grafikteki hata çubuğunu temsil eder (p değeri< 0,05 önemli kabul edilir).

  1. Veri analizi yazılımını açın ve konfokal deneyden elde edilen verileri ekleyin.
  2. Konfokal mikroskopi analizi için, GFP ekspresyonu için çoklu grup karşılaştırması için Tukey'in düzeltme testi ile sıradan Tek Yönlü ANOVA uygulayın. p < 0.05 olan verileri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. Bir çubuk olarak temsil edilen ortalama ve hata çubuğunu temsil eden standart sapma ile verilerin grafiksel bir temsilini hazırlayın.
  3. Parazit yük tahlili için yeni bir sayfa oluşturun ve 100 makrofaj için parazit sayımı verilerini girin. Tüm örnekler arasında Tukey düzeltmesi ile sıradan Tek Yönlü ANOVA uygulayın. p değeri< 0.05 olan verileri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.
  4. ELISA için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile İki Yönlü ANOVA gerçekleştirin. qRT-PCR için, Tukey'in düzeltme testi ile Tek Yönlü ANOVA gerçekleştirin.

Sonuçlar

Sentetik devreyi ifade etmek için sentetik devreyi oluşturan genetik parçaların düzenlenmesi (Şekil 1A)'da gösterilmiştir. Karşılık gelen parçalar, Şekil 1B'de gösterilen ortogonal ve modüler bir şekilde pEGFP-N1 vektöründe klonlandı. Sentetik devrenin simülasyonu, hem SDHA'da hem de tetrasiklin baskılayıcısında salınım dinamiklerini ortaya çıkardı. Bu gözlem, periyodik dalga fonksiyonları ile karakterize edilen karşılıklı bir ...

Tartışmalar

Elde edilen sonuçlar, sentetik bir devrenin tasarımı ve uygulanması için kanalize edilen boru hattının verimliliğinin altını çizmektedir. Bu sentetik devrenin inşası, leishmaniasis gibi bulaşıcı hastalıklar için hassas ilaç geliştirmeye yönelik bir adımdı. Genetik parçaların in silico montajı ve deterministik simülasyon yoluyla, TetON sisteminin ayırt edici modülatör etkisi izlendi. Devrenin etkisi, özellikle, TetR ve SDHA/GFP'nin karşılıklı iki durumlu ifadesine yol açmış o...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, araştırmamızı desteklediği için Pune'daki Biyoteknoloji Araştırma ve Yenilik Konseyi - Ulusal Hücre Bilimi Merkezi (BRIC-NCCS) Direktörüne ve BRIC-NCCS Biyoinformatik Tesisine teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestriction digestion
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFischer ScientificD1306nuclear staining
50mL tubeCorning352070
60mm platesFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plateThermoFischer Scientific160376For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539For AGE
Agarose gel electrophoresis assemblyGeNei93For AGE
Bacterial laminar flowESCO Lifesciences2120765For transformation
Calcium chlorideMerckC4901Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flowThermoFischer Scientific1323TSFor cell culture
Cell scraperGenetix90020For cell culture
Cell spreaderFischer Scientific12822775
Centrifuge for 1.5mL tubesEppendorfEP5404000537
Centrifuge for 50mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3For RNA isolation
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110For cell culture
CuvetteEppendorf6138000018Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023For RNA isolation
DoxycyclineMerck33429For induction of transfected cells
Dry heating blockLabnetFor transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle MediumNational centre for cell scienceFor cell culture
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromideSigmaE7637For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acidFischer Scientific12635Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscopeThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine SerumGibco16000-044For cell culture
FV31S-SW softwareOlypmusImage acquisition
GeneticinGibco1563411for transfection
Gibson assembly method for cloningBIOMATIKConstruction of synthetic circuit
Graphpad prismGraphpadStatistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814for cDNA synthesis
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagent preparation
KanamycinSigma60615For transformation and colony selection
Luria Bertini brothHimediaM1245For culturing E.coli
Magnesium chlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032For qRT-PCR
Microwave ovenLGMC-7649DWFor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPFor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker AgitatorDIAB
National centre for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfor contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamberMarienfeld superior640010For cell count
Non-vented 25cm2 flaskCorning353014For culturing parasite
NotIBioLabsR3189MRestriction enzyme
Nuclease free waterBiodesign1QIAReagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusImage processing
Olympus FV 3000OlympusFor confocal imaging
OPTI-MEM mediaGibco31985070media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuitBiomatik
PenicillinThermoFischer Scientific15070063For cell culture
PolyethylenimineMERCK764965for transfection
Potassium AcetateFischer ScientificYBP364500Buffer /Reagent preparation
Potassium ChlorideFischer ScientificBP366Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate MonobasicSigmaP5655Buffer /Reagent preparation
Power supply packBIORAD1645070For AGE
Registry of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefor contruction of synthetic circuit
RNAiso PlusTakara38220090For RNA isolation
RNase AThermoFischer Scientific12091021Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute MediumNational centre for cell scienceFor culturing parasite
Shaker incubatorREMICIS 24 plusFor culturing E.coli
Sodium chlorideQualigensQ27605Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771Buffer /Reagent preparation
Sodium HydroxideFischer Scientific15895Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Buffer /Reagent preparation
SpectrophotometerEppendorfEstimation of plasmid concentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR systemLife technologies272006777For qRT-PCR
StepOne software version 2.3Life technologiesFor qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellSynthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFischer Scientific10488085For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorideHimediaMB029Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Buffer /Reagent preparation
Trypan blueSigmaT8154For cell count
XhoIBioLabsR0146SRestriction enzyme

Referanslar

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241 (2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588 (2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670 (2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125 (2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749 (2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431 (2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276 (2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118 (2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132 (2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763 (2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466 (2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823 (2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. . The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908 (2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031 (2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315 (2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 211Sentetik devreLeishmaniasisMakrofajlarmm no metabolizma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır