JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе представлен протокол проектирования, создания и поставки индуцируемой синтетической схемы на основе тетрациклина. Влияние синтетических схем на элиминацию паразитов и экспрессию цитокинов можно изучить путем канализации представленного трубопровода. Этот протокол актуален для исследователей, изучающих терапию на основе синтетических схем при инфекционных заболеваниях.

Аннотация

Иммунометаболизм является ключевым фактором, определяющим прогрессирование лейшманиоза. Подход, основанный на синтетической биологии, привлек значительное внимание как шаг к терапевтическому вмешательству, направленному на факторы, связанные с хозяином, которые вызывают лейшманиоз. Синтетическая биология включает в себя инженерию генетических компонентов ортогональным и модульным образом для точной модуляции биологических систем, наделяя клетки новыми функциями. В представленном исследовании выяснение систематического конвейера разработки синтетической схемы на основе индуцируемого тетрациклина-управляемого (TetON) синтетического контура было направлено на доставку сукцинатдегидрогеназы в качестве терапевтического агента, способствующего элиминации внутриклеточных паразитов Leishmania . Изложенный протокол описывает проектирование синтетической схемы и ее последующую валидацию. Предлагаемая стратегия также концентрируется на включении синтетических схем в плазмидную магистраль в качестве средства доставки. Кроме того, в клеточных линиях мышиных макрофагов был использован механизм доставки, использующий наночастицы на основе полиплексов для доставки синтетических цепей, без ущерба для клеточной морфологии. Проведена стандартизация метода для отбора трансфицированных клеток и определения оптимальной индукционной концентрации для экспрессии синтетических контуров. Наблюдения показывают заметное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки в трансфицированных клетках по сравнению с инфицированными клетками. Провоспалительные цитокины экспрессировались после инфицирования в трансфицированных и индуцированных клетках синтетического контура в качестве механизма, способствующего элиминации паразитов. Это подчеркивает, что метод, основанный на синтетической биологии, является мощным подходом к лечению лейшманиоза путем воздействия на факторы хозяина, связанные с прогрессированием заболевания.

Введение

Развитие холистической, интегративной медицины является важной связью, которая была выявлена между метаболическими изменениями в иммунных клетках и их способностью модулировать фенотип иммунных клеток при инфекционных заболеваниях. Иммунометаболизм открывает новые перспективы для выяснения патогенеза распространенных инфекционных заболеваний у человека. Кроме того, в нем представлены перспективные методы разработки вакцин и лекарственных препаратов путем выявления новых мишеней для вмешательства1. Метаболическое перепрограммирование иммунных клеток выявлено при различных инфекционных заболеваниях, включая лейшманиоз. Leishmania spp. отвечает за возникновение лейшманиоза, из которого Leishmania major (L. major) вызывает кожный лейшманиоз (CL). L. Основные паразиты оказывают значительное влияние на метаболизм клеток хозяина, особенно в макрофагах, для пролиферации и выживания в качестве внутриклеточных паразитов2. Макрофаги, как правило, могут поляризоваться либо на классически активированные (M1), либо альтернативно активированные (M2) субпопуляции, где клетки M1 обладают высокой секрецией провоспалительных цитокинов и продукцией оксида азота (NO) в результате метаболизма форм азота. Клетки М2 демонстрируют повышенный уровень противовоспалительных цитокинов и проявляют высокую активность аргиназы за счет метаболизма азота3. Таким образом, оба фенотипа различаются не только по иммунному ответу, но и по метаболическим путям.

Системная биология лейшманиоза направлена на идентификацию молекулярных мишеней для разработки новых методов лечения путем проектирования и разработки лекарств. Реконструкция сигнальных сетей и метаболических путей помогает понять лейшманиоз как целостную модель и позволяет получить представление о главном компоненте, вызывающем заболевание. Математическое моделирование является одним из наиболее предпочтительных прикладных аналитических подходов для понимания сложностей лейшманиоза4. Иммунометаболические сети и математические модели позволили идентифицировать сукцинатдегидрогеназу (SDHA) как ключевой компонент фенотипа M1, который экспрессируется для элиминации паразита5. Синтетическая биология находит применение в диагностике, разработке вакцин и терапии лейшманиоза. Метаболизм, нацеленный на модуляцию иммунного ответа, может быть достигнут с помощью инструментов синтетической биологии. Для модуляции инозитолфосфорилцерамидсинтазы, которая регулирует метаболизм сфинголипидов и изменяет иммунную сигнализацию хозяина, генетическая цепь, обладающая бистабильным поведением, была использована для синтетической настройки внутренней устойчивости модели инфекции L. major 6,7. Таким образом, системы и синтетическая биология могут обеспечить основанную на моделях генную инженерную платформу для развития точной медицины в модельной системе Leishmania.

Фенотип М1 характеризуется экспрессией иммунометаболических сигнальных сетей, в которых выработка воспалительных цитокинов и метаболических путей синергетически усиливает элиминацию паразитов. Поляризация М1 означает выработку провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-12 (IL-12), интерферон-гамма (ИФН-γ) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Метаболические пути, которые высоко обогащены в фенотипе М1, включают гликолиз, пентозофосфатный путь и усеченный цикл трикарбоновых кислот (цикл ТСА)5. Усеченный цикл ТСА управляет механизмом уничтожения паразитов за счет повышения уровня сукцината и цитрата, которые управляют производствомNO3. Накопление сукцината SDHA приводит к активации транскрипционного фактора гипоксии-индуцируемого фактора 1-альфа (HIF-1α), который индуцирует продукцию IL-1β8. При фенотипе М2 наблюдается окисление жирных кислот, увеличение утилизации глутамина и усиленное окислительное фосфорилирование глюкозы наряду с продукцией противовоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-10 (ИЛ-10), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), интерлейкин-4 (ИЛ-4) и интерлейкин-13 (ИЛ-13)3. Отличительной особенностью M2 являются удлиненные митохондрии, что приводит к повышению эффективности производства энергии. Они используют жирные кислоты, глюкозу и глутамин в качестве субстратов для подпитки цикла ТСА, тем самым генерируя АТФ путем окислительного фосфорилирования с более высокой скоростью, способствуя ростуи пролиферации паразитов. Фермент SDHA, ответственный за накопление сукцината через усеченный ТСА, может не только способствовать образованию NO, но и инициировать зависимое от сукцината потребление кислорода посредством электронного транспорта10. У макрофагов, инфицированных лейшманией, SDHA подавляется в 2,17 раза, что указывает на то, что аэробное дыхание также может быть подавлено11. Для увеличения потребления сукцината для индуцирования провоспалительной цитокин-опосредованной продукции NO и содействия элиминации паразитов необходима экспрессия SDHA.

Синтетическая схема предлагает прецизионно-направленную терапию, которая может изменить больную систему для достижения бистабильной осцилляции, которая может восстановить здоровый фенотип на пространственно-временном уровне. Подача и экспрессия синтетической схемы делают систему динамичной и надежной. Одним из ключевых факторов, способствующих развитию синтетической биологии, является способность собирать генетические части и элементы модульным образом, что позволяет создавать сложные архитектуры и индивидуальные функциональные возможности. Ограничения, связанные с традиционными методами экспрессии, стимулировали появление индуцируемых плазмидных синтетических схем на основе тетрациклинового оперона, что позволило быстро оценить плазмиду и легко доставить ее через различные типы клеток. Тетрациклин-чувствительный репрессорный белок (TetR), когда он существует в виде димера, проявляет сильное сродство связывания с тет-опероном (TetO), эффективно подавляя транскрипцию. Однако при взаимодействии его лиганда, доксициклина (докса), TetR претерпевает структурное изменение, приводящее к его диссоциации от TetO, что позволяет транскрипции протекать беспрепятственно. Эта схема может демонстрировать контроль трансляции белка14. Таким образом, с помощью определенной методики разработанная синтетическая схема индуцированной плазмиды на основе тетрациклинового оперона получила возможность экспрессировать SDHA в векторе pEGFP-N1. Оценка эффективности преобразования контура и его производительности позволила получить представление о компетентности поставщика. Путем рестрикционного расщепления вектора было подтверждено определение эффективности клонирования. Кроме того, трансфицированная клеточная линия мышиных макрофагов RAW264.7, полученная из перитонеальных макрофагов мышей Balb/c, была обнаружена на предмет дозозависимой экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) доксициклина в трансфицированных клетках. Кроме того, эффект элиминации паразитов в трансфицированных клетках был подтвержден экспрессией синтетической цепи. Кроме того, наблюдалась индукция и экспрессия провоспалительных цитокинов, которая была направлена через увеличение временной точки инфекции в трансфицированных и индуцированных клетках синтетического контура, что было непосредственно связано с функционированием синтетического контура.

протокол

1. Культивирование клеток RAW264.7

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используйте низкие номера проходов. Клеточная линия RAW264.7 была закуплена в Национальном клеточном репозитории Совета по инновациям в области биотехнологических исследований - Национального центра клеточных наук (BRIC-NCCS), Пуна. Поскольку клеточная линия RAW264.7 является линией макрофагальных клеток, она может начать дифференцироваться с увеличением пассажей. После оживления клеток используют клеточную линию для трансфекции через 2 пассажа.

  1. Засейте 5 x 105 клеток клеточной линии RAW264.7в колбу размером 25 см 2 с добавлением 5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 100 МЕ/мл пенициллина в качестве полной среды.
  2. Храните клетки для роста и пролиферации в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C до тех пор, пока не будет достигнута 90% конфлюенция.
  3. Выбросьте носитель и промойте 3 раза 1x фосфатным буферным раствором (PBS). Добавьте в колбу 1 мл PBS, соскребите клетки скребком и соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 5 минут при 24 °C и повторно суспендируйте гранулу с помощью пипетки объемом 1 мл в 1 мл полной среды DMEM.
  5. Подсчитайте клетки в камере подсчета клеток, используя 0,5% трипанового синего, чтобы определить процент живых клеток.

2. Культура клеток L. major parasite

ПРИМЕЧАНИЕ: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) был подарком от BRIC-NCCS. Промастиготы должны иметь номер прохода меньше 10. Более низкое число пассажей гарантирует, что паразит здоров и его способность заражать макрофаги выше.

  1. Выращивайте L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 20% FBS в качестве полной среды.
  2. Семена 1 х 106 промастигот в невентилируемую колбу 25 см2 колбы, содержащую 5 мл готовой среды. Инкубируйте колбу при температуре 27 °C в течение 5 дней и наблюдайте в светлопольный микроскоп за паразитом в неподвижной фазе L. major при 20-кратном увеличении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промастиготы в стационарной фазе могут быть получены через 4-7 дней после культивирования. Для них характерно удлиненное жгутиковое состояние и сниженная подвижность.

3. Проектирование синтетической схемы в плазмиде в качестве вектора доставки

  1. Проектирование деталей синтетической схемы
    1. Откройте программу Tinker cell и перейдите на вкладку «Детали». Выберите компонент Promoter из библиотеки и поместите его на холст, чтобы символизировать промотор цитомегаловируса (CMV) в синтетической цепи. Извлеките сайт связывания репрессора, аналогичный TetO, с вкладки «Детали» и расположите его рядом с промотором на холсте, органично интегрировав его с промотором CMV.
    2. Включите оператор тетрациклина (TetO), внутренние сайты входа рибосом (IRES) и кодирующую область, перетащив сайт связывания репрессора, сайт связывания рибосом (rbs) и кодирующую область на холст, интегрируя их с существующими генетическими компонентами.
    3. Переименуйте кодирующую область в TetR, обозначая тетрациклин-чувствительный репрессор, который функционирует как предполагаемый негативный регулятор в синтетической цепи. Объедините эти генетические элементы, чтобы облегчить создание синтетических деталей.
    4. Добавьте на холст спейсерную область (sd1), предназначенную для расщепления клеточными протеазами, такими как teschovirus-1 2A (P2A) свиньи. Введите дополнительную кодирующую область, представляющую интересующий ген, пометьте ее как SDHA в синтетическую конструкцию и интегрируйте ее с другими элементами.
    5. Рядом с кодирующей областью SDHA интегрировать еще одну расщепляемую область протеазы (sd2), которая будет расщепляться клеточной протеазой P2A. Введите кодирующую область, представляющую репортерный ген, и пометьте ее как GFP в конструкцию.
      Примечание: Экспрессия GFP может обеспечить оценку производства SDHA и гарантировать, что синтетическая схема имеет логическое функционирование13.
    6. Рядом с GFP добавьте терминатор (ter1) и проверьте собранные детали, проверив, все ли детали соединены. Цепь должна отображаться красным цветом при нажатии на любую деталь. Это подтверждает формирование функциональной генетической цепи.
    7. На вкладке Реакция назначьте регуляторные скорости, которые включают параметры и начальные значения для производства белка, TetR, SDHA и GFP, чтобы очертить реакцию трансляции в синтетическом контуре.
    8. Добавьте маленькую молекулу с вкладки «Детали», назовите ее «Доксициклин» (dox) и назначьте ей волновую функцию, выбрав «Вход » на вкладке «Детали и соединение», а затем нажав на «Волновой ввод».
    9. На вкладке «Регулирование » нажмите « Реакция на подавление». Перетащите Скорость реакции на холст между dox и TetR. Установите кинетику реакции между dox и TetR, дважды кликнув по значку Wave Function на dox и установив Doxyxycline.sin.amplitude на 10.
    10. Реализуйте транскрипционную регуляторную реакцию между белком TetR и сайтом связывания репрессора, выбрав реакцию на вкладке «Регуляция » и поместив ее на холст между TetR и TetO.
    11. Дважды щелкнув по каждому компоненту и реакции, установите начальную концентрацию и параметр для моделирования. Нажмите на Simulation, выберите Deterministic и смоделируйте цепь для 100 единиц времени. Настройте график моделирования с панели управления, которая появляется вместе с графиком, и наблюдайте за картиной графика для белков SDHA и TetR.
  2. Идентификация генетических компонентов из реестра деталей iGEM
    1. Откройте Реестр стандартных биологических частей (Таблица материалов) и нажмите на кнопку «Поиск». Введите название генетического компонента, например, промотор ЦМВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс поиска iGEM ID должен быть выполнен для всех генетических компонентов синтетической цепи. Перечислены шаги по идентификации идентификатора iGEM промоутера CMV; Впоследствии действия необходимо повторить для других компонентов.
    2. Чтобы получить нуклеотидную последовательность промотора ЦМВ, нажмите на опцию Get Part Sequence и сохраните файл в виде текстового файла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что запасы всех генетических частей доступны.
    3. Повторите шаги 3.2.1 и 3.2.2 для всех генетических частей (оператор тетрациклина, последовательность Козака, TetR, P2A и GFP), кроме SDHA.
    4. Чтобы получить кодирующую белок последовательность SDHA, откройте NCBI и выберите Nucleotide из выпадающего списка рядом с окном поиска. Тип Сукцинатдегидрогеназа и Mus musculus и поиск нуклеотидной последовательности.
    5. Нажмите на опцию CDS , чтобы получить последовательность кодирования SDHA и сохранить последовательность в текстовом файле.
    6. Последовательно объедините нуклеотидную последовательность всех генетических регуляторных частей в одном файле. Добавьте стартовый кодон (ATG) сразу после последовательности Козака и удалите внутренние стоп-кодоны, чтобы избежать образования зарождающихся полипептидов.
    7. Откройте веб-сайт ExPASy15 и вставьте последовательность нуклеотидов. Нажмите на опцию «Перевести последовательность ». Выберите 5'3' Frame 1 и удалите стоп-кодоны, которые будут выделены красным цветом в разделе результатов.
      Примечание: Чтобы определить, эффективно ли нуклеотидная последовательность транслируется в желаемую полипептидную последовательность, можно использовать инструмент трансляции, такой как ExPASy. Это обеспечивает профилактику нежелательных зарождающихся полипептидов. Выбор вектора pEGFP-N1 для экспрессии синтетической цепи является оптимальным, учитывая, что промотор ЦМВ и ген GFP ранее существовали в векторе. Все генетические части были собраны с использованием протокола клонирования (который был передан на аутсорсинг). Ферментами рестрикции, используемыми для клонирования вставок, являются NotI и XhoI. Эти сайты фермента рестрикции расположены в сайте множественного клонирования вектора pEGFP-N1.

4. Трансформация синтетического контура в клетках Escherichia coli (E.coli) DH5α

  1. Получение компетентных клеток E.coli DH5α
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется автоклавирование реагентов. Реагенты можно хранить при температуре 4 °C до использования.
    1. Заквашивайте 1 мл свежего инокулюма в 50 мл бульона Лурия (LB) при температуре 37 °C, 180 об/мин. Выращивайте клетки в течение примерно 2 ч до тех пор, пока при длине волны 600 нм не будет достигнута оптическая плотность (OD) 0,4-0,6.
    2. Центрифугируйте ячейки при 4 696 x g при 4 °C в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость вручную в колбу для выброса, перевернув пробирку центрифуги объемом 50 мл и собрав клеточную гранулу.
    3. Осторожно суспендируйте гранулу в 2 мл ледяного 0,1 М хлорида магния (MgCl2) с помощью пипетки объемом 1 мл. Восполните объем до 20 мл ледяным MgCl2.
    4. Центрифугируйте пробирку при давлении 4,696 x g в течение 10 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно ресуспендируйте клетки с помощью пипетки объемом 1 мл в 1 мл ледяного 0,1М хлорида кальция (CaCl2) и инкубируйте на льду в течение 2 часов. Используйте только что изготовленные грамотные клетки для преображения.
  2. Трансформация компетентных клеток с помощью синтетической схемной конструкции
    1. Отмерьте 50 мкл компетентных клеток и добавьте их в пробирку объемом 1,5 мл. Поставьте трубку на лед. Добавьте в аликвоту 10 нг синтетической схемной конструкции и держите на льду 3 минуты.
    2. Ячейки теплового шока при 42 °C в течение 3 мин на сухом нагревательном блоке. После завершения инкубации на сухом нагревательном блоке поместите клетки обратно на лед на 3 минуты, добавьте в ячейки 1 мл LB и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа при 250 об/мин.
    3. Когда инкубация завершена, центрифугируйте клетки при концентрации 4696 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл LB и нанесите его на LB агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина. Переверните планшет и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 24 часов.

5. Изоляция синтетической схемотехнической конструкции

  1. В центрифужную пробирку объемом 50 мл возьмите 10 мл LB среды и добавьте 50 мкг/мл канамицина в качестве селекционного бульона для культивирования трансформированных клеток для выделения плазмид. Подберите трансформированную колонию с помощью наконечника объемом 200 мкл и добавьте его в выбранный бульон.
  2. Используя петлю инокуляции, выберите еще одну колонию, проведите полосу с помощью пятиугольной техники и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 24 часов, чтобы сохранить изоляты одной колонии.
  3. Выращивайте клетки в течение ночи при 180 об/мин при 37 °C. На следующий день центрифугируйте культуру при 4 696 x g в течение 20 мин при 24 °C. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пробирку, и добавьте в гранулу 1 мл ресуспендирующего буфера (50 мМ трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорида (Tris-HCl), 10 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 100 мкг/мл РНКазы А (pH-8,0)) и ресуспендируйте клетки путем осторожного пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ресуспендирования буфера добавьте РНКазу А за 5 минут до добавления смеси в клеточную гранулу.
  4. Инкубируйте смесь в течение 5 минут при RT. Добавьте 1 мл буфера для лизиса (0,2 N гидроксида натрия (NaOH), 1 % додецилсульфата натрия (SDS)) в клетки и перемешайте, перевернув пробирку в течение 2 минут. Инкубируйте пробирку в течение 5 минут при RT.
  5. Добавьте в клетки 1 мл нейтрализационного буфера (3 М ацетата калия (CH3CO2K)) и перемешайте, многократно перевернув пробирку. Центрифугируйте клетки при давлении 4696 x g в течение 20 мин в режиме ОТ и соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл.
  6. Добавьте 500 мкл изопропанола в надосадочную жидкость и хорошо перемешайте, инвертируя. Надосадочную жидкость инкубировать на льду в течение 15 минут, а затем центрифугировать при 12 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация может длиться от 5 минут до 1 часа. Во время этого рекомендуется аккуратно перемешивать содержимое, переворачивая каждые 5 минут.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в гранулу 1 мл 70% этанола (охлажденного) и центрифугируйте при 12000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Повторите этот шаг еще раз.
  8. Гранулу высушить на воздухе и ресуспендировать полученную плазмиду в 20 мкл стерильной безнуклеазной воды (НФВ). Измерьте концентрацию плазмиды на спектрофотометре на длине волны 260/280 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте больше NFW, если концентрация плазмид очень высока для оценки с помощью нанокапель. Процесс разведения плазмид необходимо проводить в ламинарном колпаке.

6. Электрофорез в агарозном геле (AGE) синтетического контура

  1. Подготовка образца плазмиды к КПГ
    1. В пробирке объемом 1,5 мл отмерьте 20 мкл 1x трис-ацетата-ЭДТА (ТАЭ). Добавьте 4 мкл 6-кратного загрузочного буфера и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
    2. Придайте пробирке быстрый отжим, добавьте 1 г вектора плазмиды синтетического контура и хорошо перемешайте, пипетируя смесь. Эту реакционную смесь можно загрузить на агарозный гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тщательного пипетирования, так как это может повредить структуру плазмиды. Вместо этого дайте быстрый отжим для смешивания реагентов.
  2. Сужение сбраживания в синтетическом контуре
    1. В пробирку объемом 1,5 мл добавьте 2 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 1 мкл NotI и 1 мкл рестрикционного фермента XhoI и хорошо перемешайте, дав содержимому быстро отжаться. Добавьте 1 г вектора плазмиды синтетического контура и придайте содержимому быстрый отжим.
    2. Увеличьте объем пробирки до 20 μл, добавив NFW к содержимому и придав пробирке быстрый отжим. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C в течение 1 ч.
    3. После инкубации держите пробирку при температуре 70 °C в течение 15 минут в сухом нагревательном блоке, чтобы деактивировать ферменты рестрикции. Охладите содержимое пробирки и добавьте в реакционную смесь 6 мкл загрузочного буфера. Перемешайте содержимое, дав тюбику быстро отжаться. Эту реакционную смесь можно загрузить на агарозный гель.
    4. Установите агарозный гель и запустите гель по ранее описанному протоколу16. Вкратце, загрузите по 20 мкл образцов в каждую лунку, загрузите 5 мкл 1 Кб лестницы ДНК и запустите гель при напряжении 100 В. Отключите источник питания после завершения электрофореза, получите гель на гелевом тепловизоре и включите флуоресценцию для просмотра полос.

7. Трансфекция конструкции синтетической схемы в клеточной линии RAW264.7

  1. Подготовка образцов
    1. Подготовьте образцы для определения эффекта уничтожения паразитов с помощью индуцированной синтетической цепи. Первый образец – нетрансфицированные клетки RAW264.7 (контроль), второй – клетки RAW264.7, инфицированные промастиготами L. major в течение 6 ч (инфицированные 6 ч), третий образец – клетки RAW264.7, трансфицированные синтетическим контуром и индуцированные доксом (IMT), образцы момента заражения – клетки RAW264.7, трансфицированные синтетическим контуром и индуцированные доксом, инфицированные L. major промастиготы (IMTI) для разных временных точек 6 ч (6 ч IMTI), 12 ч (12 ч IMTI), 18 ч (18 ч IMTI) и 24 ч (24 ч IMTI).
    2. Чтобы подготовить все образцы, соскребите ячейки RAW264.7 из колбы 25см 2 и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
    3. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды DMEM. Возьмите 10 мкл ресуспендированных клеток в пробирку объемом 100 мкл, добавьте к клеткам 10 мкл 0,5% трипанового синего и хорошо перемешайте.
    4. Загрузите 10 μL смеси ячеек и трипанового синего цвета на предметное стекло камеры подсчета клеток и отсчитайте ячейки из 4 камер.
    5. Пластинчатые ячейки в покровном дне 96 луночных планшетов по 2 х 10 по4 ячейки в лунку и инкубируют клетки в течение 24 ч. Этот образец является контрольным. Этот этап остается постоянным для подготовки других образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно нагрейте среду до 37 °C на водяной бане.
    6. Для получения инфицированного образца в течение 6 ч центрифугируют 1 мл промастигот стационарной фазы L. major при давлении 7273 x g в течение 10 мин. Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл полной среды DMEM и проведите подсчет клеток в камере для подсчета клеток, выполнив шаги 7.1.3-7.1.4.
    7. Добавьте в лунку 2 x 105л. основных промастигот и инкубируйте их с 5%CO2 при 37 °C в течение 6 часов. После инкубации промойте клетки 3 раза с PBS.
    8. Чтобы получить образец IMT, засейте клетки, выполнив следующие шаги (7.1.2-7.1.5), и выполните этапы трансфекции 7.2.1-7.2.6.
    9. Для подготовки образцов временных точек IMTI выполните шаги 7.1.2-7.1.5 и выполните этапы трансфекции 7.2.1-7.2.6. Выбросьте полную среду DMEM, содержащую 500 мкг/мл генетина (G418) и 1 мкг/мкл докса, и промойте клетки 3 раза 1x PBS.
    10. Добавьте в лунки 2 x 105л крупных промастигот и инкубируйте их в течение 6 часов, 12 часов, 18 часов и 24 часов. После заражения выбросьте промастиготы, содержащие DMEM в сборе, и промойте лунки 3 раза 1x PBS. Добавьте в клетки 200 μл полной среды DMEM, содержащей 500 μг/мл генетина (G418) и 1 μг/μл докса, и инкубируйте в течение 24 часов.
  2. Трансфекция синтетического контура
    1. В пробирку объемом 1,5 мл добавьте 24 мкл среды с уменьшенным содержанием сыворотки, которая является улучшенной минимальной эфирной средой. В среду добавляют 1 г вектора pEGFP-N1, клонированного с помощью плазмиды синтетической схемы.
    2. В свежую пробирку объемом 1,5 мл добавьте 24 μL Minimal Essential Medium и добавьте 1 μL Polyethylenimine (PEI; 1 μг/μл). Хорошо перемешайте, пипетируя смесь не менее 10 раз, и инкубируйте при RT в течение 5 минут.
    3. Перенесите смесь PEI в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую смесь ДНК. Хорошо перемешайте с помощью пипетки по каплям не менее 10 раз. Инкубируйте ДНК: перемешайте ПЭИ при РТ в течение 10 минут.
    4. Сбросить фильтрующий материал из лунок на 96-луночных покровных пластинах и 3 раза промыть элементы PBS. С помощью пипетки аккуратно добавьте DNA:PEI по каплям к клеткам и осторожно встряхните пластину. Инкубируйте клетки с 5%CO2 при 37 °C в течение 3 ч.
    5. После инкубации добавьте в клетки 200 μL свежей среды Minimal Essential Medium, осторожно встряхните планшет и инкубируйте в течение 24 часов с 5%CO2 при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭИ является цитотоксичным; Следовательно, рекомендуется не инкубировать клетки после трансфекции более 24 часов.
    6. На следующий день выбросьте носитель и промойте ячейки 2 раза с PBS. Добавьте в клетки полнорационные среды DMEM, содержащие 500 мкг/мл генетина (G418) и 1 мкг/л докса, и инкубируйте в течение 24 ч.
  3. Фиксация образцов для конфокальной микроскопии
    1. Чтобы зафиксировать все образцы, промойте клетки 1x PBS 3x, добавьте в клетки 100 μL 4% параформальдегида и инкубируйте при RT в течение 10 минут.
    2. Промойте клетки PBS 3x. После завершения промывки добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в клетки и инкубируйте при RT в течение 15 минут в темноте.
    3. После инкубации промойте клетки 3 раза с PBS. Наблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом на предмет экспрессии GFP и окрашивания DAPI.

8. Получение трансфицированных клеток с помощью конфокальной микроскопии и количественного определения

  1. Очистите дно колодцев покровным стеклом с помощью впитывающей салфетки. Включите органы управления конфокальным лазерным сканирующим микроскопом. Далее включаем компрессор и ртутную лампу.
  2. Для работы с машиной необходимо последовательно включать элементы управления микроскопом, управление сканирующей головкой, лазерный ключ, лазерный модуль, лампу, контроллер микроскопа и центральный процессор.
  3. На компьютере откройте программу (Table of Materials) и нажмите на кнопку Enable XY Stage Control. Откроется всплывающее окно, которое попросит выполнить очистку для 7S3. Нажмите на Нет. Закройте динамический график и отрегулируйте экраны настроек.
  4. Чтобы добавить к цели 60x, добавьте каплю иммерсионного масла, поместите нижнюю пластину покровного стекла на 96-луночную пластину на сцену и переместите сцену в плоскости X-Y, чтобы отрегулировать положение цели на скважине. Нажмите на окуляр и выберите Alexa-488 Channel. Нажмите на кнопку Shutter Off, чтобы сфокусировать ячейки на окуляре. Отрегулируйте окуляр по сердечнику и точной фокусировке.
  5. Нажмите на кнопку Затвор включен на блоке управления микроскопом и переместите объектив, чтобы отрегулировать его положение и сфокусировать область интереса для наблюдения за ячейками в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC). Переключитесь в режим EPI на блоке управления микроскопа, чтобы наблюдать за клетками в фильтре длины волны Alexa-488 на предмет экспрессии GFP. Ячейки должны отображаться зеленым цветом.
  6. Нажмите « Выключить затвор», перейдите в раздел «Создание изображений LSM» и выберите разрешение изображения как 1,024 x 1,024. Нажмите « Добавить фазу » и перетащите, чтобы добавить зеленый канал в качестве фазы.
  7. В программе Olympus нажмите на LSM и далее нажмите на Live Button , чтобы наблюдать за ячейками в фазовом контрасте и канале Alexa 488nm. Нажмите Control и прокрутите, чтобы сфокусировать ячейки из программного обеспечения для захвата изображений.
  8. Отрегулируйте усиление и смещение, чтобы отрегулировать интенсивность флуоресценции, регистрируемую детектором. Нажмите « Захватить», присвойте изображениям имя и нажмите « Сохранить».
  9. В программном обеспечении для работы с изображениями нажмите « Файл», выберите все изображения с расширением .oir и нажмите « Открыть».
  10. Нажмите на Вид плиток , чтобы визуализировать изображения во всех каналах. Чтобы добавить масштабную линейку к изображениям, нажмите « Просмотр », а затем выберите опцию «Масштабная линейка ».
  11. Чтобы сохранить изображения из отдельных каналов в виде 16-битных оттенков серого, нажмите «Файл» и выберите «Экспортировать изображение». Выберите изображение и проверьте галочки на всех каналах. На вкладке выбора рамки в параметре разделенного просмотра выберите Да. На вкладке вывода выберите 24-битный цвет RGB с опцией прогрева информации и выберите tiff в качестве типа файла для изображения. В папке экспорта в выберите подходящее место для сохранения изображений и нажмите OK.
  12. Чтобы сохранить объединенные изображения, выполните те же действия, за исключением того, что в параметре разделенного просмотра выберите «Нет», а на вкладке вывода выберите «Объединенные каналы с записью информации».
  13. Чтобы проанализировать экспрессию GFP в ячейках, откройте Fiji в Windows и экспортируйте файл tiff. Выберите зеленый цвет для анализа выражения GFP.
  14. Выделите область ячейки с помощью опции инструмента «От руки» и нажмите « Анализ» для измерения интенсивности флуоресценции. Повторите процесс для 3 изображений.
  15. Экспортируйте данные в аналитическое программное обеспечение и выполняйте статистические тесты на основе количественных данных.

9. Анализ паразитарной нагрузки

  1. Визуализируя клетки на конфокальном микроскопе, подсчитайте общее количество паразитов, присутствующих в отдельных макрофагах.
  2. Случайным образом исследуйте 100 макрофагов и отметьте количество внутриклеточных паразитов. Проведите статистический тест между инфицированными и временными точками образцов IMTI для изучения влияния экспрессии SDHA на количество паразитов.

10. Количественное определение IL-10 и IL-12 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)

  1. Подготовьте образцы в соответствии с шагами 7.1 и 7.2 и соберите среду в пробирку объемом 1,5 мл. Держите среду на льду или храните ее при температуре -20 °C до дальнейшего использования. Следуйте инструкциям руководства по эксплуатации комплекта и выполните ИФА для самолетов Ил-10 и Ил-12.

11. Профилирование цитокинов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR)

  1. Подготовьте образцы в соответствии с шагами 7.1 и 7.2. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 500 мкл реагента TRIzol и инкубируйте клетки в течение 2 минут при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы выделения РНК должны выполняться в ламинарном шкафу в качестве меры предосторожности против загрязнения РНКазой.
  2. Соберите образцы в пробирку объемом 1,5 мл, добавьте к ним 100 мкл хлороформа и перемешайте, перевернув пробирки в 5-8 раз. Инкубируйте образцы в течение 15 минут в режиме RT. Центрифугируйте образцы при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  3. Будет соблюдено три слоя, соберите прозрачный водный верхний слой в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл изопропанола в водный слой, хорошо перемешайте, инвертировав 10x, и инкубируйте образцы в течение 15 минут при RT. Через каждые 5 минут снова перемешивайте образцы, переворачивая пробирки.
  4. Центрифугируйте образцы при давлении 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 2 раза с 75% этанолом, содержащим 0,1% диэтилпирокарбонат (DEPC), содержащим воду, в течение 5 минут и центрифугируйте при 8 000 x g при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DEPC, содержащий воду, разрушает РНКазы, в связи с чем, рекомендуется использовать его для выделения РНК.
  5. Наконец, высушите гранулу на воздухе в течение 5 минут при RT, растворите ее в 20 μл DEPC, содержащей воду, и измерьте концентрацию изолированной РНК в соотношении 260/280 и 260/230 с помощью спектрофотометра.
    Примечание: Соотношение 260/280 должно быть приблизительно 2,0, что в целом указывает на чистую форму РНК, а соотношение 260/230 должно быть в пределах 2,0-2,2, чтобы считать, что изолированная РНК не содержит нежелательных химических соединений, таких как тризол.
  6. Для получения 20 мкл каждого образца кДНК разморозьте реагенты на льду и дайте им короткий отжим в течение 15 с на RT. Перед использованием дайте короткий отжим всем реагентам и даже образцам РНК.
  7. В автоклавированную пробирку объемом 100 мкл возьмите 0,8 мкл 25x dNTP, 2 мкл 10x Primer, 2 мкл 10x буфера. Добавьте концентрацию РНК 1 мкг/мкл и добавьте 0,5 мкл фермента обратной транскриптазы. Доведите объем до 20 мкл с помощью DEPC, содержащего воду.
  8. Дайте образцам кДНК короткий цикл в течение 1 минуты на RT. Держите образцы на льду.
  9. Включите термоамплификатор, открутите верхнюю панель, чтобы ослабить держатель, и поместите образцы на блок. После размещения образцов плотно закрутите крышку.
  10. Как только система будет включена, нажмите « Выполнить». Выберите опцию «Основной », затем войдите в меню «Программы» и выберите опцию CDNA . Определите объем образца как 20 мкл и нажмите кнопку RUN. Термоамплификатор запускает программу в четыре этапа. Первая ступень – 25 °C в течение 10 мин, вторая – 37 °C в течение 2 ч, третья – 85 °C в течение 5 мин, а последняя ступень – 4 °C навсегда.
  11. Как только цикл перейдет к четвертому шагу, нажмите Enter и завершите цикл. Соберите образцы и приступайте к проведению qRT-PCR. Храните образцы РНК при -80 °C и образцы кДНК при -20 °C.
  12. Для обнаружения цитокинов разморозьте необходимые реагенты 2x ПЦР мастер-микс, кДНК и зонды для TNF-α, IFN-γ, TGF-β и NFW на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, реакционные смеси и образцы должны храниться на льду.
  13. В пробирке объемом 100 мкл приготовьте образец кДНК, добавив 1 мкл кДНК и 3,5 мкл NFW. Чтобы приготовить мастер-смесь, возьмите 5 μл мастер-смеси и добавьте 0,5 μл зонда в пробирку объемом 100 μл. Перемешайте содержимое, дав короткий отжим. Подсчитайте количество образцов и целевых генов и приготовьте соответствующую реакционную смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте NFW и мастер-микс на дно пробирки объемом 100 μл. Добавьте кДНК и зонд на стенку центрифужной пробирки в качестве меры предосторожности, чтобы обеспечить добавление объема и избежать перекрестного смешивания любого реагента.
  14. Поместите 8-луночные полоски в охладитель ПЦР. Перенесите 5,5 мкл мастер-смеси и флакона, содержащего зонд, на дно каждой лунки в 8-луночных полосках. Соответственно, повторите шаг для всех целевых генов.
  15. Перенесите 4,5 мкл смеси кДНК и NFW на стенку лунки в виде 8-луночных полосок. Соответственно, повторите этот шаг для всех образцов.
  16. Запечатайте полоски крышками и дайте короткому отжиму в 10 с, чтобы смешать гены и образцы в лунке. Поместите полоску в слот для образца qRT-PCR и закройте слот.
  17. На рабочем столе запустите программное обеспечение и войдите в систему как гость. На экране появится всплывающее окно. Нажмите « Продолжить без подключения».
  18. В меню «Настройка» нажмите « Расширенная настройка». В поле Свойства эксперимента запишите название эксперимента на вкладке Название эксперимента . В каком типе эксперимента вы хотите настроить опцию, выберите Quantitation-Comparative CT (ΔΔ CT).
  19. В разделе Какую скорость рампы вы хотите использовать в инструменте? нажмите на вкладку Быстро (~ 40 минут для завершения пробежки). В меню настройки планшета определите имена генов в опции Определить цели и введите имена образцов в поле Определить образцы.
  20. На вкладке «Метод запуска» введите 10 мкл в поле «Реакционный объем на лунку». Прямо перед удержанием этапа нажмите на кнопку «Добавить этап» и выберите «Этап удержания». Измените температуру на 50 °C и время на 2 минуты. На втором этапе удержания не вносите никаких изменений, которые составят 95 °C в течение 1 с.
  21. На этапе циклирования Шаг 1 измените температуру до 95 °C и время до 3 с. На шаге 2 измените температуру на 60 °C и время на 30 с. Нажмите « Выполнить », чтобы начать цикл qRT-PCR.

12. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех данных среднее значение представлено в виде столбца, а стандартное отклонение представляет собой полосу ошибки на столбчатом графике (p-значение< 0,05 считается значимым).

  1. Откройте программу для анализа данных и вставьте полученные данные конфокального эксперимента.
  2. Для анализа конфокальной микроскопии применяют обычный односторонний ANOVA с корректирующим тестом Тьюки для сравнения нескольких групп для экспрессии GFP. Рассмотрим данные с p < 0,05 как статистически значимые. Подготовьте графическое представление данных, среднее значение которого представлено в виде столбца, а стандартное отклонение — в виде полосы погрешности.
  3. Для анализа паразитарной нагрузки создайте новый лист и введите данные подсчета паразитов для 100 макрофагов. Нанесите обычный односторонний ANOVA с коррекцией Тьюки между всеми образцами. Рассмотрим данные с p-значением< 0,05, как статистически значимые.
  4. Для ИФА выполните двусторонний ANOVA с помощью теста множественных сравнений Тьюки. Для qRT-PCR выполните однофакторную ANOVA с корректирующим тестом Тьюки.

Результаты

Расположение генетических частей, образующих синтетическую цепь для экспрессии синтетической цепи, показано на рисунке 1А. Соответствующие части были клонированы в векторе pEGFP-N1 ортогональным и модульным образом, что представлено на рисунке 1B. Моделиро...

Обсуждение

Полученные результаты подчеркивают эффективность трубопровода, который был направлен на проектирование и реализацию синтетической схемы. Создание этой синтетической схемы стало шагом на пути к развитию точной медицины для лечения инфекционных заболеваний, таких как лейшманиоз. С по...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить директора Совета по биотехнологическим исследованиям и инновациям - Национального центра клеточных наук (BRIC-NCCS) в Пуне за поддержку наших исследований и Биоинформатический центр BRIC-NCCS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestriction digestion
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFischer ScientificD1306nuclear staining
50mL tubeCorning352070
60mm platesFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plateThermoFischer Scientific160376For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539For AGE
Agarose gel electrophoresis assemblyGeNei93For AGE
Bacterial laminar flowESCO Lifesciences2120765For transformation
Calcium chlorideMerckC4901Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flowThermoFischer Scientific1323TSFor cell culture
Cell scraperGenetix90020For cell culture
Cell spreaderFischer Scientific12822775
Centrifuge for 1.5mL tubesEppendorfEP5404000537
Centrifuge for 50mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3For RNA isolation
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110For cell culture
CuvetteEppendorf6138000018Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023For RNA isolation
DoxycyclineMerck33429For induction of transfected cells
Dry heating blockLabnetFor transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle MediumNational centre for cell scienceFor cell culture
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromideSigmaE7637For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acidFischer Scientific12635Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscopeThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine SerumGibco16000-044For cell culture
FV31S-SW softwareOlypmusImage acquisition
GeneticinGibco1563411for transfection
Gibson assembly method for cloningBIOMATIKConstruction of synthetic circuit
Graphpad prismGraphpadStatistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814for cDNA synthesis
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagent preparation
KanamycinSigma60615For transformation and colony selection
Luria Bertini brothHimediaM1245For culturing E.coli
Magnesium chlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032For qRT-PCR
Microwave ovenLGMC-7649DWFor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPFor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker AgitatorDIAB
National centre for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfor contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamberMarienfeld superior640010For cell count
Non-vented 25cm2 flaskCorning353014For culturing parasite
NotIBioLabsR3189MRestriction enzyme
Nuclease free waterBiodesign1QIAReagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusImage processing
Olympus FV 3000OlympusFor confocal imaging
OPTI-MEM mediaGibco31985070media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuitBiomatik
PenicillinThermoFischer Scientific15070063For cell culture
PolyethylenimineMERCK764965for transfection
Potassium AcetateFischer ScientificYBP364500Buffer /Reagent preparation
Potassium ChlorideFischer ScientificBP366Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate MonobasicSigmaP5655Buffer /Reagent preparation
Power supply packBIORAD1645070For AGE
Registry of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefor contruction of synthetic circuit
RNAiso PlusTakara38220090For RNA isolation
RNase AThermoFischer Scientific12091021Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute MediumNational centre for cell scienceFor culturing parasite
Shaker incubatorREMICIS 24 plusFor culturing E.coli
Sodium chlorideQualigensQ27605Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771Buffer /Reagent preparation
Sodium HydroxideFischer Scientific15895Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Buffer /Reagent preparation
SpectrophotometerEppendorfEstimation of plasmid concentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR systemLife technologies272006777For qRT-PCR
StepOne software version 2.3Life technologiesFor qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellSynthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFischer Scientific10488085For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorideHimediaMB029Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Buffer /Reagent preparation
Trypan blueSigmaT8154For cell count
XhoIBioLabsR0146SRestriction enzyme

Ссылки

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241 (2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588 (2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670 (2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125 (2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749 (2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431 (2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276 (2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118 (2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132 (2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763 (2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466 (2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823 (2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. . The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908 (2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031 (2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315 (2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены