Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе представлен протокол проектирования, создания и поставки индуцируемой синтетической схемы на основе тетрациклина. Влияние синтетических схем на элиминацию паразитов и экспрессию цитокинов можно изучить путем канализации представленного трубопровода. Этот протокол актуален для исследователей, изучающих терапию на основе синтетических схем при инфекционных заболеваниях.

Аннотация

Иммунометаболизм является ключевым фактором, определяющим прогрессирование лейшманиоза. Подход, основанный на синтетической биологии, привлек значительное внимание как шаг к терапевтическому вмешательству, направленному на факторы, связанные с хозяином, которые вызывают лейшманиоз. Синтетическая биология включает в себя инженерию генетических компонентов ортогональным и модульным образом для точной модуляции биологических систем, наделяя клетки новыми функциями. В представленном исследовании выяснение систематического конвейера разработки синтетической схемы на основе индуцируемого тетрациклина-управляемого (TetON) синтетического контура было направлено на доставку сукцинатдегидрогеназы в качестве терапевтического агента, способствующего элиминации внутриклеточных паразитов Leishmania . Изложенный протокол описывает проектирование синтетической схемы и ее последующую валидацию. Предлагаемая стратегия также концентрируется на включении синтетических схем в плазмидную магистраль в качестве средства доставки. Кроме того, в клеточных линиях мышиных макрофагов был использован механизм доставки, использующий наночастицы на основе полиплексов для доставки синтетических цепей, без ущерба для клеточной морфологии. Проведена стандартизация метода для отбора трансфицированных клеток и определения оптимальной индукционной концентрации для экспрессии синтетических контуров. Наблюдения показывают заметное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки в трансфицированных клетках по сравнению с инфицированными клетками. Провоспалительные цитокины экспрессировались после инфицирования в трансфицированных и индуцированных клетках синтетического контура в качестве механизма, способствующего элиминации паразитов. Это подчеркивает, что метод, основанный на синтетической биологии, является мощным подходом к лечению лейшманиоза путем воздействия на факторы хозяина, связанные с прогрессированием заболевания.

Введение

Развитие холистической, интегративной медицины является важной связью, которая была выявлена между метаболическими изменениями в иммунных клетках и их способностью модулировать фенотип иммунных клеток при инфекционных заболеваниях. Иммунометаболизм открывает новые перспективы для выяснения патогенеза распространенных инфекционных заболеваний у человека. Кроме того, в нем представлены перспективные методы разработки вакцин и лекарственных препаратов путем выявления новых мишеней для вмешательства1. Метаболическое перепрограммирование иммунных клеток выявлено при различных инфекционных заболеваниях, включая лейшманиоз. Leishmania spp. от....

протокол

1. Культивирование клеток RAW264.7

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используйте низкие номера проходов. Клеточная линия RAW264.7 была закуплена в Национальном клеточном репозитории Совета по инновациям в области биотехнологических исследований - Национального центра клеточных наук (BRIC-NCCS), Пуна. Поскольку клеточная линия RAW264.7 является линией макрофагальных клеток, она может начать дифференцироваться с увеличением пассажей. После оживления клеток используют клеточную линию для трансфекции через 2 пассажа.

  1. Засейте 5 x 105 клеток клеточной линии RAW264.7в колбу размером 25 см 2 с добавление....

Результаты

Расположение генетических частей, образующих синтетическую цепь для экспрессии синтетической цепи, показано на рисунке 1А. Соответствующие части были клонированы в векторе pEGFP-N1 ортогональным и модульным образом, что представлено на рисунке 1B. Моделиро.......

Обсуждение

Полученные результаты подчеркивают эффективность трубопровода, который был направлен на проектирование и реализацию синтетической схемы. Создание этой синтетической схемы стало шагом на пути к развитию точной медицины для лечения инфекционных заболеваний, таких как лейшманиоз. С по.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить директора Совета по биотехнологическим исследованиям и инновациям - Национального центра клеточных наук (BRIC-NCCS) в Пуне за поддержку наших исследований и Биоинформатический центр BRIC-NCCS.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestriction digestion
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFischer ScientificD1306nuclear staining
50mL tubeCorning352070
60mm platesFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plateThermoFischer Scientific160376For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539For AGE
Agarose gel electrophoresis assemblyGeNei93For AGE
Bacterial laminar flowESCO Lifesciences2120765For transformation
Calcium chlorideMerckC4901Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flowThermoFischer Scientific1323TSFor cell culture
Cell scraperGenetix90020For cell culture
Cell spreaderFischer Scientific12822775
Centrifuge for 1.5mL tubesEppendorfEP5404000537
Centrifuge for 50mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3For RNA isolation
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110For cell culture
CuvetteEppendorf6138000018Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023For RNA isolation
DoxycyclineMerck33429For induction of transfected cells
Dry heating blockLabnetFor transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle MediumNational centre for cell scienceFor cell culture
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromideSigmaE7637For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acidFischer Scientific12635Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscopeThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine SerumGibco16000-044For cell culture
FV31S-SW softwareOlypmusImage acquisition
GeneticinGibco1563411for transfection
Gibson assembly method for cloningBIOMATIKConstruction of synthetic circuit
Graphpad prismGraphpadStatistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814for cDNA synthesis
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagent preparation
KanamycinSigma60615For transformation and colony selection
Luria Bertini brothHimediaM1245For culturing E.coli
Magnesium chlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032For qRT-PCR
Microwave ovenLGMC-7649DWFor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPFor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker AgitatorDIAB
National centre for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfor contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamberMarienfeld superior640010For cell count
Non-vented 25cm2 flaskCorning353014For culturing parasite
NotIBioLabsR3189MRestriction enzyme
Nuclease free waterBiodesign1QIAReagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusImage processing
Olympus FV 3000OlympusFor confocal imaging
OPTI-MEM mediaGibco31985070media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuitBiomatik
PenicillinThermoFischer Scientific15070063For cell culture
PolyethylenimineMERCK764965for transfection
Potassium AcetateFischer ScientificYBP364500Buffer /Reagent preparation
Potassium ChlorideFischer ScientificBP366Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate MonobasicSigmaP5655Buffer /Reagent preparation
Power supply packBIORAD1645070For AGE
Registry of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefor contruction of synthetic circuit
RNAiso PlusTakara38220090For RNA isolation
RNase AThermoFischer Scientific12091021Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute MediumNational centre for cell scienceFor culturing parasite
Shaker incubatorREMICIS 24 plusFor culturing E.coli
Sodium chlorideQualigensQ27605Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771Buffer /Reagent preparation
Sodium HydroxideFischer Scientific15895Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Buffer /Reagent preparation
SpectrophotometerEppendorfEstimation of plasmid concentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR systemLife technologies272006777For qRT-PCR
StepOne software version 2.3Life technologiesFor qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellSynthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFischer Scientific10488085For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorideHimediaMB029Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Buffer /Reagent preparation
Trypan blueSigmaT8154For cell count
XhoIBioLabsR0146SRestriction enzyme

Ссылки

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241 (2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены