JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتضمن علم الوراثة الكيميائية استبدال بقايا حارس البوابة بحمض أميني يحتوي على سلسلة جانبية مختلفة في الموضع المستهدف. هنا ، قمنا بإنشاء طفيلي متحور يحتوي على أليل ناقص الشكل من cdpk1 وحددنا المسارات التعويضية التي اعتمدها الطفيلي في الخلفية الطافرة.

Abstract

تتمثل إحدى آليات تخريب تأثير الأدوية من قبل طفيلي الملاريا في إعادة توصيل نسخه. يكون التأثير أكثر وضوحا للجينات المستهدفة التي تنتمي إلى عائلة متعددة الجينات. تعتبر كينازات بروتين المتصورة المنجلية التي تنتمي إلى عائلة CDPK ضرورية لتطور مرحلة الدم. على هذا النحو ، تعتبر CDPKs أهدافا جيدة لتطوير المركبات المضادة للملاريا. تم استخدام نهج علم الوراثة الكيميائية تاريخيا لتوضيح وظيفة كينازات البروتين في حقيقيات النوى العليا. يتطلب استبدال بقايا حارس البوابة بحمض أميني آخر بسلسلة جانبية مختلفة من خلال التلاعب الجيني. يعدل استبدال الأحماض الأمينية في موضع حارس البوابة نشاط بروتين كيناز ويغير قابليته لفئة معينة من المركبات المعروفة باسم مثبطات كيناز الصدمات (BKIs) التي تساعد في التحديد الوظيفي للجين المستهدف. هنا ، استغلنا نهج علم الوراثة الكيميائية لفهم الآليات التعويضية التي تطورها طفيلي متحور يؤوي أليلا ناقص الشكل من cdpk1. بشكل عام ، يساعد نهجنا في تحديد المسارات التعويضية التي يمكن استهدافها في نفس الوقت لمنع تطور مقاومة الأدوية ضد الكينازات الفردية.

Introduction

الملاريا هي واحدة من الأمراض المعدية الرئيسية المسؤولة عن ملايين الوفيات كل عام ، خاصة عند الأطفال دون سن 5سنوات. لا يوجد لقاح متاح سريريا ضد الملاريا. علاوة على ذلك ، من المعروف أن المتصورة المنجلية ، وهو أكثر طفيليات الملاريا فتكا ، قد اكتسب مقاومة ضد عقار الخطوط الأمامية المسمى الأرتيميسينين2،3،4،5. وهناك ضرورة ملحة لتحديد أهداف جديدة للأدوية واستراتيجيات جديدة يمكن نشرها بسرعة لتجنب انتشار مقاومة الأرتيميسينين في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يساعد الفهم الأفضل لآلية عمل الدواء والأساس الجزيئي للمسارات التعويضية في وضع استراتيجيات أفضل لتجنب تطور مقاومة الأدوية.

تعتبر كينازات البروتين التي تنتمي إلى عائلة كينازات البروتين المعتمدة على الكالسيوم (CDPKs) حاسمة في العديد من مراحل تطور الطفيليات خلال مراحل كريات الدم الحمراء والجنسية وما قبل كريات الدمالحمراء 6. أثناء التكاثر اللاجنسي ل P. المنجل ، من المعروف أن CDPK5 يلعب دورا مهما في خروج المروزويت من الفصام الناضجة7. لا يسمح الحذف المشروط ل CDPK5 للفصام بإطلاق الميروزويت في مجرى الدم ، مما يؤدي إلى موت الطفيلي. الآلية الجزيئية لخروج الطفيليات بوساطة CDPK5 غير مفهومة تماما ويعتقد أنها تتضمن بروتين كيناز G (PKG) كمنظم أولي7،8. CDPK7 ضروري لنضج طفيليات المرحلة الحلقية إلى تروفوزويت9. CDPK4 هو عضو آخر في عائلة CDPK وهو أمر بالغ الأهمية لتطور المرحلة الجنسية داخل البعوض. يشارك في خطوات متعددة أثناء عملية الإفصال ، وبالتالي فهو بالغ الأهمية لتكوين الأمشاج الحرة والمتحركة والذكورية10،11،12،13. مكونات الفوسفوريلات CDPK1 لمركب الغشاء الداخلي والروبتري14،15. علاوة على ذلك ، يؤدي الحذف المشروط ل CDPK1 إلى نقص فسفرة البروتينات المشاركة في غزو كرات الدمالحمراء 16. ثبت أن CDPK1 ينظم تصريف العضيات القمية أثناء عملية الغزو17. يساعد CDPK1 أيضا في خروج ميروزويت من كرات الدم الحمراء المصابة عن طريق فسفرة بروتياز SERA518. يتم توطين CDPK1 الفسفوري بشكل تفضيلي في الطرف القمي من الميروزويت ، حيث قد يتفاعل مع بروتينات الطفيليات الأخرى المطلوبة لعمليةالغزو 19،20. يشارك CDPK1 أيضا في تكوين الأمشاج الذكرية والأنثوية ، وهي خطوة حاسمة لانتقال الملاريا والتطور الجنسي للطفيلي داخل البعوض21.

تم استخدام نهج علم الوراثة الكيميائية تاريخيا لتحديد الأدوار الوظيفية لكينازات الثدييات22،23. يستخدم النهج استبدال بقايا في موضع حارس البوابة بحمض أميني لسلسلة جانبية مختلفة. يؤدي تغيير بقايا حارس البوابة إلى تعديل حجم جيب ATP المجاور الذي بدوره يغير إمكانية الوصول إلى المركبات الكيميائية التي تسمى مثبطات كيناز الاصطدام (BKIs) تجاه الإنزيم المتحور مقارنة بالنوع البري. يسمح استبدال بقايا ضخمة في موضع حارس البوابة ببقايا أصغر بالوصول إلى BKIs ، بينما يجعل الاستبدال العكسي الكيناز مقاوما ل BKIs. في بعض الحالات ، يرتبط استبدال بقايا حارس البوابة بانخفاض نشاط كيناز الإنزيم المستهدف ، مما يجعل التعديل غير متسامح مع الدراسات الوظيفية24،25. يمكن عكس التأثير السلبي لاستبدال حارس البوابة على نشاط الإنزيم عن طريق توليد طفرة مثبطة في موقع ثان في كيناز25 غير المتسامح. تم استخدام نهج علم الوراثة الكيميائية لدراسة وظيفة كينازات بروتين Apicomplexan. تم تثبيط CDPK4 من النوع البري الذي يحتوي على بقايا أصغر لحارس البوابة بشكل انتقائي بواسطة مثبطات كيناز المصططحة BKI-1 و 1294 ، مما أدى إلى كتلة في تكوين الأمشاج الذكرية وتطور البويضات11،12. أدى استبدال بقايا حارس البوابة الصغيرة في CDPK4 ببقايا ميثيونين ضخمة إلى انخفاض في التثبيط بوساطة BKI في الإفصال11. تبين أن CDPK1 من Toxoplasma gondii ، وهو طفيلي Apicomplexan يرتبط ارتباطا وثيقا بطفيلي الملاريا ، متورط في حركة وغزو الخلايا المضيفة بواسطة تسرع الطبيعة26،27. تم استغلال جيب حارس البوابة الأصغر من النوع البري TgCDPK1 لتصميم مثبطات محددة قللت من التسبب في المرض في النماذج الحيوانية28،29. إشراك P. المنجل تم إثبات بروتين كيناز G (PKG) في التطور الفصامي المتأخر وتكوين الأمشاج من خلال تثبيط نشاط الإنزيم باستخدام مثبطات دوائية محددة30،31. أدى استبدال ثريونين في موضع حارس البوابة بالجلوتامين (T618Q) إلى تقليل حساسية الإنزيم المتحور للمثبطات بشكل كبير ، مما أدى إلى تكوين الأمشاج الطبيعي والتقدم من الفصام إلى الحلقة30،31.

استخدمت معظم الدراسات السابقة نهج علم الوراثة الكيميائية للتوصيف الوظيفي للكينازاتالمستهدفة 11،12،22،23،26،30،31 ومع ذلك ، فقد اعتمدنا هذا النهج لفهم تطور الآليات التعويضية في الطفيليات التي تؤوي أليل ناقص الشكل لبروتين كيناز. لقد أظهرنا سابقا أن استبدال بقايا حارس البوابة من النوع البري في CDPK1 بالميثيونين (T145M) يؤدي إلى انخفاض ~ 47٪ في إمكانات تحويل الفسفرة للإنزيم المتحور32. تم تكييف الطفيلي المتحور الذي يحتوي على الأليل ناقص الشكل ل cdpk1 (cdpk1t145m) مسبقا لتقليل نشاط CDPK1 عن طريق إعادة توصيل الأسلاك النسخية لأفراد عائلة CDPK الآخرين. نعتقد أنه يمكن استخدام هذه الاستراتيجية بشكل عام لتوضيح الآليات التعويضية في الطفيليات الطافرة التي تحتوي على أليلات ناقص الشكل لكينازات البروتين الأساسية. يمكن تثبيط الكينازات الأخرى التي تعوض جزئيا عن وظيفة الكيناز المستهدف في وقت واحد جنبا إلى جنب مع الكيناز المستهدف لمنع تطور مقاومة الأدوية ضد الكينازات الفردية. وقد يكون هذا بمثابة استراتيجية أفضل لمكافحة الملاريا.

Protocol

وذا ف. تم الحصول على سلالة طفيلي المنجل (NF54) من ألفارو مولينا كروز21،32،33. تم الحصول على خلايا الدم الحمراء البشرية O + المستخدمة في زراعة الطفيليات من مركز الدم الدوار ، نيودلهي ، الهند. تم الحصول على البلازميدات ، pL6eGFP و pUF1 ، من خوسيه خوان لوبيز روبيو. تم الحصول على DSM267 من Margaret A. Phillips و Pradipsinh K. Rathod. تم توفير WR99210 من قبل شركة جاكوبوس للأدوية.

1. بناء البلازميد للتعبير عن CDPK1 المؤتلف في الإشريكية القولونية

  1. تصميم زوج أولي قليل النوكليوتيدات التمهيدي لتضخيم CDS الكامل لجين cdpk1 (انضمام PlasmoDB no. PF3D7_0217500) باستخدام برنامج تحليل التمهيدي.
    1. تضخيم CDS الكامل باستخدام بوليميراز الحمض النووي مع زوج قليل النوكليوتيدات الخاص بالجين: Pk1fpgex و Pk1rpgex (انظر الجدول 1) باستخدام (كدنا) المحضر من المتصورة المنجلية كقالب في حجم تفاعل يبلغ 20 ميكرولتر. اضبط شروط تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، (التمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، التلدين عند 52 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، تمديد عند 62 درجة مئوية لمدة 20 ثانية) × 36 ، التمديد النهائي عند 62 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتخزين منتج PCR على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  2. قم باستيعاب 1 ميكروغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم و 1 ميكروغرام من بلازميد التعبير pGEX4T1 مع نوكليازات تقييد BamHI (20,000 وحدة / مل) و NotI (20,000 وحدة / مل) لمدة 3-4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 30 ميكرولتر.
  3. لتنقية منتج PCR مزدوج الهضم والبلازميد ، استخدم مجموعة تنظيف PCR القائمة على العمود واتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بربط 100 نانوغرام من البلازميد pGEX4T1 مزدوج الهضم والنقي مع إدراج بنسبة مولار 1: 5 متجه إلى إدراج باستخدام 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر.
  5. تحويل E. القولونيه DH5α الخلايا المختصة مع الخليط المرتبط باتباع بروتوكول الشركة المصنعة واللوحة على ألواح أجار LB تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل).
  6. قم بفحص أربعة نسخ بكتيرية تم الحصول عليها من التحول لوجود البلازميد المؤتلف عن طريق تنقية البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميد المصغرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من البلازميد المؤتلف عن طريق الهضم المزدوج باستخدام BamHI و NotI ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3.
  7. تحقق بشكل أكبر من الاستنساخ الإيجابي للهضم للتسلسل الصحيح عن طريق تسلسل Sanger DNA. تحويل E. القولونيه BLR (DE3) pLysS الخلايا المختصة مع بنية البلازميد التي تم التحقق منها بالتسلسل لتعبير بروتين CDPK1.

2. التعبير عن وتنقية بروتين CDPK1 المؤتلف في الإشريكية القولونية

  1. التعبير عن CDPK1 المؤتلف
    1. تلقيح استنساخ واحد من E. القولونيه سلالة BLR (DE3) pLysS التي تحتوي على بنية البلازميد التي تم التحقق منها بالتسلسل في 10 مل من وسط LB الذي يحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل). احتضان المزرعة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة.
    2. تلقيح المزرعة الثانوية بنسبة 1٪ من الثقافة الأولية والسماح للخلايا البكتيرية بالنمو إلى مرحلة منتصف السجل عند 37 درجة مئوية. عندما تصل الكثافة الضوئية (OD) للثقافة الثانوية إلى 0.7-0.9 عند 600 نانومتر ، قم بتحفيز التعبير عن CDPK1 المؤتلف كامل الطول عن طريق إضافة 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) واحتضانه لمدة 10-12 ساعة عند 24 درجة مئوية.
    3. بعد الحضانة ، حصاد E. خلايا القولونية عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية والاحتفاظ بحبيبات الخلية.
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل بالتركيبة التالية: 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، 0.1 مجم / مل ليزوزيم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، وكوكتيل مثبط البروتياز 1x في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 أضعاف حجم وزن الحبيبات للمخزن المؤقت للتحلل. قم بتشغيل تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة على فترات 9 ثوان ، و 15 ثانية لمنع التسخين الموضعي الذي قد يؤدي إلى تمسخ البروتين.
    6. جهاز الطرد المركزي للمحللة عند 17,000 × جم لمدة ساعة واحدة واحتضان المادة الطافية الصافية بخرز الجلوتاثيون طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اتبع البروتوكول المذكور أدناه للحصول على بروتين CDPK1 المؤتلف المنقى.
  2. كروماتوغرافيا التقارب باستخدام حبات الجلوتاثيون لتنقية CDPK1 الموسومة بضريبة السلع والخدمات
    1. خذ 500 ميكرولتر من حبات الجلوتاثيون المعلقة تماما للحصول على 250 مل من الثقافة البكتيرية وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب بعناية المادة الطافية
    2. اغسل الخرزات ب 5 مل من المخزن المؤقت الملزم (140 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي Na2HPO4 ، 1.8 ملي KH2PO4 ، درجة الحموضة 7.3) واقلبها للخلط.
    3. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر الغسيل والطرد المركزي لمدة 3x-4x.
    4. أضف الخرزات إلى محللة خلية البكتيريا واحتضانها لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز طفيف (20-30 دورة في الدقيقة).
    5. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. يمكن حفظ المادة الطافية لتقدير كمية CDPK1 المؤتلف التي تظل غير مرتبطة.
    6. اغسل الخرزات المرتبطة ب CDPK1 5-6 مرات على الأقل باستخدام PBS الذي يحتوي على 1 ملي مولار DTT متبوعا بغسل ب 50 ملي تريس ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار DTT ، درجة الحموضة 7.5.
    7. قم بتصفية البروتين المرتبط 2x أولا ب 250 ميكرولتر من محلول الشطف 1 (EB1) متبوعا ب 2x مع 250 ميكرولتر من محلول الشطف 2 (EB2). تكوين EB1 و EB2 هو 10 ملي مولار من الجلوتاثيون المخفض في 50 ملي مولار تريس ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 و 20 ملي مولار ، وانخفاض الجلوتاثيون في 50 ملي تريس ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، على التوالي.
    8. احتضان الخرزات المرتبطة ب CDPK1 في مخازن الشطف 1 و 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5-10 دقائق باستخدام التحريك اللطيف أو الدوران النهائي.
    9. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية التي تحتوي على البروتين المؤتلف CDPK1 المملوث بعناية في أنبوب منفصل.
    10. كرر الخطوتين 2.2.8 و 2.2.9 للحصول على 2 elutes لكل منهما EB1 و EB2.

3. الطفرات الموجهة للموقع لتوليد البروتينات الطافرة المؤتلفة CDPK1

  1. استخدم البلازميد pGEX4T1 الذي يحتوي على جين cdpk1 الذي تم التحقق منه بالتسلسل. نحن نفضل استخدام نفس البلازميد الذي تم استخدامه لتحويل بكتريا قولونية BLR (DE3) سلالة pLysS.
  2. صمم الاشعال لإدخال طفرة حارس البوابة في تسلسل الجينات cdpk1 من النوع البري. يتم ترميز بقايا حارس البوابة من النوع البري (T145) بواسطة كودون ACC في جين cdpk1 . استبدل حارس بوابة الثريونين ببقايا حارس البوابة الصغيرة (سيرين ، T145S) والضخمة (الميثيونين ، T145M) التي يتم ترميزها بواسطة أكواد AGC و ATG ، على التوالي.
  3. اتبع الإرشادات المذكورة أدناه لتصميم الاشعال الأمامية والخلفية للطفرات الموجهة نحو الموقع.
    1. تأكد من أن كلا البرايمرين مكملان لبعضهما البعض. احتفظ ب 15-20 نيوكليوتيد من التسلسل غير المعدل على جانبي الطفرة. تأكد من أن Tm من 50 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية للتسلسل ، باستثناء الموقع المتحور.
  4. استخدم مجموعة طفرات التواجد الموجهة للموقع لإنشاء التركيبات الطافرة لحارس البوابة ل cdpk1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإدخال الطفرة المطلوبة. يتم سرد البادئات المستخدمة في الطفرات الموجهة للموقع في الجدول 1.
  5. عالج خليط التفاعل بإنزيم 0.5 ميكرولتر DpnI (20,000 وحدة / مل) لهضم البلازميد الأبوي الميثيلي. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. قم بتحويل بكتريا قولونية DH5α الخلايا المختصة بخليط التفاعل المعالج ب DpnI.
  6. قم بفحص أربعة نسخ من كل من تركيبات البلازميد T145M و T145S للتحقق من إدخال الطفرة المطلوبة في تسلسل الجينات cdpk1 من خلال تسلسل الحمض النووي.
  7. قم بتحويل البلازميدات التي تم التحقق منها بالتسلسل في بكتريا قولونية BLR (DE3) سلالة pLysS للتعبير عن بروتينات CDPK1 T145M / S المؤتلفة كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  8. قم بالتعبير عن البروتينات الطافرة CDPK1 لحارس البوابة وتنقيتها باتباع الخطوات الموضحة في القسم 2 لبروتين CDPK1 من النوع البري.

4. فحص نشاط كيناز المختبر ل CDPK1

ملاحظة: يتم تقييم نشاط كيناز CDPK1 المؤتلف من النوع البري والبروتينات الطافرة لحارس البوابة من خلال نهج وضع علامات على الحاتمة شبه الاصطناعية كما هو موضح من قبل Allen et al.34.

  1. احتضان 50 نانوغرام من البروتين المؤتلف في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملي مولار تريس ، 50 ملي مولار MgCl2 ، كوكتيل مثبط الفوسفات 1x مع 2 ميكروغرام من بروتين المايلين الأساسي (MBP) كركيزة خارجية ل CDPK1 في خليط التفاعل الكلي البالغ 50 ميكرولتر.
  2. اعتمادا على الظروف التي تتطلب وجود أو عدم وجود الكالسيوم ، أضف CaCl2 أو EGTA ، على التوالي لجعل التركيز النهائي البالغ 2.5 ملي مولار لكل منهما في مخزن فحص الكيناز. أضف ATPγS إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومتر إلى المخزن المؤقت لاستخدامه كمصدر لمجموعة الفوسفات الطرفية القابلة للتحويل.
  3. احتضان خليط التفاعل عند 30 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بإنهاء التفاعل بإضافة 5 ملي مولار EGTA. أضف 5 ميكرولتر من 50 ملي مولار p-nitrobenzyl mesylate (PNBM) إلى خليط التفاعل واتركه يحتضن عند 20 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعتين من أجل ألكلة بقايا السيرين والثريونين المفسفرة في الفسفرة MBP و CDPK1 الفسفورة الذاتية.
  4. إلى إجمالي 55 ميكرولتر من خليط التفاعل ، أضف 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 4x وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

5. تحليل اللطخة الغربية للكشف عن منتجات الفيسفرة من مقايسة كيناز في المختبر

  1. قم بإعداد جل SDS-PAGE بنسبة 12٪ وقم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة. افصل خليط التفاعل لتصور CDPK1 الفسفوري ذاتيا و MBP عبر الفسفرة.
  2. انقل البروتينات المنفصلة من جل SDS-PAGE إلى غشاء PVDF باستخدام طريقة النقل الرطب32.
  3. قم بسد المواقع غير المحددة على غشاء PVDF عن طريق احتضانه بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن في Tris (20 ملي مولار Tris-HCL ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم) يحتوي على 0.05٪ توين 20 لمدة ساعة واحدة في RT.
  4. احتضان غشاء PVDF بالجسم المضاد الأولي للأرانب ضد المقاربات المالكة للثيوفسفرة المؤلكلة عند تخفيف 1: 2,500 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت للحظر.
  5. بعد الحضانة طوال الليل ، اغسل اللطخة 3x بمحلول ملحي مخزن ب Tris مع 0.05٪ Tween 20 لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  6. احتضان اللطخة بشكل أكبر بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب للماعز في منع المخزن المؤقت عند تخفيف 1: 5,000 لمدة ساعة واحدة في RT ، متبوعا بالغسيل بمحلول ملحي يحتوي على 0.05٪ Tween 20.
  7. قم بتراكب اللطخة بركيزة كيميائية عن طريق خلط نسبة متساوية من المحلول A والمحلول B وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وعرضها على فيلم الأشعة السينية في غرفة مظلمة للحصول على إشارات الفسفرة الذاتية CDPK1 ونقل الفسفرة MBP.

6. استنساخ تسلسل الدليل لاستهدافموضعcdpk1 لإدخال استبدال حارس البوابة  

ملاحظة: تم اختيار التسلسل الإرشادي المكون من 20 نيوكليوتيد عن طريق التنظيم اليدوي واستنساخه في بلازميد pL6eGFP في موقع BtgZI باستخدام الخطوات التالية.

  1. هضم pL6eGFP باستخدام إنزيم BtgZI
    1. هضم 1 ميكروغرام من pL6eGFP البلازميد35 مع 1 ميكرولتر من إنزيم BtgZI (5,000 وحدة / مل) لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية في خليط تفاعل من 20 ميكرولتر ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للإنزيم لظروف التفاعل.
    2. بعد فترة الحضانة التي استمرت 4 ساعات ، قم بتشغيل البلازميد المهضوم على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ واستخرج قطعة الهلام (~ 9.8 كيلو بايت) التي تحتوي على البلازميد المهضوم. قم بتنقية البلازميد المهضوم باستخدام مجموعة استخراج الجل القائمة على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تلدين oligos
    1. أعد تكوين قليل النوكليوتيدات (Ck1GUIDEFWD و Ck1GUIDEREV) في ماء خال من DNase / RNase لتحضير محلول مخزون 100 ميكرومتر.
    2. امزج 20 ميكرومتر من كل قليل النوكليوتيد في محلول يحتوي على 10 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 8.0) و 50 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار EDTA. احتضن الخليط عند 95 درجة مئوية في حمام جاف لمدة 5 دقائق واترك التفاعل يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. عادة ما يستغرق الأمر 1 ساعة حتى تصل درجة حرارة خليط التفاعل إلى RT.
    3. قم بتخفيف قليل النوكليوتيدات الملدنة إلى 0.5 ميكرومتر في Tris pH 8.0 ، مما ينتج عنه حجم خليط تفاعل إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر.
  3. تفاعل الاندماج
    1. اجمع بين 1.5 ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات المخففة مع 100 نانوغرام من البلازميد الخطي المهضوم BtgZI في خلطة أولية من إنزيم In-Fusion 5x في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر لتوليد دليل CDPK1 يحتوي على بلازميد pL6CK1G.
    2. احتضان التفاعل لمدة 15 دقيقة عند 50 درجة مئوية. قم بتخزين التفاعل عند 4 درجات مئوية حتى المضي قدما في تحويل E. القولونية.
      ملاحظة: للتخزين طويل الأجل ، يمكن تخزين مزيج التفاعل عند -20 درجة مئوية.
  4. تحويل E. القولونيه الخلايا النجمية المختصة
    1. أضف 2.5 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى E. القولونيه الخلايا النجمية المختصة والمضي قدما في عملية التحويل باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قم بوضع الخلايا المختصة المحولة على صفيحة LB ampicillin (100 ميكروغرام / مل) واسمح للبكتيريا المحولة بالنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. حدد المستعمرات المحولة واستخرج البلازميد باستخدام مجموعة أدوات التحضير المصغرة للبلازميد المتوفرة تجاريا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية البلازميد. تحقق من صحة إدخال الدليل في البلازميد من خلال تسلسل Sanger DNA.

7. استنساخ ذراع التماثل لإصلاح موضع cdpk1 المقيد ب Cas9

ملاحظة: يتم تصنيع ذراع التماثل الذي يشتمل على تعدد الأشكال المراد إدخاله في الموضع المستهدف تجاريا. عادة ما نأخذ ذراع تماثل بطول 400-1000 نقطة أساس. يحتوي ذراع التماثل على طفرات صامتة في منطقة الحمض النووي الريبي الإرشادية و PAM لمنع إعادة قطع الموضع المعدل بعد دمج تعدد الأشكال المطلوب. ذراع التماثل (المقابل للنيوكليوتيدات من 133 إلى 553 من CDPK1) ، الذي يتضمن طفرة حارس البوابة Met أو Ser والطفرات الصامتة ، محاط بمواقع تقييد AflII و SpeI.

  1. هضم مزدوج 1 ميكروغرام من pL6CK1G والبلازميد الذي يحتوي على ذراع التماثل باستخدام 0.5 ميكرولتر لكل من إنزيمات التقييد AflII (20,000 وحدة / مل) و SpeI (20,000 وحدة / مل) لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في خليط تفاعل من 20 ميكرولتر.
  2. قم بتشغيل التفاعل الكامل للبلازميدات مزدوجة الهضم على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ وتنقية العصابات المقابلة لذراع التماثل والعمود الفقري البلازميد ل pL6CK1 باستخدام مجموعة استخراج الجل باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. اربط ذراع التماثل المهضوم ب 100 نانوغرام من بلازميد pL6CK1 بنسبة متجه إلى إدراج تبلغ 1: 5 في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر باستخدام T4 DNA ligase. احتضان تفاعل الربط طوال الليل عند 16 درجة مئوية. قم بتحويل بكتريا قولونية DH5α الخلايا المختصة بخليط الربط الكامل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بوضع الخلايا المحولة على ألواح أجار LB التي تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) لتحديد المحولات الموجبة. حدد مستعمرات مفردة من صفيحة LB ampicillin وقم بتنقية البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد.
  5. تأكد من استنساخ وجود ذراع التماثل عن طريق هضم البلازميد المنقى باستخدام إنزيمات AflII و SpeI باستخدام نفس حالة الهضم كما هو موضح في الخطوة 7.3. قم بتأكيد الاستنساخ الإيجابي للهضم المزدوج بشكل أكبر عن طريق تسلسل Sanger DNA للتحقق من صحة التسلسل الكامل لذراع التماثل.

8. تنقية البلازميدات pL6CK1Met و pL6CK1Ser و pUF1 لتعداء طفيليات الملاريا

  1. اضبط 5 مل من الثقافات الأولية للاستنساخ الذي تم التحقق منه بالتسلسل من pL6CK1Met و pL6CK1Ser و pUF1 في وسائط LB التي تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضانها لمدة 10 ساعات. نقل المزرعة الأولية إلى المزرعة الثانوية بنسبة 1: 1000 واحتضانها لمدة 12 ساعة إضافية.
  2. حبيبات الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق في زجاجة أجهزة الطرد المركزي.
  3. اعزل البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإذابة الحمض النووي البلازميد في ماء خال من DNase / RNase من أجل التعداء المباشر للطفيلي.

9. الاستزراع في المختبر لتزامن المتصورة المنجلية والسوربيتول من أجل التعدي

ملاحظة: المتصورة المنجلية في الثقافة المختبرية في خلايا الدم الحمراء البشرية (كرات الدم الحمراء) يتم إجراؤها وفقا للطريقة التي حددها Trager و Jensen36.

  1. نشر سلالة NF54 من P. المنجل عن طريق الاستزراع في O + كرات الدم الحمراء البشرية عند هيماتوكريت بنسبة 2٪ في وسط RPMI كامل (cRPMI) يحتوي على RPMI 1640 مكمل ب L-glutamine و 25 mM HEPES و 25 ملي مولار بيكربونات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل هيبوكسانثين. استكمل الوسط بنسبة 0.5٪ AlbuMAX II و 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين وحافظ على المزرعة عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ O2 و 5٪ CO2 و 90٪ N2.
  2. من أجل تزامن السوربيتول للحصول على طفيلي المرحلة الحلقية ، قم بتكسير الطفيليات غير المتزامنة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي عند 2,300 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
  3. احتضان كرات الدم الحمراء المتطفلة ب 9 أحجام من السوربيتول بنسبة 5٪ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتكسير كرات الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي عند 2,300 × جم لمدة 3 دقائق وتخلص من السوربيتول.
  4. اغسل الطفيليات المعالجة بالسوربيتول ب RPMI و iRPMI (وسائط RPMI بدون ألبوماكس وبيكربونات الصوديوم) غير مكتملة واحتضانها لاحقا في cRPMI. استخدم طفيليات المرحلة الحلقية في الدورة التالية لتعداء البلازميد.

10. تعداء طفيلي المرحلة الحلقية باستخدام البلازميدات pL6CK1Met و pL6CK1Ser و pUF1

ملاحظة: يتم استخدام الخطوات التالية للتعداء المباشر لطفيليات المرحلة الحلقية مع الحمض النووي البلازميد.

  1. قم بإعداد 2x Cytomix Buffer37 عن طريق الذوبان في 30 مل من الماء ، و 240 ملي كلوريد كلوريد ، و 0.3 ملي CaCl2 ، و 4 ملي مولار EGTA ، و 10 ملي ملي كلوريد2 ، و 20 ملي كلوريد2، و HPO4 / KH2PO4 ، و 50 ملي مولار HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6. اضبط مستوى الصوت النهائي على 50 مل. قم بتعقيم الفلتر المخزن المؤقت باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف المخزن المؤقت 2x cytomix بالماء المعقم للحصول على مخزن مؤقت 1x cytomix.
  2. في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل ، أضف 100 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المتطفلة المعبأة ذات المراحل الحلقية واغسلها 2x مع 5 مل من 1x cytomix buffer. قم بإجراء عمليات الغسيل بالطرد المركزي عند 994 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
  3. بعد الغسيل ، قم بإزالة المخزن المؤقت وأضف 50 ميكروغرام من كل بلازميد (pL6CK1Met / pUF1 لتوليد طفرة T145M و pL6CK1Ser / pUF1 لتوليد طفرة T145S) في كرات الدم الحمراء المتطفلة المعبأة. بعد ذلك ، أضف 2x buffer وفقا لحجم البلازميد واضبط الحجم على 400 ميكرولتر بتركيز عازلة 1x.
  4. انقل 400 ميكرولتر من المحلول أعلاه إلى كوفيت 0.2 سم لكل تعداد. التثقيب الكهربائي باستخدام الشروط التالية: 0.31 كيلو فولت ، 950 ميكرو فهرنهايت ، وضبط المقاومة على لانهائي.
  5. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة الطفيليات المنقولة من الكوفيت ، واخلطها مع cRPMI ، وانقلها إلى قارورة T25 بحجم إجمالي يبلغ 15 مل. احتضان الطفيليات لمدة 2 ساعة وفقا للشروط المذكورة في الخطوة 9.1.
  6. بعد الحضانة ، انقل الطفيليات المنقولة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي بمعدل 994 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الطفيليات ب 10 مل من RPMI غير المكتمل. استزراعها باستخدام cRPMI الطازج لمدة يومين ، وتجديد وسط الثقافة بعد 24 ساعة.
  7. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة cRPMI من كل قارورة وقم بتعليق الثقافة في cRPMI التي تحتوي على 2 نانومتر من WR99210 و 150 نانومتر من DSM26738. بعد ذلك ، انقل المزرعة إلى قارورة T75 عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء الطازجة. قم بتجديد الوسائط يوميا باستخدام cRPMI الذي يحتوي على WR99210 و DSM267 لمدة 7 أيام. بعد ذلك ، أضف cRPMI الذي يحتوي على كلا الدواءين كل يومين حتى اليوم 14 بعد التعدي.
  8. في اليوم 14 ، تناول 200 ميكرولتر من الثقافة المنقولة في 1.5 مل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق (MCT) لإعداد الشرائح. قم بحفر الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بشفط المادة الطافية ونقل الخلايا إلى الشريحة. قم بعمل مسحة باستخدام شريحة أخرى عن طريق وضعها بزاوية 45 درجة.
  9. قم بإصلاح الشريحة في الميثانول وقم بإعداد صبغة Giemsa عن طريق تخفيفها 1:10 في ماء فائق النقاء. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشريحة عن طريق غمرها تماما في بقعة Giemsa لمدة 20 دقيقة. اغسل الشريحة تحت الماء الجاري وجففها جيدا. بعد ذلك ، راقب الشريحة تحت مجهر ضوئي بتكبير 100x عن طريق تطبيق زيت الغمر.
  10. بمجرد تصور الطفيليات ، قم بتجديد الوسائط يوميا واسمح لها بالنمو لمدة 2-3 أيام. بعد ذلك ، قم بإزالة الطفيليات للتحقق من التعديل المطلوب في تسلسل الجينات المستهدفة في الموضع المستهدف.
    ملاحظة: إذا لم تكن الطفيليات مرئية في اليوم 14 ، فقم بتجديد الوسائط (التي تحتوي على كلا الدواء) بعد 4 أيام. قطع الطفيلي بنسبة 30٪ وإضافة الدم الطازج للحفاظ على 2٪ هيماتوكريت كل 7 أيام حتى تظهر الطفيليات مرة أخرى.

11. التحقق من تفاعل البوليميراز المتسلسل للطفيلي المعدل وراثيا مع التعديل المطلوب لموضع cdpk1

  1. بعد 2-3 أيام من نمو الطفيليات ، أخرج 500 ميكرولتر من المزرعة وانقلها إلى 1.5 مل MCT.
  2. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2,400 × جم لمدة 5 دقائق. ثم ، قم بتحلل كرات الدم الحمراء عن طريق علاج الصابونين.
    1. لمعالجة الصابونين ، أضف 10 ميكرولتر من محلول الصابونين بنسبة 10٪ إلى 1 مل من حبيبات الطفيليات المعلقة واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 2,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة حتى يختفي الاحمرار تماما ويتم الحصول على حبيبات من الطفيليات سوداء اللون.
  3. اغسل حبيبات الطفيليات ب 1 مل من 1x PBS عن طريق الطرد المركزي عند 2,400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase. قم بتسخين حبيبات الطفيليات العالقة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعة بالطرد المركزي عند 16,200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل الحمض النووي الطففي المحتوي على الطفيلي إلى أنبوب جديد.
  4. استخدم المادة الوراثية المذكورة أعلاه لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجين كامل الطول باستخدام مجموعة التمهيدي ck1f1 و ck1r3wt (انظر الجدول 1) ، واستهداف المنطقة خارج ذراع التماثل على وجه التحديد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2. تسلسل منطقة التماثل التي تحتوي على طفرة T145M باستخدام التمهيدي ck1f1 .

12. الحد من التخفيف للحصول على الطفيليات المعدلة وراثيا النسيلة

  1. بعد التحقق من التسلسل ، قم بتخفيف ثقافة الطفيليات المنقولة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 طفيلي لكل 200 ميكرولتر. ثم أضف 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة إلى آبار صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا. قم بتنفيذ الخطوات التالية (12.2-12.4) لتحقيق 1 طفيلي / 200 ميكرولتر.
  2. تحضير 10 مل من كرات الدم الحمراء المتطفلة مع 2٪ هيماتوكريت. قم بتقدير النسبة المئوية لطفيليات الثقافة باستخدام طريقة تلطيخ Giemsa الموضحة أعلاه. بعد ذلك ، احسب العدد الإجمالي لكرات الدم الحمراء في مزرعة مخففة 1: 100 باستخدام مقياس كثافة الدم.
    العدد الإجمالي لكرات الدم الحمراء / مل = متوسط عدد كرات الدم الحمراء المحسوبة × عامل التخفيف × 104
    عدد كرات الدم الحمراء المتطفلة/مل = (النسبة المئوية للطفيليات × العدد الإجمالي لكرات الدم الحمروية/مل)/100
  3. قم بإعداد 1: 10,000 تخفيف كرات الدم الحمراء المتطفلة عن طريق تخفيف الثقافة الأولية بشكل متسلسل 2x (1: 100 تخفيف لكل منهما).
  4. أضف حجما مناسبا (بالميكرولتر) من المزرعة المخففة لتحقيق ما مجموعه 50 طفيليا في 10 مل من الوسائط ، مما يضمن 2٪ هيماتوكريت. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على 50 طفيليا إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا. ضع اللوحة في سيكادور محكم الغلق مغموس بالغاز المختلط (التركيب كما هو موضح أعلاه في الخطوة 9.1) واحتضنه عند 37 درجة مئوية. استبدل الوسائط بعد كل يومين.
  5. استبدل الوسائط ب cRPMI التي تحتوي على 2٪ هيماتوكريت كل7 أيام حتى تظهر الطفيليات.
    1. قم بإمالة اللوحة المكونة من 96 بئرا بزاوية 45 درجة واترك كرات الدم الحمراء تستقر. باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة الوسائط بعناية من كل بئر ولاحظ تغير اللون إلى اللون الأصفر في الآبار التي تحتوي على طفيليات ، على النقيض من اللون الوردي للوسائط في الآبار الخالية من الطفيليات. يحدث هذا التغير في اللون لأن الطفيليات تحمض الوسط.
  6. بعد ملاحظة تغير اللون ، أخرج كمية صغيرة من الثقافة من البئر الذي يظهر تغير اللون وقم بإعداد مسحة على شريحة ، وقم بتسميته برقم يتوافق مع موضع البئر. قم بتلطيخ الشريحة بصبغة Giemsa وراقبها تحت المجهر كما هو موضح أعلاه.
  7. انقل محتويات البئر إلى قارورة T25 حيث لوحظت الطفيليات تحت المجهر. اسمح للطفيليات بالنمو في قارورة T25 لمدة 4-5 أيام وتجديد الوسائط كل يومين.
  8. بمجرد أن تصل الطفيليات إلى 2-3٪ ، استخرج 500 ميكرولتر من زراعة الطفيليات. بعد ذلك ، قم بعمل لتحليل كرات الدم الحمراء بالصابونين والمضي قدما في استخراج المادة الوراثية الطفيلية باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 11.
  9. لتأكيد توليد الطفيليات المعدلة وراثيا النسيلة ، قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.1.1 وأرسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسل الحمض النووي لتأكيد إدخال تعدد الأشكال المطلوب في الموضع المستهدف.

13. تحليل النسخ باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

  1. تنقية بيركول / سوربيتول وتزامن الطفيليات
    1. قم بإعداد تدرج Percoll / Sorbitol39,40 عن طريق وضع طبقات متسلسلة من 3 مل لكل منها 70٪ متبوعا بمحلول 40٪ من percoll / sorbitol في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. ضع طبقة برفق من 1-2 مل من زراعة الطفيليات التي تحتوي في الغالب على طفيلي مرحلة الفصام WT و CDPK1 T145M أعلى التدرج.
    3. قم بالطرد المركزي التدرج عند 2,300 × جم لمدة 15 دقيقة عند RT باستخدام ضبط إلغاء التسارع على 4 في جهاز الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح.
    4. اجمع الحلقة الوسطى التي تحتوي على مراحل التروفوزوايت والفصام من الطفيلي من واجهة التدرج في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
    5. اغسل الطفيليات بإضافة حجم متساو 9: 1 (cRPMI: 10xPBS) ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 994 × جم لمدة 3 دقائق لحبيبات الطفيليات.
    6. اغسل الحبيبات مرة أخرى بمحلول 19: 1 (cRPMI: 10xPBS) ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 994 × جم لمدة 3 دقائق.
    7. أضف كل حبيبات طفيلية إلى قوارير منفصلة تحتوي على cRPMI مع 2٪ هيماتوكريت (محتضنة مسبقا عند 37 درجة مئوية). احتضان القوارير لمدة 4 ساعات في ظل الظروف كما هو موضح أعلاه في الخطوة 9.1 للسماح بغزو الميروزويت من الفصامات المخصبة إلى كرات الدم الحمراء الجديدة.
    8. بعد 4 ساعات ، عالج الطفيليات بالسوربيتول كما هو موضح أعلاه في الخطوات 9.2-9.4 للحصول على طفيليات متزامنة للغاية من 0 إلى 4 ساعات.
    9. احتضان الطفيليات المتزامنة لمدة 44 ساعة بعد العلاج بالسوربيتول للحصول على مرحلة الفصام 44-48 ساعة من الطفيلي.
  2. عزل الحمض النووي الريبي من فصام طفيليات WT و CDPK1 T145M
    1. حصاد طفيليات WT و CDPK1 T145M في 44-48 ساعة بعد الغزو. اغسل كريات الطفيليات ب 1x PBS عند 994 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. أعد تعليق الكريات الطفيلية في 1 مل من 1x PBS ومعالجتها بالصابونين لتحلل كرات الدم الحمراء المحيطة كما هو موضح في الخطوة 11.2.1.
    3. أعد تعليق حبيبات الطفيلي في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    4. قم بإذابة الحبيبات المجمدة عند 15-30 درجة مئوية للتفكك الكامل لمجمعات البروتين النووي.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وهز الأنابيب بقوة يدويا لمدة 15 ثانية. احتضن في RT لمدة 2-3 دقائق.
    6. جهاز الطرد المركزي للخليط عند 16,200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اعزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. تخليق (كدنا) من الحمض النووي الريبي لطفيلي WT و CDPK1 T145M
    1. عالج العينات المحتوية على الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة إزالة الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة لإزالة الحمض النووي الملوث.
    2. قم بتصنيع (كدنا) من عينات الحمض النووي الريبي المعزولة باستخدام مجموعة توليف (كدنا) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نستخدم بادئات سداسية عشوائية لعملية النسخ العكسي بدلا من بادئات oligo-dT.
    3. تأكد من عناصر التحكم في NO-RT (التفاعلات التي تم إعدادها دون إضافة إنزيم النسخ العكسي) لكل عينة من الحمض النووي الريبي المستخدمة لتحضير (كدنا) لاستبعاد ترحيل تلوث الحمض النووي الجيني من الحمض النووي الريبي المنقى أثناء تحضير (كدنا).
    4. اختبر (كدنا) عن طريق تضخيم أي جزء جيني يحتوي على تسلسل داخلي متداخل ، مثل جين cdpk1 كامل الطول ، لاستبعاد تلوث الحمض النووي الجيني. استخدم شرط PCR كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
  4. تحليل تعبير النسخة لطفيلي WT و CDPK1 T145M
    1. استخدم (كدنا) المحضر من طفيليات WT و CDPK1 T145M لإجراء تحليل تعبير النسخ ل 11 جينا مختلفا من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. تشمل الجينات المستهدفة ال 11 7 أعضاء من عائلة CDPK و 4 كينازات متورطة في غزو كرات الدم الحمراء (انظر الجدول 2 للجينات والبادئات المقابلة المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي).
    2. تصميم الاشعال باستخدام برنامج التوليف التمهيدي. تضخيم ما يقرب من 120 نقطة أساس من كل جين محدد باستخدام بادئات خاصة بالجينات ذات درجات حرارة انصهار مماثلة.
    3. تضخيم الجينات المستهدفة باستخدام خلط مسبق وتشغيل اللوحة على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام معلمات التدوير التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق متبوعا ب 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، والتلدين عند 52 درجة مئوية لمدة 20 ثانية والتمديد عند 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    4. تطبيع مستوى التعبير عن كل جين باستخدام جينين للتدبير المنزلي ، نازعة هيدروجين الجلسرالديهايد -3-فوسفات (GAPDH) وثريونين tRNA ligase (ThrRS) 32. احسب التعبير النسبي لكل كيناز مستهدف في طفيلي CDPK1 T145M مقارنة بعنصر التحكم في WT.
    5. قم بإجراء التحليل الإحصائي باستخدام حزمة التحليل الإحصائي R. بدلا من ذلك ، استخدم أي برنامج تحليل آخر.
      ملاحظة: تعد طرق النسخ العالمية مثل RNA-Seq أو microarray طرقا متفوقة للحصول على رؤية أوسع لإعادة توصيل النسخ في الطفيليات الطافرة مقارنة ب WT.

النتائج

يتم التعبير عن WT CDPK1 المؤتلف كبروتين اندماج مع علامة Glutathione S-transferase (GST) ويتم تنقيته باستخدام كروماتوغرافيا تقارب GST. تم الكشف عن بروتين CDPK1 المنقى من خلال اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة ل CDPK1 والأجسام المضادة ل GST (الشكل 1). تم استبدال بقايا حارس الب?...

Discussion

يعتمد توليد طفيلي معدل وراثيا متحور يحتوي على أليل ناقص الشكل من cdpk1 على بيانات نشاط كيناز في المختبر مع الإنزيمات المؤتلفة. من الأفضل توليد أكبر عدد ممكن من البروتينات المؤتلفة الطافرة مع بقايا حارس البوابة المختلفة. نظرا لأن P. falciparum الجينوم غني ب AT ، لذلك...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر الدعم والتسهيلات المتاحة من خلال مرفق الأجهزة المركزي ، كلية علوم الحياة ، JNU. كما يتم الاعتراف بالدعم المالي المقدم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) إلى AB. نشكر خوسيه خوان لوبيز روبيو على توفير بلازميدات pL6eGFP و pUF1. لا تدور وكالة التمويل في إعداد العمل واتخاذ قرار بنشره. حصل MS على زمالة JRF-SRF من مجلس البحث العلمي والصناعي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

References

  1. World Health Organization. . World Malaria Report 2023. , (2023).
  2. Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521 (2021).
  11. Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524 (2017).
  14. Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63 (2017).
  17. Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285 (2015).
  20. More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139 (2008).
  31. Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902 (1992).
  38. Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198 (2016).
  43. Sharma, M., Bansal, A. . CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , (2020).
  44. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  46. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633 (2015).
  47. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved