了解携带植物样激酶亚型等位基因的突变疟疾寄生虫中补偿途径的发展

摘要

化学遗传学涉及用在靶基因座处含有不同侧链的氨基酸取代守门人残基。在这里，我们生成了一个包含 cdpk1 的亚态等位基因的突变寄生虫，并确定了寄生虫在突变背景中采用的补偿途径。

摘要

疟疾寄生虫破坏药物作用的机制之一是通过重新布线其转录组。对于属于多基因家族的靶基因，这种影响更为明显。属于 CDPK 家族的 恶性疟原 虫蛋白激酶对血液阶段发育至关重要。因此，CDPK 被认为是开发抗疟疾化合物的良好靶标。化学遗传学方法历来用于阐明高等真核生物中蛋白激酶的功能。它需要通过基因操作将守门人残基替换为具有不同侧链的另一个氨基酸。守门人位置的氨基酸取代调节蛋白激酶的活性，并改变其对一类称为凸起激酶抑制剂 （BKI） 的特定化合物的敏感性，这些化合物有助于靶基因的功能鉴定。在这里，我们利用化学遗传学方法来了解由携带 cdpk1 亚型等位基因的突变寄生虫进化的补偿机制。总体而言，我们的方法有助于确定可能同时靶向以防止对单个激酶产生耐药性的代偿途径。

引言

疟疾是主要的传染病之一，每年造成数百万人死亡，尤其是 5 岁以下儿童¹。目前尚无临床上可用的疟疾疫苗。此外，已知最致命的人类疟疾寄生虫恶性疟原虫对称为青蒿素的一线药物产生了耐药性 2,3,4,5。迫切需要确定可以快速部署的新药物靶点和新策略，以避免青蒿素耐药性在世界范围内传播。更好地了解药物作用机制和代偿途径的分子基础有助于制定更好的策略来避免耐药性的发展。

属于钙依赖性蛋白激酶 （CDPK） 家族的蛋白激酶在红细胞、性细胞和红细胞前阶段寄生虫发育的许多阶段都至关重要⁶。在 P 的无性复制期间。falciparum，CDPK5 已知在裂殖子从成熟裂殖体的出口中起关键作用⁷。CDPK5 的条件缺失不允许裂殖子释放到血液中，从而导致寄生虫死亡。CDPK5 介导的寄生虫出口的分子机制尚不完全清楚，被认为涉及蛋白激酶 G （PKG） 作为上游调节因子 ^7,8。CDPK7 对于环期寄生虫向滋养体⁹ 的成熟至关重要。CDPK4 是 CDPK 家族的另一个成员，对蚊子的性阶段发育至关重要。它参与鞭打过程中的多个步骤，因此对于形成自由、可活动的雄性配子至关重要 10,11,12,13。CDPK1 磷酸化内膜复合物和 rhoptry^{的成分 14,15}。此外，CDPK1 的条件性缺失导致参与 RBC 侵袭的蛋白质¹⁶ 的低磷酸化。CDPK1 已被证明在侵袭过程中调节顶端细胞器的放电¹⁷。CDPK1 还通过磷酸化 SERA5 蛋白酶¹⁸ 帮助裂殖子从受感染的 RBC 中排出。磷酸化的 CDPK1 优先位于裂殖子的顶端，在那里它可能与侵袭过程所需的其他寄生虫蛋白相互作用^19,20。CDPK1 还参与雄性和雌性配子的形成，这是疟疾传播和蚊子体内寄生虫性发育的关键步骤²¹。

化学遗传学方法历来用于鉴定哺乳动物激酶的功能作用^22,23。该方法利用守门人的残基被不同侧链的氨基酸取代。守门人残基的变化调节了相邻 ATP 口袋的大小，这反过来又改变了与野生型相比，称为凸起激酶抑制剂 （BKI） 的化合物对突变酶的可及性。用较小的残基取代守门人的大块残基可以进入 BKI，而反向取代使激酶对 BKI 具有抗性。在某些情况下，守门人残基的取代与靶酶激酶活性的降低有关，这使得修饰对功能研究不耐受^24,25。守门人替换对酶活性的负面影响可以通过在不耐受激酶的第二个位点产生抑制基因突变来逆转²⁵。已使用化学遗传学方法研究顶复蛋白激酶的功能。含有较小守门人残基的野生型 CDPK4 被凸起的激酶抑制剂 BKI-1 和 1294 选择性抑制，导致雄性配子发生和卵囊发育受阻^11,12。用大体积的蛋氨酸残基取代 CDPK4 中的小看门人残基导致 BKI 介导的鞭打抑制降低¹¹。刚地弓形虫的 CDPK1 是一种与疟疾寄生虫密切相关的顶复门寄生虫，被证明参与速殖子对宿主细胞的运动和侵袭^26,27。利用野生型 TgCDPK1 的较小守门人口袋来设计特异性抑制剂，以减少动物模型中的疾病发病机制^28,29。P 的参与。恶性通过使用特异性药理学抑制剂抑制酶的活性，证明了分裂晚期发育和配子形成中的蛋白激酶 G （PKG）^30,31。用谷氨酰胺 （T618Q） 取代守门人的苏氨酸大大降低了突变酶对抑制剂的敏感性，导致正常的配子发生和裂殖体到环的进展^30,31。

以前的大多数研究都利用化学遗传学方法对靶激酶^{11、12、22、23、26、30、31} 进行功能表征，但是，我们采用这种方法来了解携带蛋白激酶亚型等位基因的寄生虫中代偿机制的发展。我们之前表明，用蛋氨酸 （T145M） 取代 CDPK1 中的野生型守门人残基导致突变酶³² 的转磷酸化电位降低 ~ 47%。含有 cdpk1 亚态等位基因 （cdpk1t145m） 的突变寄生虫通过其他 CDPK 家族成员的转录重新布线预先适应 CDPK1 活性降低。我们相信这种策略通常可用于阐明含有必需蛋白激酶的亚态等位基因的突变寄生虫的补偿机制。部分补偿靶激酶功能的其他激酶可以与靶激酶一起同时被抑制，以防止对单个激酶产生耐药性。这可能是控制疟疾的更好策略。

研究方案

P.恶性疟原虫寄生虫菌株 （NF54） 购自 Alvaro Molina Cruz 21,32,33。用于寄生虫培养的 O⁺ 人红细胞购自印度新德里的 Rotary Blood Centre。质粒 pL6eGFP 和 pUF1 购自 Jose-Juan Lopez-Rubio。DSM267 购自 Margaret A. Phillips 和 Pradipsinh K. Rathod。WR99210由 Jacobus Pharmaceutical Company 提供。

1. 构建用于在大肠杆菌中表达重组 CDPK1 的质粒

1. 设计寡核苷酸引物对以扩增 cdpk1 基因的完整 CDS（PlasmoDB 登录号。PF3D7_0217500） 使用引物分析软件。
   1. 使用具有基因特异性寡核苷酸对的 DNA 聚合酶扩增完整的 CDS: Pk1fpgex 和 Pk1rpgex （见 表 1），使用 恶性疟原 虫制备的 cDNA 作为模板，反应体积为 20 μL。将 PCR 扩增条件设置如下:在 98 °C 下初始变性 2 分钟，（在 98 °C 下变性 30 秒，在 52 °C 下退火 20 秒， 在 62 °C 下延伸 20 秒）x 36，最终在 62°C 下延伸 10 分钟。将 PCR 产物储存在 4 °C 直至进一步使用。
2. 在 37 °C 下用 BamHI （20,000 U/mL） 和 NotI （20,000 U/mL） 限制性核酸内切酶消化 1 μg 扩增的 PCR 产物和 1 μg pGEX4T1 表达质粒 3-4 小时，总反应体积为 30 μL。
3. 要纯化双消化的 PCR 产物和质粒，请使用基于柱的 PCR 纯化试剂盒并按照制造商的说明进行操作。
4. 使用 1 μL T4 DNA 连接酶，以 10 μL 的总反应体积，以 1:5 的载体与插入片段摩尔比连接 100 ng 双消化、纯化的 pGEX4T1 质粒和插入片段。将连接反应在 16 °C 下孵育过夜。
5. 变换 E。 大肠杆菌 按照制造商的方案将 DH5α 感受态细胞与连接混合物放在含有氨苄青霉素 （100 μg/mL） 的 LB 琼脂平板上。
6. 根据制造商的说明，通过使用微型质粒纯化试剂盒纯化质粒，筛选从转化中获得的四个细菌克隆是否存在重组质粒。如上文步骤 1.3 中所述，通过使用 BamHI 和 NotI 的双限制性消化来确认重组质粒。
7. 通过 Sanger DNA 测序进一步验证限制性酶切阳性克隆的序列是否正确。变换 E。 大肠杆菌 BLR（DE3） pLysS 感受态细胞，具有用于 CDPK1 蛋白表达的序列验证质粒构建体。

2. 重组 CDPK1 蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

1. 重组 CDPK1 的表达
   1. 接种 E 的单个克隆。 大肠杆菌 将含有序列验证质粒构建体的 BLR（DE3） pLysS 菌株放入 10 mL 含有氨苄青霉素 （100 μg/mL） 的 LB 培养基中。将培养物在 37 °C 下孵育过夜，并以 200-250 rpm 振荡。
   2. 用 1% 的原代培养物接种次级培养物，并让细菌细胞在 37 °C 下生长至对数中期。 当次级培养物的光密度 （OD） 在 600 nm 处达到 0.7-0.9 时，通过添加 1 mM 异丙基 ß-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导全长重组 CDPK1 的表达，并在 24 °C 下孵育 10-12 小时。
   3. 孵化后，收获 E。 大肠杆菌 细胞以 5,000 x g 离心 10 分钟。倒出上清液并保留细胞沉淀。
   4. 制备具有以下成分的裂解缓冲液:1 mM 二硫苏糖醇 （DTT）、0.1 mg/mL 溶菌酶、1 mM EDTA、1 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和 1x 蛋白酶抑制剂混合物在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
   5. 将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液的 10 倍沉淀重量体积中。以 9 秒开、15 秒关的间隔对细胞悬液超声处理 15 分钟，以防止可能导致蛋白质变性的局部加热。
   6. 将裂解物以 17,000 x g 离心 1 小时，并将透明上清液与谷胱甘肽珠在 4 °C 下孵育过夜。 按照下面提到的方案获得纯化的重组 CDPK1 蛋白。
2. 使用谷胱甘肽微珠进行亲和层析，纯化 GST 标记的 CDPK1
   1. 取 500 μL 完全重悬的谷胱甘肽珠子进行 250 mL 细菌培养，并在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 小心倒出上清液。
   2. 用 5 mL 结合缓冲液（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO_4，pH 7.3）洗涤珠子并倒置混合。
   3. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。重复洗涤和离心 3 次至 4 次。
   4. 将珠子加入细菌细胞裂解物中，并在 4 °C 下孵育 12 小时，同时轻轻摇动 （20-30 rpm）。
   5. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。可以保存上清液以估计保持未结合的重组 CDPK1 的量。
   6. 用含有 1 mM DTT 的 PBS 洗涤 CDPK1 结合的珠子至少 5-6 次，然后用 50 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM DTT（pH 7.5）洗涤。
   7. 先用 250 μL 洗脱缓冲液 1 （EB1） 洗脱结合蛋白 2 次，然后用 250 μL 洗脱缓冲液 2 （EB2） 洗脱 2 次。EB1 和 EB2 的组成分别为 50 mM Tris 中的 10 mM 还原型谷胱甘肽、100 mM NaCl、pH 7.5 和 50 mM Tris 中的 20 mM 还原型谷胱甘肽、100 mM NaCl 和 pH 7.5。
   8. 在室温 （RT） 下，将 CDPK1 结合的微珠在洗脱缓冲液 1 和 2 中孵育 5-10 分钟，轻轻搅拌或端到端旋转。
   9. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后小心地将含有洗脱的 CDPK1 重组蛋白的上清液转移到单独的试管中。
   10. 重复步骤 2.2.8 和 2.2.9 以获得 2 个洗脱液，每个洗脱液都有 EB1 和 EB2。

3. 用于生成重组 CDPK1 守门人突变蛋白的定点诱变

1. 使用含有序列验证的 cdpk1 基因的 pGEX4T1 质粒。我们更喜欢使用用于转化 大肠杆菌 BLR（DE3） pLysS 菌株的相同质粒。
2. 设计引物以在野生型 cdpk1 基因序列中引入守门人突变。野生型守门人残基 （T145） 由 cdpk1 基因中的 ACC 密码子编码。用分别由 AGC 和 ATG 密码子编码的小（丝氨酸，T145S）和大体积（蛋氨酸，T145M）守门残基替换苏氨酸守门人。
3. 按照以下指南设计用于定点诱变的正向和反向引物。
   1. 确保两种引物彼此互补。在突变的两侧保留 15-20 个未修饰序列的核苷酸。确保序列的 Tm 在 50 °C 至 55 °C 之间，不包括突变位点。
4. 使用定点诱变试剂盒生成 cdpk1 的守门人突变构建体。按照制造商的说明引入所需的突变。用于定点诱变的引物列于 表 1 中。
5. 用 0.5 μL DpnI （20,000 U/mL） 酶处理反应混合物，以消化亲本甲基化质粒。将反应混合物在 37 °C 下孵育 3 小时。用 DpnI 处理的反应混合物转化 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。
6. 筛选 T145M 和 T145S 质粒构建体各四个克隆，以验证通过 DNA 测序在 cdpk1 基因序列中引入所需突变。
7. 如步骤 1.5 所述，转化 大肠杆菌 BLR（DE3） pLysS 菌株中序列验证的质粒，以表达重组 CDPK1 T145M/S 蛋白。
8. 按照野生型 CDPK1 蛋白第 2 节中描述的步骤表达和纯化 CDPK1 看门人突变蛋白。

4. CDPK1 的 体外 激酶活性测定

注:重组野生型 CDPK1 和守门人突变蛋白的激酶活性通过 Allen 等人³⁴ 描述的半合成表位标记方法进行评估。

1. 在 50 μL 的总反应混合物中，在含有 50 mM Tris、50 mM MgCl₂、1x 磷酸盐抑制剂混合物和 2 μg 髓鞘碱性蛋白 （MBP） 作为 CDPK1 外源底物的缓冲液中孵育 50 ng 重组蛋白。
2. 根据需要存在或不存在钙的条件，分别加入 CaCl₂ 或 EGTA，使激酶测定缓冲液中的终浓度分别为 2.5 mM。将 ATPγS 添加到缓冲液中，最终浓度为 100 μM，以将其用作可转移末端磷酸基团的来源。
3. 将反应混合物在 30 °C 下在水浴中孵育 1 小时，然后通过加入 5 mM EGTA 终止反应。向反应混合物中加入 5 μl 50 mM 对硝基甲磺酸苄酯 （PNBM），并使其在 20 °C 下在水浴中孵育 2 小时，以使转磷酸化 MBP 和自磷酸化 CDPK1 中的磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基烷基化。
4. 向总共 55 μL 的反应混合物中加入 19 μL 的 4x SDS 样品缓冲液，并在 95 °C 下加热 5 分钟。

5. Western blot 分析，用于检测体外激酶测定的硫代磷酸化产物

1. 准备 12% SDS-PAGE 凝胶并加载 15 μL 每个样品。分离反应混合物以观察自磷酸化的 CDPK1 和转磷酸化的 MBP。
2. 使用湿式转印法将分离的蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶转移到 PVDF 膜上³²。
3. 通过在室温下将 PVDF 膜与含有 0.05% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐水（20 mM Tris-HCL，pH 7.5,150 mM NaCl）中的 5% 脱脂牛奶孵育 1 小时，封闭 PVDF 膜上的非特异性位点。
4. 将 PVDF 膜与针对烷基化硫代磷酸化加合物的兔一抗以 1:2,500 稀释度在 4 °C 下在封闭缓冲液中孵育过夜。
5. 孵育过夜后，用含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水洗涤印迹 3 次，每次 10 分钟。
6. 在 RT 下，将印迹与山羊抗兔二抗在封闭缓冲液中以 1:5,000 稀释度进一步孵育 1 小时，然后用含有 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水洗涤。
7. 根据制造商的说明，通过混合等比例的溶液 A 和溶液 B，用化学发光底物覆盖印迹，并在暗室中曝光在 X 射线胶片上，以获得 CDPK1 自磷酸化和 MBP 转磷酸化的信号。

6. 克隆靶向  cdpk1 位点的向导序列，引入守门人替换

注:通过手动管理选择 20 个核苷酸的引导序列，并采用以下步骤在 BtgZI 位点的 pL6eGFP 质粒中克隆。

1. 使用 BtgZI 酶消化 pL6eGFP
   1. 按照酶制造商的反应条件方案，在 60 °C 下在 20 μL 的反应混合物中消化 1 μg pL6eGFP 质粒³⁵ 和 1 μL BtgZI 酶（5,000 单位/mL）4 小时。
   2. 孵育 4 小时后，在 1% 琼脂糖凝胶上运行消化的质粒，并切除含有消化质粒的凝胶块 （~ 9.8 kb）。根据制造商的说明，使用基于柱的凝胶提取试剂盒纯化消化的质粒。
2. 寡核苷酸退火
   1. 在不含 DNase/RNase 的水中重构寡核苷酸（Ck1GUIDEFWD 和 Ck1GUIDEREV），以制备 100 μM 储备液。
   2. 将 20 μM 每种寡核苷酸混合在含有 10 mM Tris （pH 8.0）、50 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的溶液中。将混合物在 95 °C 的干浴中孵育 5 分钟，并让反应冷却至室温。反应混合物的温度通常需要 1 小时才能达到 RT。
   3. 在 Tris pH 8.0 中将退火的寡核苷酸稀释至 0.5 μM，得到总反应混合物体积为 100 μL。
3. 熔融反应
   1. 将 1.5 μL 稀释的寡核苷酸与 100 ng BtgZI 消化的线性化质粒混合在 5x In-Fusion 酶预混液中，总反应体积为 10 μL，以生成含有 pL6CK1G 质粒的 CDPK1 指南。
   2. 将反应物在 50 °C 下孵育 15 分钟。 将反应物储存在 4 °C 直至继续转化 E。 大肠杆菌。
      注:如需长期储存，反应混合物可储存在 -20 °C 下。
4. E 的变换。大肠杆菌恒星感受态细胞
   1. 向 E 中加入 2.5 μL 反应混合物。 大肠杆菌 Stellar 感受态细胞并按照制造商的方案进行转化过程。
   2. 将转化的感受态细胞接种在 LB 氨苄青霉素 （100 μg/mL） 板上，并让转化的细菌在 37 °C 下生长过夜。
   3. 选择转化的菌落，并使用市售质粒小量制备试剂盒提取质粒。按照制造商的说明进行质粒纯化。通过 Sanger DNA 测序验证向导是否插入质粒中。

7. 克隆同源臂以修复 Cas9 核酸内切酶限制性 cdpk1 位点

注:包含要引入靶基因座的 SNP 的同源臂是商业合成的。我们通常采用长度为 400-1000 bp 的同源臂。同源臂在向导 RNA 区域和 PAM 中包含沉默突变，以防止在掺入所需 SNP 后重新切割修饰的基因座。同源臂（对应于 CDPK1 的核苷酸 133 至 553）包含 Met 或 Ser 守门人突变和沉默突变，两侧是 AflII 和 SpeI 限制性位点。

1. 在 37 °C 下，在 20 μL 的反应混合物中，使用 0.5 μL 的 AflII （20,000 U/ml） 和 SpeI （20,000 U/ml） 限制性内切酶双消化 1 μg pL6CK1G 和含有同源臂的质粒 4 小时。
2. 在 1.5% 琼脂糖凝胶上运行双消化质粒的完全反应，并按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒纯化与 pL6CK1 的同源臂和质粒骨架相对应的条带。
3. 使用 T4 DNA 连接酶，用 100 ng pL6CK1 质粒以 1:5 的载体与插入片段比例连接消化的同源臂，总反应体积为 10 μL。将连接反应物在 16 °C 下孵育过夜。 根据制造商的说明，用完全连接混合物转化 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。
4. 将转化的细胞接种在含有氨苄青霉素 （100 μg/mL） 的 LB 琼脂平板上，以选择阳性转化体。从 LB 氨苄青霉素板中选择单个菌落，并使用质粒提取试剂盒纯化质粒。
5. 通过使用与步骤 7.3 中描述的相同的消化条件，用 AflII 和 SpeI 酶消化纯化的质粒，确认克隆是否存在同源臂。通过 Sanger DNA 测序进一步确认双消化阳性克隆，以验证同源臂的完整序列。

8. 纯化 pL6CK1Met、pL6CK1Ser 和 pUF1 质粒用于疟疾寄生虫转染

1. 在含有氨苄青霉素 （100 μg/mL） 的 LB 培养基中，设置 5 mL 经序列验证的 pL6CK1Met、pL6CK1Ser 和 pUF1 克隆的原代培养物，并孵育 10 小时。以 1:1000 的比例将原代培养物转移到继生培养物中，并再孵育 12 小时。
2. 通过在离心瓶中以 5000 x g 离心 10 分钟来沉淀细菌培养物。
3. 根据制造商的方案，使用质粒纯化试剂盒分离质粒。将质粒 DNA 溶解在不含 DNase/RNase 的水中，用于直接转染寄生虫。

9. 恶性疟原虫和山梨醇的体外培养同步转染

注意:根据 Trager 和 Jensen³⁶ 概述的方法在人红细胞 （RBC） 中进行恶性疟原虫体外培养。

1. 传播 P 的 NF54 菌株。通过在含有补充有 L-谷氨酰胺、25 mM HEPES、25 mM 碳酸氢钠和 50 μg/mL 次黄嘌呤的 RPMI 1640 的完全 RPMI （cRPMI） 培养基中以 2% 的血细胞比容在 O ⁺ 人红细胞中培养恶性肝炎。用 0.5% AlbuMAX II 和 10 μg/mL 庆大霉素补充培养基，并在 5% O₂、5% CO₂ 和 90% N₂ 的气氛中将培养物维持在 37 °C。
2. 为了使山梨醇同步获得环期寄生虫，通过在室温下以 2,300 x g 离心 3 分钟，将异步寄生虫沉淀在 50 mL 锥形管中。弃去上清液。
3. 将寄生红细胞与 9 体积的 5% 山梨糖醇在 37 °C 下孵育 10 分钟。 孵育后，通过以 2,300 x g 离心 3 分钟沉淀红细胞，并弃去山梨醇。
4. 用不完全的 RPMI、iRPMI（不含 albumax 和碳酸氢钠的 RPMI 培养基）洗涤山梨醇处理的寄生虫，然后在 cRPMI 中孵育它们。在下一个周期中使用环期寄生虫进行质粒转染。

10. 用 pL6CK1Met、pL6CK1Ser 和 pUF1 质粒转染环期寄生虫

注:以下步骤用于用质粒 DNA 直接转染环期寄生虫。

1. 通过将溶解在 30 mL 水、240 mM KCl、0.3 mM CaCl₂、4 mM EGTA、10 mM MgCl₂、20 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ 和 50 mM HEPES 中来制备 2x 细胞混合缓冲液³⁷。将 pH 值调节至 7.6。将最终体积调整为 50 mL。过滤器 使用 0.22 μm 注射器过滤器对缓冲液进行灭菌。然后，用无菌水稀释 2x cytomix 缓冲液，以获得 1x cytomix 缓冲液。
2. 在无菌的 15 mL 锥形管中，加入 100 μL 填充的环状寄生红细胞，并用 5 mL 1x 细胞混合缓冲液洗涤 2 次。通过在 RT 下以 994 x g 离心 3 分钟进行洗涤。
3. 洗涤后，除去缓冲液，将 50 μg 每个质粒（pL6CK1Met/pUF1 用于产生 T145M 突变，pL6CK1Ser/pUF1 用于产生 T145S 突变）加入包装的寄生红细胞中。然后，根据质粒的体积加入 2x 缓冲液，并以 1x 缓冲液浓度将体积调节至 400 μL。
4. 每次转染将 400 μL 上述溶液转移至 0.2 cm 比色皿中。使用以下条件进行电穿孔:0.31 kV，950 μF，电阻设置为无限。
5. 电穿孔后，从比色皿中取出转染的寄生虫，与 cRPMI 混合，然后转移到总体积为 15 mL 的 T25 培养瓶中。在步骤 9.1 中提到的条件下将寄生虫孵育 2 小时。
6. 孵育后，将转染的寄生虫转移到 50 mL 锥形管中，并以 994 x g 离心 3 分钟。去除上清液，用 10 mL 不完全 RPMI 洗涤寄生虫。用新鲜的 cRPMI 培养 2 天，24 小时后补充培养基。
7. 48 小时后，从每个烧瓶中取出 cRPMI，并将培养物重悬于含有 2 nM 的 WR99210 和 150 nM DSM267³⁸ 的 cRPMI 中。然后，通过添加 400 μL 新鲜 RBC 将培养物转移到 T75 培养瓶中。每天用含有 WR99210 和 DSM267 的 cRPMI 补充培养基，持续 7 天。随后，每隔一天添加一次含有两种药物的 cRPMI，直至转染后第 14 天。
8. 第 14 天，在 1.5 mL 微量离心管 （MCT） 中分装 200 μL 转染培养物，用于玻片制备。通过在室温下以 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。吸出上清液并将细胞转移到载玻片上。使用另一张载玻片将其以 45° 角放置，使其涂抹。
9. 将载玻片固定在甲醇中，并通过在超纯水中以 1:10 稀释来制备 Giemsa 染色剂。然后，通过将载玻片完全浸入 Giemsa 染色剂中 20 分钟来染色载玻片。在流水下清洗载玻片并彻底干燥。然后，通过浸油在光学显微镜下以 100 倍放大倍率观察载玻片。
10. 一旦观察到寄生虫，每天补充培养基并让它们生长 2-3 天。然后，去除寄生虫以验证目标基因序列中目标基因座的所需修饰。
    注意:如果在第 14 天看不到寄生虫，请在 4 天后补充培养基（包含两种药物）。每 7 天将寄生虫减少 30% 并加入新鲜血液以维持 2% 的血细胞比容，直到寄生虫再次出现。

11. 对 cdpk1 基因座进行所需修饰的转基因寄生虫的 PCR 验证

1. 寄生虫生长 2-3 天后，取出 500 μL 培养物并将其转移到 1.5 mL MCT 中。
2. 通过以 2,400 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。然后，通过皂苷处理裂解红细胞。
   1. 对于皂苷处理，将 10 μL 10% 皂苷溶液添加到 1 mL 重悬的寄生虫沉淀中，并在 4 °C 下保持 5 分钟。将细胞在 4 °C 下以 2,400 x g 离心 5 分钟，并弃去上清液。重复此步骤，直到发红完全消失并获得黑色的寄生虫颗粒。
3. 用 1 mL 的 1x PBS 以 2,400 x g 离心 5 分钟，洗涤寄生虫沉淀。然后，将沉淀重悬于 50 μL 不含 DNase/RNase 的水中。将重悬的寄生虫沉淀在 95 °C 下加热 5 分钟，然后在 4 °C 下以 16,200 x g 离心 10 分钟。 将含有寄生虫 DNA 的上清液转移到新试管中。
4. 利用上述遗传物质对采用引物组 ck1f1 和 ck1r3wt 的全长基因进行 PCR 扩增（参见 表 1），特异性靶向同源臂之外的区域，如上述步骤 1.2 中所述。使用 ck1f1 引物对含有 T145M 突变的同源区域进行测序。

12. 获得克隆转基因寄生虫的有限稀释

1. 序列验证后，稀释转染的寄生虫培养物，使最终浓度达到每 200 μL 1 个寄生虫。然后，将 100 μL 稀释的培养物添加到 96 孔组织培养板的孔中。执行以下步骤 （12.2-12.4） 以达到 1 个寄生虫/200 μL。
2. 准备 10 mL 含 2% 血细胞比容的寄生红细胞。使用上述 Giemsa 染色方法估计培养物的寄生虫血症百分比。然后，使用血细胞计数器计数 1:100 稀释培养物中的 RBC 总数。
   RBC 总数/mL = 平均计数的 RBC 数 x 稀释因子 x 10⁴
   寄生红细胞数量/mL =（寄生虫血症百分比 x 红细胞总数/mL）/100
3. 通过连续稀释初始培养物 2 倍（每个 1:100 稀释），制备 1:10,000 稀释的寄生红细胞。
4. 从稀释的培养物中加入适当体积（以微升为单位），以在 10 mL 培养基中达到总共 50 个寄生虫，确保 2% 的血细胞比容。然后，向 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 含有 50 种寄生虫的培养基。将板放入用混合气体（成分如上文步骤9.1所述）冲洗的密封Secador中，并在37°C下孵育。 每 2 天更换一次介质。
5. 每^{7 天用} 含有 2% 血细胞比容的 cRPMI 替换培养基，直到寄生虫出现。
   1. 将 96 孔板倾斜至 45° 角，让 RBC 稳定下来。使用血清移液管，小心地从每个孔中取出培养基，并观察含有寄生虫的孔的颜色变为黄色，与无寄生虫孔中培养基的粉红色形成鲜明对比。这种颜色变化的发生是因为寄生虫使培养基酸化。
6. 观察颜色变化后，从出现颜色变化的孔中取出少量培养物，并在载玻片上准备涂片，用与孔位置对应的数字标记。用 Giemsa 染色剂对载玻片进行染色，并如上所述在显微镜下观察。
7. 将孔中的内容物转移到 T25 培养瓶中，在显微镜下观察寄生虫。让寄生虫在 T25 培养瓶中生长 4-5 天，并每隔一天补充一次培养基。
8. 一旦寄生虫血症达到 2-3%，提取 500 μL 寄生虫培养物。然后，皂苷裂解 RBC 并使用第 11 节中描述的方法继续提取寄生虫遗传物质。
9. 为了确认克隆转基因寄生虫的产生，如上所述在步骤 1.1.1 中设置 PCR 反应，并将 PCR 产物送去进行 DNA 测序，以确认在目标基因座中引入所需的 SNP。

13. 使用实时 PCR 进行转录本分析

1. Percoll/山梨醇的纯化和寄生虫的同步
   1. 通过在 15 mL 锥形管中依次分层 3 mL（每种 70%），然后加入 40% 的 Percoll/山梨醇溶液，制备 Percoll/山梨醇梯度^39.40。
   2. 在梯度顶部轻轻地分层 1-2 mL 主要含有 WT 和 CDPK1 T145M 裂殖体期寄生虫的寄生虫培养物。
   3. 在室温下，使用设置为4的离心机在摆动桶转子中以2,300 x g 离心梯度15分钟。
   4. 在新鲜的 50 mL 锥形管中从梯度界面收集含有寄生虫滋养体和裂殖体阶段的中间环。
   5. 通过加入等体积的 9:1 （cRPMI:10xPBS） 洗涤寄生虫，然后以 994 x g 离心 3 分钟以沉淀寄生虫。
   6. 用 19:1 的溶液 （cRPMI:10xPBS） 再次洗涤沉淀，然后以 994 x g 离心 3 分钟。
   7. 将每个寄生虫沉淀加入含有 2% 血细胞比容的 cRPMI 的分离瓶中（在 37 °C 下预孵育）。在上述步骤 9.1 中描述的条件下将培养瓶孵育 4 小时，以使裂殖子从富集的裂殖体侵入新鲜的红细胞中。
   8. 4 小时后，如上所述在步骤 9.2-9.4 中用山梨醇处理寄生虫，以获得高度同步的 0 - 4 小时环形寄生虫。
   9. 山梨醇处理后，将同步寄生虫孵育 44 小时，以获得寄生虫的 44 - 48 小时裂殖体阶段。
2. 从 WT 和 CDPK1 T145M 寄生虫的裂殖体中分离 RNA
   1. 在入侵后 44-48 小时收获 WT 和 CDPK1 T145M 寄生虫。在 4 °C 下用 1x PBS 以 994 x g 洗涤寄生虫沉淀 5 分钟。
   2. 将寄生虫沉淀重悬于 1 mL 的 1x PBS 中，并用皂苷处理它们以裂解周围的红细胞，如步骤 11.2.1 中所述。
   3. 将寄生虫沉淀重悬于 1 mL RNA 提取试剂中，并储存在 -80 °C 直至进一步处理。
   4. 在 15-30 °C 下解冻冷冻沉淀，以完全解离核蛋白复合物。
   5. 每 mL RNA 提取试剂加入 200 μL 氯仿，并用手剧烈摇动试管 15 秒。在 RT 孵育 2-3 分钟。
   6. 将混合物在 4 °C 下以 16,200 x g 离心 15 分钟。RNA 将仅保留在无色的上层水层中。根据制造商的说明使用试剂盒分离 RNA。
3. 从 WT 和 CDPK1 T145M 寄生虫的 RNA 合成 cDNA
   1. 按照制造商的说明，用 DNA 去除试剂盒处理含 RNA 的样品，以去除污染的 DNA。
   2. 根据制造商的方案，使用 cDNA 合成试剂盒从分离的 RNA 样品中合成 cDNA。我们使用随机六聚体引物进行逆转录过程，而不是 oligo-dT 引物。
   3. 确保对用于 cDNA 制备的每个 RNA 样品进行 NO-RT（不添加逆转录酶的反应构建）对照，以排除 cDNA 制备过程中纯化 RNA 中残留的基因组 DNA 污染。
   4. 通过扩增任何包含中间内含子序列的基因片段（例如全长 cdpk1 基因）来检测 cDNA，以排除基因组 DNA 污染。使用步骤 1.1.1 中所述的 PCR 条件。
4. WT 和 CDPK1 T145M 寄生虫的转录表达分析
   1. 使用从 WT 和 CDPK1 T145M 寄生虫制备的 cDNA，通过实时 PCR 对 11 个不同基因进行转录表达分析。11 个靶基因包括 CDPK 家族的 7 个成员和 4 个参与 RBC 侵袭的激酶（用于实时 PCR 的基因和相应引物见 表 2 ）。
   2. 使用引物合成软件设计引物。使用具有相似熔解温度的基因特异性引物扩增每个选定基因的大约 120 bp。
   3. 使用预混液扩增靶基因，并使用以下循环参数在实时 PCR 系统上运行板:在 95 °C 下初始变性 3 分钟，然后在 95 °C 下变性 40 个循环 10 秒，在 52 °C 下退火 20 秒，在 62 °C 下延伸 30 秒。
   4. 使用两个看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （GAPDH） 和苏氨酸 tRNA 连接酶 （ThrRS）³² 使每个基因的表达水平标准化。计算与 WT 对照相比，CDPK1 T145M 寄生虫中每种靶激酶的相对表达。
   5. 使用 R 统计分析包执行统计分析。或者，使用任何其他分析软件。
      注意:与 WT 相比，RNA-Seq 或微阵列等全局转录组学方法是获得更广泛地了解突变寄生虫转录组重布线的优越方法。

结果

重组 WT CDPK1 表达为带有 N 端谷胱甘肽 S-转移酶 （GST） 标签的融合蛋白，并使用 GST 亲和层析纯化。使用抗 CDPK1 和抗 GST 抗体通过蛋白质印迹检测纯化的 CDPK1 蛋白（图 1）。使用定点诱变将 WT CDPK1 中的苏氨酸守门残基 （T145） 替换为 Met 和 Ser，分别产生 CDPK1T145M 和 CDPK1T145S 突变重组蛋白（图 2）。进行 体外 激酶测定以?...

讨论

含有 cdpk1 亚型等位基因的突变转基因寄生虫的产生基于重组酶的 体外 激酶活性数据。最好生成尽可能多的具有不同守门人残基的突变重组蛋白。由于 恶性疟 原虫基因组高度富含 AT，因此，重组蛋白在 E 中的表达。 大肠杆菌 可能需要密码子优化。这将有助于全面评估守门人替换对突变酶激酶活性的影响。选择导致转磷酸化电位降低的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570