Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Химическая генетика включает в себя замену остатка привратника аминокислотой, содержащей другую боковую цепь в месте мишени. Здесь мы сгенерировали мутантного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1 , и идентифицировали компенсаторные пути, принятые паразитом на мутантном фоне.

Аннотация

Одним из механизмов ослабления действия лекарств малярийным паразитом является перепрограммирование его транскриптома. Эффект более выражен для генов-мишеней, принадлежащих к семейству мультигенов. Протеинкиназы Plasmodium falciparum , принадлежащие к семейству CDPK, необходимы для развития стадии крови. Таким образом, CDPK считаются хорошими мишенями для разработки противомалярийных соединений. Химико-генетический подход исторически использовался для выяснения функции протеинкиназ у высших эукариот. Для этого требуется замена остатка привратника на другую аминокислоту с другой боковой цепью с помощью генетических манипуляций. Замена аминокислоты в позиции привратника модулирует активность протеинкиназы и изменяет ее восприимчивость к определенному классу соединений, известных как ингибиторы выпуклых киназ (BKI), которые помогают в функциональной идентификации гена-мишени. В данной работе мы использовали подход химической генетики для понимания компенсаторных механизмов, развившихся у мутантного паразита, несущего гипоморфный аллель cdpk1. В целом, наш подход помогает в выявлении компенсаторных путей, которые могут быть одновременно нацелены на предотвращение развития лекарственной устойчивости против отдельных киназ.

Введение

Малярия является одним из ведущих инфекционных заболеваний, от которого ежегодно умирают миллионы людей, особенно среди детейв возрасте до 5 лет. Клинически доступной вакцины против малярии не существует. Кроме того, известно, что Plasmodium falciparum, самый смертоносный малярийный паразит человека, приобрел устойчивость к препарату первой линии под названием артемизинин 2,3,4,5. Существует острая необходимость в определении новых мишеней для лекарств и новых стратегий, кото....

протокол

. Штамм паразита falciparum (NF54) был получен от Alvaro Molina Cruz 21,32,33. Красные кровяные тельца человека O+, используемые для культивирования паразитов, были получены в Центре крови Ротари, Нью-Дели, Индия. Плазмиды, pL6eGFP и pUF1, были получены от Хосе-Хуана Лопеса-Рубио. DSM267 был получен от Маргарет А. Филлипс и Прадипсинха К. Ратхода. WR99210 была предоставлена фармацевтической компанией Jacobus.

1. Конструирование плазмиды для экспрессии рекомбинантного CDPK1 в

Результаты

Рекомбинантный WT CDPK1 экспрессируется в виде гибридного белка с N-концевой меткой глутатион-S-трансферазы (GST) и очищается с помощью аффинной хроматографии GST. Очищенный белок CDPK1 был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против CDPK1 и анти-GST (

Обсуждение

Получение мутантного трансгенного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1, основано на данных об активности киназы in vitro с рекомбинантными ферментами. Лучше получить как можно больше мутантных рекомбинантных белков с различными остатками привратника........

Раскрытие информации

У авторов отсутствует конфликт интересов.

Благодарности

Мы признательны за поддержку и средства, доступные через Центральный центр контрольно-измерительных приборов Школы наук о жизни JNU. Также выражается благодарность за финансовую поддержку AB со стороны Департамента биотехнологии (BT/PR28256/MED/29/1313/2018). Мы благодарим Хосе-Хуана Лопеса-Рубио за предоставление плазмид pL6eGFP и pUF1. Финансирующее агентство не играет никакой роли в подготовке и принятии решения о публикации работы. MS является получателем стипендии JRF-SRF от Совета по научным и промышленным исследованиям.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

Ссылки

  1. World Health Organization. . World Malaria Report 2023. , (2023).
  2. Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены