Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Химическая генетика включает в себя замену остатка привратника аминокислотой, содержащей другую боковую цепь в месте мишени. Здесь мы сгенерировали мутантного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1 , и идентифицировали компенсаторные пути, принятые паразитом на мутантном фоне.
Одним из механизмов ослабления действия лекарств малярийным паразитом является перепрограммирование его транскриптома. Эффект более выражен для генов-мишеней, принадлежащих к семейству мультигенов. Протеинкиназы Plasmodium falciparum , принадлежащие к семейству CDPK, необходимы для развития стадии крови. Таким образом, CDPK считаются хорошими мишенями для разработки противомалярийных соединений. Химико-генетический подход исторически использовался для выяснения функции протеинкиназ у высших эукариот. Для этого требуется замена остатка привратника на другую аминокислоту с другой боковой цепью с помощью генетических манипуляций. Замена аминокислоты в позиции привратника модулирует активность протеинкиназы и изменяет ее восприимчивость к определенному классу соединений, известных как ингибиторы выпуклых киназ (BKI), которые помогают в функциональной идентификации гена-мишени. В данной работе мы использовали подход химической генетики для понимания компенсаторных механизмов, развившихся у мутантного паразита, несущего гипоморфный аллель cdpk1. В целом, наш подход помогает в выявлении компенсаторных путей, которые могут быть одновременно нацелены на предотвращение развития лекарственной устойчивости против отдельных киназ.
Малярия является одним из ведущих инфекционных заболеваний, от которого ежегодно умирают миллионы людей, особенно среди детейв возрасте до 5 лет. Клинически доступной вакцины против малярии не существует. Кроме того, известно, что Plasmodium falciparum, самый смертоносный малярийный паразит человека, приобрел устойчивость к препарату первой линии под названием артемизинин 2,3,4,5. Существует острая необходимость в определении новых мишеней для лекарств и новых стратегий, кото....
. Штамм паразита falciparum (NF54) был получен от Alvaro Molina Cruz 21,32,33. Красные кровяные тельца человека O+, используемые для культивирования паразитов, были получены в Центре крови Ротари, Нью-Дели, Индия. Плазмиды, pL6eGFP и pUF1, были получены от Хосе-Хуана Лопеса-Рубио. DSM267 был получен от Маргарет А. Филлипс и Прадипсинха К. Ратхода. WR99210 была предоставлена фармацевтической компанией Jacobus.
1. Конструирование плазмиды для экспрессии рекомбинантного CDPK1 в
Рекомбинантный WT CDPK1 экспрессируется в виде гибридного белка с N-концевой меткой глутатион-S-трансферазы (GST) и очищается с помощью аффинной хроматографии GST. Очищенный белок CDPK1 был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против CDPK1 и анти-GST (
Получение мутантного трансгенного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1, основано на данных об активности киназы in vitro с рекомбинантными ферментами. Лучше получить как можно больше мутантных рекомбинантных белков с различными остатками привратника........
У авторов отсутствует конфликт интересов.
Мы признательны за поддержку и средства, доступные через Центральный центр контрольно-измерительных приборов Школы наук о жизни JNU. Также выражается благодарность за финансовую поддержку AB со стороны Департамента биотехнологии (BT/PR28256/MED/29/1313/2018). Мы благодарим Хосе-Хуана Лопеса-Рубио за предоставление плазмид pL6eGFP и pUF1. Финансирующее агентство не играет никакой роли в подготовке и принятии решения о публикации работы. MS является получателем стипендии JRF-SRF от Совета по научным и промышленным исследованиям.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x phosphate inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 04906 845001 | |
AflII | NEB | R0520S | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | |
Anti-GST antibody | ThermoFisher Scientific | G7781 | |
Anti-Mouse HRP | Sigma-Aldrich | A4416 | |
Anti-Rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
BamHI | NEB | R3136S | |
BtgZ1 | NEB | R0703S | |
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Sorvall legend micro 17R | |
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell) | ThermoFisher Scientific | Sorvall ST 8R | |
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite) | ThermoFisher Scientific | Sorvall ST 8R (TX-400 rotor) | |
DpnI | NEB | RO1765 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells | Sigma-Aldrich | 69956 | |
E. coli DH5a Competent Cells | Takara Bio | 9057 | |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | BioRad | 1652086 | |
Electroporator | BioRad | GenePulser Xcell | |
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent | G-Bioscience | 7860-003 | |
Gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750078 | |
Giemsa Stain | Himedia | S011-100ML | |
Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17075601 | |
HEPES, Free Acid | Merck | 391338 | |
Hypoxanthine | Merck | 4010CBC | |
In-fusion HD cloning Kit | Takara Bio | 1711641A | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708880EDU | |
MBP, dephosphorylated | Merck | 13-110 | |
NotI | NEB | R3189S | |
Nucleobond Xtra Maxi EF | Takara Bio | 740424 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit | Takara Bio | 740609 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM) | Abcam | Ab138910 | |
Primestar Max DNA Polymerase | Takara Bio | R045A | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Qiaprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200521 | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-105 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
SpeI-HF | NEB | R3133S | |
SuperScript III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080-051 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
Thiophosphate ester antibody | Abcam | Ab92570 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены