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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Materialien
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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Zusammenfassung

Einer der Mechanismen, um die Wirkung von Medikamenten durch den Malariaparasiten zu untergraben, ist die Neuverdrahtung seines Transkriptoms. Der Effekt ist bei Zielgenen, die zur Multigenfamilie gehören, ausgeprägter. Plasmodium falciparum Proteinkinasen aus der CDPK-Familie sind essentiell für die Entwicklung des Blutstadiums. Daher gelten CDPKs als gute Ziele für die Entwicklung von Anti-Malaria-Wirkstoffen. Der Ansatz der chemischen Genetik wurde in der Vergangenheit verwendet, um die Funktion von Proteinkinasen in höheren Eukaryoten aufzuklären. Es erfordert die Substitution von Gatekeeper-Resten durch eine andere Aminosäure mit einer anderen Seitenkette durch genetische Manipulation. Die Aminosäuresubstitution an der Gatekeeper-Position moduliert die Aktivität einer Proteinkinase und verändert ihre Anfälligkeit für eine bestimmte Klasse von Verbindungen, die als Bumped-Kinase-Inhibitoren (BKIs) bekannt sind und bei der funktionellen Identifizierung des Zielgens helfen. Hier haben wir den Ansatz der chemischen Genetik genutzt, um die Kompensationsmechanismen zu verstehen, die von einem mutierten Parasiten entwickelt werden, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 beherbergt. Insgesamt hilft unser Ansatz bei der Identifizierung von Kompensationswegen, die gleichzeitig angesteuert werden können, um die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen gegen einzelne Kinasen zu verhindern.

Einleitung

Malaria ist eine der führenden Infektionskrankheiten, die jedes Jahr für Millionen von Todesfällen verantwortlich ist, insbesondere bei Kindern unter 5 Jahren1. Es gibt keinen klinisch verfügbaren Impfstoff gegen Malaria. Darüber hinaus ist bekannt, dass Plasmodium falciparum, der tödlichste menschliche Malariaparasit, eine Resistenz gegen das Frontmedikament Artemisininentwickelt hat 2,3,4,5. Es besteht ein dringender Bedarf, neue Angriffspunkte für Medikamente und neuartige Strategien zu identifizieren, die schnell eingesetzt werden können, um die Ausbreitung von Artemisinin-Resistenzen weltweit zu verhindern. Ein besseres Verständnis des Wirkmechanismus und der molekularen Grundlagen der Kompensationswege kann dazu beitragen, bessere Strategien zur Vermeidung der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen zu entwickeln.

Proteinkinasen, die zur Familie der Calciumabhängigen Proteinkinasen (CDPKs) gehören, sind in vielen Stadien der Parasitenentwicklung während der erythrozytären, sexuellen und präerythrozytären Stadien von entscheidender Bedeutung6. Während der asexuellen Replikation von P. Es ist bekannt, dass CDPK5 eine entscheidende Rolle beim Austritt von Merozoiten aus reifen Schizonten spielt7. Die bedingte Deletion von CDPK5 erlaubt es Schizonten nicht, Merozoiten in den Blutkreislauf freizusetzen, was zum Tod des Parasiten führt. Der molekulare Mechanismus des CDPK5-vermittelten Parasitenaustritts ist nicht vollständig verstanden und es wird angenommen, dass die Proteinkinase G (PKG) als vorgeschalteter Regulator beteiligt ist 7,8. CDPK7 ist essentiell für die Reifung von Parasiten im Ringstadium zu Trophozoiten9. CDPK4 ist ein weiteres Mitglied der CDPK-Familie, das für die Entwicklung des sexuellen Stadiums bei Mücken entscheidend ist. Es ist an mehreren Schritten während des Exflagellationsprozesses beteiligt und daher entscheidend für die Bildung freier, beweglicher, männlicher Gameten 10,11,12,13. CDPK1-Phosphorylatkomponenten des inneren Membrankomplexes und der Rhhoperie14,15. Darüber hinaus führt die bedingte Deletion von CDPK1 zu einer Hypophosphorylierung von Proteinen, die an der Invasion von RBC16 beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass CDPK1 die Entladung apikaler Organellen während des Invasionsprozesses reguliert17. CDPK1 hilft auch beim Austritt von Merozoiten aus infizierten Erythrozyten, indem es die SERA5-Protease18 phosphoryliert. Phosphoryliertes CDPK1 ist bevorzugt am apikalen Ende des Merozoiits lokalisiert, wo es mit anderen Parasitenproteinen interagieren kann, die für den Invasionsprozess benötigt werden19,20. CDPK1 ist auch an der Bildung männlicher und weiblicher Gameten beteiligt, was ein entscheidender Schritt für die Übertragung von Malaria und die sexuelle Entwicklung des Parasiten in den Mücken ist21.

Der Ansatz der chemischen Genetik wurde in der Vergangenheit zur Identifizierung der funktionellen Rollen von Säugetierkinasen verwendet 22,23. Der Ansatz nutzt die Substitution eines Rests an der Gatekeeper-Position durch eine Aminosäure einer anderen Seitenkette. Die Änderung des Gatekeeper-Rests moduliert die Größe einer angrenzenden ATP-Tasche, was wiederum die Zugänglichkeit chemischer Verbindungen, die als Bumped-Kinase-Inhibitoren (BKIs) bezeichnet werden, gegenüber dem mutierten Enzym im Vergleich zum Wildtyp verändert. Die Substitution eines sperrigen Rests an der Gatekeeper-Position durch einen kleineren Rest ermöglicht den Zugang zu BKIs, während die umgekehrte Substitution die Kinase resistent gegen BKIs macht. In einigen Fällen ist die Substitution von Gatekeeper-Resten mit einer Abnahme der Kinaseaktivität des Zielenzyms verbunden, so dass die Modifikation für funktionelle Studien intolerant ist 24,25. Der negative Effekt der Gatekeeper-Substitution auf die Enzymaktivität kann durch die Erzeugung einer Suppressormutation an einer zweiten Stelle in der intoleranten Kinase25 umgekehrt werden. Ein chemisch-genetischer Ansatz wurde verwendet, um die Funktion von Apicomplexan-Proteinkinasen zu untersuchen. Das Wildtyp-CDPK4, das einen kleineren Gatekeeper-Rest enthielt, wurde selektiv durch die gestoßenen Kinase-Inhibitoren BKI-1 und 1294 gehemmt, was zu einer Blockade der männlichen Gametogenese und der Oozystenentwicklung führte11,12. Die Substitution eines kleinen Gatekeeper-Rests in CDPK4 durch einen sperrigen Methioninrest führte zu einer Abnahme der BKI-vermittelten Hemmung in der Exflagellation11. Es wurde gezeigt, dass CDPK1 von Toxoplasma gondii, einem Apicomplexan-Parasiten, der eng mit dem Malariaparasiten verwandt ist, an der Motilität und Invasion von Wirtszellen durch Tachyzoiten beteiligt ist26,27. Eine kleinere Gatekeeper-Tasche des Wildtyps TgCDPK1 wurde ausgenutzt, um spezifische Inhibitoren zu entwickeln, die die Krankheitspathogenese in Tiermodellen verringerten28,29. Beteiligung von P. Falciparum Die Proteinkinase G (PKG) in der späten schizogonischen Entwicklung und Gametenbildung wurde durch Hemmung der Aktivität des Enzyms mit spezifischen pharmakologischen Inhibitoren nachgewiesen30,31. Die Substitution von Threonin an der Gatekeeper-Position mit Glutamin (T618Q) verringerte die Sensitivität des mutierten Enzyms gegenüber den Inhibitoren erheblich, was zu einer normalen Gametogenese und einer Progression von Schizont zu Ring führte30,31.

Die meisten der bisherigen Studien haben einen chemisch-genetischen Ansatz für die funktionelle Charakterisierung der Zielkinasen 11,12,22,23,26,30,31 verwendet, jedoch haben wir diesen Ansatz gewählt, um die Entwicklung von Kompensationsmechanismen in Parasiten zu verstehen, die ein hypomorphes Allel einer Proteinkinase beherbergen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Substitution von Wildtyp-Gatekeeper-Resten in CDPK1 durch Methionin (T145M) zu einer Verringerung des Transphosphorylierungspotenzials des mutierten Enzyms32 um ~ 47% führt. Ein mutierter Parasit, der das hypomorphe Allel von cdpk1 (cdpk1t145m) enthält, ist durch transkriptionelle Neuverdrahtung anderer Mitglieder der CDPK-Familie für die verminderte Aktivität von CDPK1 präadaptiert. Wir glauben, dass diese Strategie allgemein verwendet werden kann, um die Kompensationsmechanismen in mutierten Parasiten aufzuklären, die hypomorphe Allele essentieller Proteinkinasen enthalten. Andere Kinasen, die die Funktion der Zielkinase teilweise kompensieren, können gleichzeitig zusammen mit der Zielkinase gehemmt werden, um die Entwicklung einer Arzneimittelresistenz gegen einzelne Kinasen zu verhindern. Dies könnte als bessere Strategie zur Malariakontrolle dienen.

Protokoll

Die P. falciparum Parasitenstamm (NF54) wurde aus Alvaro Molina Cruzgewonnen 21,32,33. O+ menschliche rote Blutkörperchen, die für die Parasitenkultur verwendet wurden, wurden vom Rotary Blood Centre in Neu-Delhi, Indien, gewonnen. Die Plasmide, pL6eGFP und pUF1, wurden von Jose-Juan Lopez-Rubio gewonnen. DSM267 wurde von Margaret A. Phillips und Pradipsinh K. Rathod bezogen. WR99210 wurde von der Jacobus Pharmaceutical Company zur Verfügung gestellt.

1. Aufbau eines Plasmids zur Expression von rekombinantem CDPK1 in Escherichia coli

  1. Design des Oligonukleotid-Primerpaares zur Amplifikation des vollständigen CDS des cdpk1-Gens (PlasmoDB-Zugangsnr. PF3D7_0217500) Verwendung von Primer-Analysesoftware.
    1. Amplifizieren Sie das vollständige CDS mit DNA-Polymerase mit genspezifischem Oligonukleotidpaar: Pk1fpgex und Pk1rpgex (siehe Tabelle 1) unter Verwendung von cDNA, die aus Plasmodium falciparum als Template in einem Reaktionsvolumen von 20 μl hergestellt wurde. Stellen Sie die PCR-Amplifikationsbedingungen wie folgt ein: Anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 2 min, (Denaturierung bei 98 °C für 30 s, Annealing bei 52 °C für 20 s, Ausdehnung bei 62 °C für 20 s) x 36, Endausdehnung bei 62 °C für 10 min. Lagern Sie das PCR-Produkt bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
  2. 1 μg des amplifizierten PCR-Produkts und 1 μg des pGEX4T1-Expressionsplasmids mit BamHI (20.000 U/ml) und NotI (20.000 U/ml) Restriktionsendonukleasen für 3-4 h bei 37 °C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 30 μl verdauen.
  3. Um das doppelt verdaute PCR-Produkt und das Plasmid aufzureinigen, verwenden Sie ein säulenbasiertes PCR-Clean-up-Kit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
  4. Ligate 100 ng doppelt verdautes, gereinigtes pGEX4T1-Plasmid mit einem Insert in einem molaren Vektor-zu-Insert-Verhältnis von 1:5 unter Verwendung von 1 μl T4-DNA-Ligase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl. Die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 °C inkubieren.
  5. Transformieren Sie E. Coli DH5α-kompetente Zellen mit der ligierten Mischung gemäß dem Protokoll des Herstellers und Platte auf LB-Agar-Platten, die Ampicillin (100 μg/ml) enthalten.
  6. Vier aus der Transformation gewonnene bakterielle Klone werden auf das Vorhandensein des rekombinanten Plasmids untersucht, indem das Plasmid mit einem Mini-Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt wird. Das rekombinante Plasmid wird durch doppelten Restriktionsverdau mit BamHI und NotI bestätigt, wie oben in Schritt 1.3 beschrieben.
  7. Weitere Verifizierung der Restriktionsverdau-positiven Klone für die korrekte Sequenz durch Sanger-DNA-Sequenzierung. Transformieren Sie E. Coli BLR(DE3) pLysS-kompetente Zellen mit dem sequenzverifizierten Plasmidkonstrukt für die CDPK1-Proteinexpression.

2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten CDPK1-Proteins in E. coli

  1. Expression von rekombinantem CDPK1
    1. Beimpfe einen einzelnen Klon von E. Coli BLR(DE3) pLysS-Stamm, der das sequenzverifizierte Plasmidkonstrukt enthält, in 10 mL LB-Medium, das Ampicillin (100 μg/ml) enthält. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200-250 U/min.
    2. Beimpfen Sie die Sekundärkultur mit 1 % der Primärkultur und lassen Sie die Bakterienzellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bei 37 °C wachsen. Wenn die optische Dichte (OD) der Sekundärkultur bei 600 nm 0,7-0,9 erreicht, induzieren Sie die Expression des rekombinanten CDPK1 in voller Länge durch Zugabe von 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und inkubieren Sie für 10-12 h bei 24 °C.
    3. Nach der Inkubation ernten Sie das E. Coli-Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und halten Sie das Zellpellet zurück.
    4. Bereiten Sie den Lysepuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und einem 1x Proteasehemmer-Cocktail in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    5. Resuspendieren Sie das Zellpellet im 10-fachen des Pelletgewichtsvolumens des Lysepuffers. Die Zellsuspension wird 15 Minuten lang in Intervallen von 9 s an und 15 s aus beschallt, um eine lokale Erwärmung zu verhindern, die zu einer Denaturierung des Proteins führen kann.
    6. Das Lysat wird 1 h lang bei 17.000 x g zentrifugiert und der klare Überstand über Nacht bei 4 °C mit Glutathionkügelchen inkubiert. Befolgen Sie das unten erwähnte Protokoll, um gereinigtes rekombinantes CDPK1-Protein zu erhalten.
  2. Affinitätschromatographie mit Glutathionkügelchen zur Aufreinigung von GST-markiertem CDPK1
    1. Nehmen Sie 500 μl vollständig resuspendierte Glutathionkügelchen für 250 mL Bakterienkultur und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig dekantieren.
    2. Waschen Sie die Kügelchen mit 5 mL Bindungspuffer (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) und drehen Sie sie zum Mischen um.
    3. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren für 3x-4x.
    4. Geben Sie die Kügelchen in das Bakterienzelllysat und inkubieren Sie sie 12 h bei 4 °C unter leichtem Schütteln (20-30 U/min).
    5. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Der Überstand kann gespeichert werden, um die Menge an rekombinantem CDPK1 zu schätzen, die ungebunden bleibt.
    6. Waschen Sie die CDPK1-gebundenen Kügelchen mindestens 5-6 Mal mit PBS mit 1 mM DTT, gefolgt von einer Wäsche mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5.
    7. Eluieren Sie das gebundene Protein 2x, zuerst mit 250 μL Elutionspuffer 1 (EB1), gefolgt von 2x mit 250 μl Elutionspuffer 2 (EB2). Die Zusammensetzung von EB1 und EB2 beträgt 10 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5 und 20 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris, 100 mM NaCl bzw. pH 7,5.
    8. Inkubieren Sie die CDPK1-gebundenen Kügelchen in den Elutionspuffern 1 und 2 bei Raumtemperatur (RT) für 5-10 Minuten unter leichtem Rühren oder End-over-End-Rotation.
    9. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit dem eluierten rekombinanten Protein CDPK1 vorsichtig in ein separates Röhrchen überführen.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.8 und 2.2.9, um jeweils 2 Eluen mit EB1 und EB2 zu erhalten.

3. Ortsgerichtete Mutagenese zur Erzeugung rekombinanter CDPK1-Gatekeeper-mutierter Proteine

  1. Verwenden Sie das pGEX4T1-Plasmid, das ein sequenzverifiziertes cdpk1-Gen enthält. Wir bevorzugen es, das gleiche Plasmid zu verwenden, das für die Transformation des E. coli BLR(DE3) pLysS-Stammes verwendet wurde.
  2. Entwerfen Sie die Primer so, dass sie eine Gatekeeper-Mutation in die Wildtyp-cdpk1-Gensequenz einführen. Der Wildtyp-Gatekeeper-Rest (T145) wird durch ein ACC-Codon im cdpk1-Gen kodiert. Ersetzen Sie den Threonin-Gatekeeper durch kleine (Serin, T145S) und sperrige (Methionin, T145M) Gatekeeper-Reste, die von AGC- bzw. ATG-Codons kodiert werden.
  3. Befolgen Sie die unten aufgeführten Richtlinien, um die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die ortsgerichtete Mutagenese zu entwerfen.
    1. Stellen Sie sicher, dass beide Grundierungen zueinander komplementär sind. Behalten Sie 15-20 Nukleotide mit unveränderter Sequenz auf beiden Seiten der Mutation. Stellen Sie sicher, dass Tm für die Sequenz zwischen 50 °C und 55 °C liegt, ohne die mutierte Stelle.
  4. Verwenden Sie das Site-Directed Mutagenese Kit, um die Gatekeeper-Mutantenkonstrukte von cdpk1 zu generieren. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die gewünschte Mutation einzuführen. Die für die ortsgerichtete Mutagenese verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  5. Behandeln Sie das Reaktionsgemisch mit 0,5 μl DpnI (20.000 U/ml) Enzym, um das parentale, methylierte Plasmid zu verdauen. Das Reaktionsgemisch wird 3 h lang bei 37 °C inkubiert. E . coli DH5α-kompetente Zellen werden mit dem DpnI-behandelten Reaktionsgemisch transformiert.
  6. Screenen von jeweils vier Klonen von T145M- und T145S-Plasmidkonstrukten, um die Einführung der gewünschten Mutation in der cdpk1-Gensequenz durch DNA-Sequenzierung zu überprüfen.
  7. Transformieren Sie die sequenzverifizierten Plasmide im E. coli BLR(DE3) pLysS-Stamm für die Expression der rekombinanten CDPK1 T145M/S-Proteine, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
  8. Exprimieren und reinigen Sie die CDPK1-Gatekeeper-mutierten Proteine gemäß den in Abschnitt 2 für das Wildtyp-CDPK1-Protein beschriebenen Schritten.

4. In-vitro-Kinase-Aktivitätsassay von CDPK1

HINWEIS: Die Kinaseaktivität von rekombinantem Wildtyp-CDPK1 und den Gatekeeper-mutierten Proteinen wird durch einen semisynthetischen Epitop-Tagging-Ansatz bewertet, wie von Allen et al.34 beschrieben.

  1. 50 ng rekombinantes Protein werden in dem Puffer inkubiert, der 50 mM Tris, 50 mM MgCl2, 1x Phosphatinhibitor-Cocktail mit 2 μg Myelin-Basisprotein (MBP) als exogenes Substrat von CDPK1 in der Gesamtreaktionsmischung von 50 μL enthält.
  2. Abhängig von den Bedingungen, die das Vorhandensein oder Fehlen von Kalzium erfordern, fügen Sie CaCl2 bzw. EGTA hinzu, um die Endkonzentration von jeweils 2,5 mM im Kinase-Assay-Puffer zu erreichen. Geben Sie ATPγS bis zu einer Endkonzentration von 100 μM in den Puffer, um ihn als Quelle für die übertragbare terminale Phosphatgruppe zu verwenden.
  3. Das Reaktionsgemisch wird 1 h lang bei 30 °C in einem Wasserbad inkubiert, gefolgt von der Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 5 mM EGTA. 5 μl 50 mM p-Nitrobenzylmesylat (PNBM) in das Reaktionsgemisch geben und bei 20 ΰC im Wasserbad 2 h zur Alkylierung der phosphorylierten Serin- und Threoninreste in der Transphosphorylierung MBP und autophosphoryliertem CDPK1 inkubieren lassen.
  4. Zu den insgesamt 55 μl Reaktionsgemisch werden 19 μl 4x SDS-Probenpuffer hinzugefügt und 5 min lang auf 95 °C erhitzt.

5. Western-Blot-Analyse zum Nachweis der thiophosphorylierten Produkte des In-vitro-Kinase-Assays

  1. Bereiten Sie 12 % SDS-PAGE-Gel vor und laden Sie 15 μl jeder Probe. Trennen Sie das Reaktionsgemisch, um autophosphoryliertes CDPK1 und transphosphoryliertes MBP sichtbar zu machen.
  2. Die abgetrennten Proteine aus dem SDS-PAGE-Gel werden unter Verwendung des Nasstransferverfahrens32 auf eine PVDF-Membran übertragen.
  3. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen auf der PVDF-Membran, indem Sie sie mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) mit 0,05 % Tween 20 für 1 h bei RT inkubieren.
  4. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem Kaninchen-Primärantikörper gegen alkylierte thiophosphorylierte Addukte in einer Verdünnung von 1:2.500 über Nacht bei 4 °C im Blockierungspuffer.
  5. Nach der Inkubation über Nacht den Blot 3x mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 für jeweils 10 min waschen.
  6. Inkubieren Sie den Blot weiter mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in Blockpuffer bei einer Verdünnung von 1:5.000 für 1 h bei RT, gefolgt von einem Waschen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween 20.
  7. Überlagern Sie den Blot mit chemilumineszierendem Substrat, indem Sie einen gleichen Anteil von Lösung A und Lösung B gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen und in einem dunklen Raum auf Röntgenfilm belichten, um Signale der CDPK1-Autophosphorylierung und der MBP-Transphosphorylierung zu erhalten.

6. Klonierung der Guide-Sequenz für das Targeting des  cdpk1-Locus zur Einführung der Gatekeeper-Substitution

HINWEIS: Die Leitsequenz von 20 Nukleotiden wurde durch manuelle Kuration ausgewählt und in einem pL6eGFP-Plasmid an der BtgZI-Stelle kloniert, indem die folgenden Schritte durchgeführt wurden.

  1. Verdau von pL6eGFP mit dem BtgZI-Enzym
    1. 1 μg pL6eGFP-Plasmid35 mit 1 μl BtgZI-Enzym (5.000 Einheiten/ml) für 4 h bei 60 °C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl verdauen, gemäß dem Protokoll des Enzymherstellers für Reaktionsbedingungen.
    2. Nach der 4-stündigen Inkubationszeit wird das verdaute Plasmid auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und das Gelstück (~ 9,8 kb), das das verdaute Plasmid enthält, herausgeschnitten. Reinigen Sie das verdaute Plasmid mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Glühen von Oligos
    1. Rekonstituieren Sie die Oligonukleotide (Ck1GUIDEFWD und Ck1GUIDEREV) in DNase/RNase-freiem Wasser, um eine 100 μM-Stammlösung herzustellen.
    2. Kombinieren Sie 20 μM jedes Oligonukleotids in einer Lösung, die 10 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl und 1 mM EDTA enthält. Die Mischung wird bei 95 °C in einem trockenen Bad 5 Minuten lang inkubiert und die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. In der Regel dauert es 1 h, bis die Temperatur des Reaktionsgemisches RT erreicht.
    3. Verdünnen Sie die geglühten Oligonukleotide auf 0,5 μM in Tris pH 8,0, was zu einem Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches von 100 μl führt.
  3. In-Fusions-Reaktion
    1. Kombinieren Sie 1,5 μl verdünnte Oligonukleotide mit 100 ng BtgZI-verdautem linearisiertem Plasmid in einer 5x In-Fusion-Enzymvormischung in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl, um einen CDPK1-Leitfaden zu erzeugen, der das pL6CK1G-Plasmid enthält.
    2. Die Reaktion wird 15 Minuten lang bei 50 °C inkubiert. Die Reaktion wird bei 4 °C gelagert, bis mit der Umwandlung von E fortgefahren wird. coli.
      HINWEIS: Für die Langzeitlagerung kann das Reaktionsgemisch bei -20 °C gelagert werden.
  4. Verwandlung von E. Coli Stellare kompetente Zellen
    1. Geben Sie 2,5 μl des Reaktionsgemisches zum E. Coli Stellar kompetente Zellen und fahren Sie mit dem Transformationsprozess gemäß dem Protokoll des Herstellers fort.
    2. Plattieren Sie die transformierten kompetenten Zellen auf LB-Ampicillin-Platte (100 μg/ml) und lassen Sie die transformierten Bakterien über Nacht bei 37 °C wachsen.
    3. Wählen Sie die transformierten Kolonien aus und extrahieren Sie das Plasmid mit einem kommerziell erhältlichen Plasmid-Miniprep-Kit. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Plasmidaufreinigung. Validieren Sie die Insertion des Guides in das Plasmid durch Sanger-DNA-Sequenzierung.

7. Klonierung eines Homologiearms zur Reparatur des Cas9-Endonuklease-restriktiven cdpk1-Locus

HINWEIS: Ein Homologiearm, der die SNPs umfasst, die in den Ziellocus eingeführt werden sollen, wird kommerziell synthetisiert. Normalerweise nehmen wir einen Homologiearm von 400-1000 bp Länge. Der Homologiearm enthält stille Mutationen in der Guide-RNA-Region und PAM, um das erneute Schneiden des modifizierten Locus nach dem Einbau der gewünschten SNPs zu verhindern. Der Homologiearm (entsprechend den Nukleotiden 133 bis 553 von CDPK1), der Met- oder Ser-Gatekeeper-Mutationen und stille Mutationen enthält, wird von AflII- und SpeI-Restriktionsstellen flankiert.

  1. 1 μg pL6CK1G und das Plasmid, das den Homologiearm enthält, werden unter Verwendung von jeweils 0,5 μl Restriktionsenzymen AflII (20.000 U/ml) und SpeI (20.000 U/ml) für 4 h bei 37 °C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl doppelt verdaut.
  2. Führen Sie die vollständige Reaktion von doppelt verdauten Plasmiden auf 1,5 % Agarosegel durch und reinigen Sie die Banden, die dem Homologiearm und dem Plasmidrückgrat von pL6CK1 entsprechen, mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Ligatieren Sie den verdauten Homologiearm mit 100 ng pL6CK1-Plasmid in einem Vektor-zu-Insert-Verhältnis von 1:5 in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μL unter Verwendung von T4-DNA-Ligase. Die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 °C inkubieren. Transformieren Sie E. coli DH5α-kompetente Zellen mit der vollständigen Ligationsmischung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 μg/ml) plattiert, um positive Transformanten auszuwählen. Wählen Sie einzelne Kolonien aus der LB-Ampicillinplatte aus und reinigen Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Extraktionskit.
  5. Bestätigen Sie den Klon auf das Vorhandensein des Homologiearms, indem Sie das gereinigte Plasmid mit AflII- und SpeI-Enzymen unter Verwendung der gleichen Verdauungsbedingung wie in Schritt 7.3 beschrieben verdauen. Bestätigen Sie die positiven Klone mit doppeltem Verdau weiter durch Sanger-DNA-Sequenzierung, um die vollständige Sequenz des Homologiearms zu validieren.

8. Aufreinigung von pL6CK1Met-, pL6CK1Ser- und pUF1-Plasmiden für die Transfektion von Malariaparasiten

  1. 5 ml Primärkulturen mit sequenzverifizierten Klonen von pL6CK1Met, pL6CK1Ser und pUF1 in LB-Medien mit Ampicillin (100 μg/ml) setzen und 10 Stunden lang inkubieren. Übertragen Sie die Primärkultur in die Sekundärkultur im Verhältnis 1:1000 und inkubieren Sie weitere 12 Stunden.
  2. Die Bakterienkultur wird durch Zentrifugation bei 5000 x g für 10 min in einer Zentrifugenflasche pelletiert.
  3. Isolieren Sie die Plasmide mit einem Plasmidaufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Löse die Plasmid-DNA in DNase/RNase-freiem Wasser auf, um den Parasiten direkt zu transfizieren.

9. In-vitro-Kultivierung von Plasmodium falciparum und Sorbit-Synchronisation für die Transfektion

HINWEIS: Die In-vitro-Kultur von P. falciparum in menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs) wird nach der von Trager und Jensen beschriebenen Methode durchgeführt36.

  1. Vermehren Sie den NF54-Stamm von P. Falciparum durch Kultivierung in O+ humanen Erythrozyten mit einem Hämatokrit von 2 % in vollständigem RPMI (cRPMI) Medium, das RPMI 1640 enthält, ergänzt mit L-Glutamin, 25 mM HEPES, 25 mM Natriumbicarbonat und 50 μg/ml Hypoxanthin. Ergänzen Sie das Medium mit 0,5 % AlbuMAX II und 10 μg/ml Gentamicin und halten Sie die Kultur bei 37 °C unter einer Atmosphäre von 5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2.
  2. Für die Sorbit-Synchronisation zur Gewinnung von Ringstadien-Parasiten werden die asynchronen Parasiten in einem konischen 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 3 min bei RT pelletiert. Der Überstand wird verworfen.
  3. Inkubieren Sie die parasitierten Erythrozyten mit 9 Volumina von 5 % Sorbit für 10 min bei 37 °C. Nach der Inkubation werden die Erythrozyten durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 3 Minuten pelletiert und das Sorbit verworfen.
  4. Waschen Sie die mit Sorbit behandelten Parasiten mit unvollständigem RPMI, iRPMI (RPMI-Medien ohne Albumax und Natriumbicarbonat) und inkubieren Sie sie anschließend in cRPMI. Verwenden Sie die Parasiten im Ringstadium im nächsten Zyklus für die Plasmidtransfektion.

10. Transfektion eines Ringstadienparasiten mit pL6CK1Met-, pL6CK1Ser- und pUF1-Plasmiden

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die direkte Transfektion von Parasiten im Ringstadium mit Plasmid-DNA angewendet.

  1. Bereiten Sie 2x Cytomix-Puffer37 vor, indem Sie in 30 mL Wasser, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 und 50 mM HEPES auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 50 ml ein. Filter: Sterilisieren Sie den Puffer mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Verdünnen Sie dann den 2x Cytomix-Puffer mit sterilem Wasser, um einen 1x Cytomix-Puffer zu erhalten.
  2. In ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen geben Sie 100 μl gepackte ringgestrige parasitierte Erythrozyten und waschen Sie sie 2x mit 5 mL 1x Cytomix-Puffer. Führen Sie die Wäschen durch Zentrifugieren bei 994 x g für 3 min bei RT durch.
  3. Entfernen Sie nach dem Waschen den Puffer und fügen Sie 50 μg jedes Plasmids (pL6CK1Met/pUF1 zur Erzeugung der T145M-Mutation und pL6CK1Ser/pUF1 zur Erzeugung der T145S-Mutation) in die gepackten parasitierten Erythrozyten hinzu. Fügen Sie dann 2x Puffer entsprechend dem Volumen des Plasmids hinzu und stellen Sie das Volumen auf 400 μl mit 1x Pufferkonzentration ein.
  4. Für jede Transfektion werden 400 μl der obigen Lösung in 0,2 cm Küvetten überführt. Elektroporate unter den folgenden Bedingungen: 0,31 kV, 950 μF und Widerstand auf unendlich eingestellt.
  5. Entfernen Sie nach der Elektroporation die transfizierten Parasiten aus der Küvette, mischen Sie sie mit cRPMI und überführen Sie sie in einen T25-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 15 ml. Inkubieren Sie die Parasiten 2 Stunden lang unter den in Schritt 9.1 genannten Bedingungen.
  6. Nach der Inkubation werden die transfizierten Parasiten in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 3 Minuten lang bei 994 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Parasiten mit 10 ml unvollständigem RPMI. Kulturieren Sie sie 2 Tage lang mit frischem cRPMI und füllen Sie das Nährmedium nach 24 Stunden wieder auf.
  7. Nach 48 Stunden wird das cRPMI aus jedem Kolben entfernt und die Kultur in cRPMI, das 2 nM WR99210 und 150 nM DSM26738 enthält, wieder suspendiert. Übertragen Sie dann die Kultur in einen T75-Kolben, indem Sie 400 μl frische Erythrozyten hinzufügen. Füllen Sie das Medium täglich mit cRPMI auf, das WR99210 und DSM267 für 7 Tage enthält. Fügen Sie anschließend jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag nach der Transfektion cRPMI hinzu, das beide Arzneimittel enthält.
  8. Aliquotieren Sie an Tag 14 200 μl der transfizierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (MCT) für die Vorbereitung des Objektträgers. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei RT pelletiert. Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden auf den Objektträger übertragen. Machen Sie einen Abstrich mit einer anderen Folie, indem Sie sie in einem Winkel von 45° platzieren.
  9. Fixieren Sie den Objektträger in Methanol und bereiten Sie die Giemsa-Beize vor, indem Sie sie 1:10 in Reinstwasser verdünnen. Dann färben Sie den Objektträger, indem Sie ihn 20 Minuten lang vollständig in den Giemsa-Fleck eintauchen. Waschen Sie die Rutsche unter fließendem Wasser und trocknen Sie sie gründlich ab. Betrachten Sie dann den Objektträger unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung, indem Sie Immersionsöl auftragen.
  10. Sobald die Parasiten sichtbar sind, füllen Sie das Medium täglich auf und lassen Sie sie 2-3 Tage lang wachsen. Entfernen Sie dann die Parasiten, um die gewünschte Modifikation in der Zielgensequenz am Zielort zu überprüfen.
    HINWEIS: Wenn die Parasiten an Tag 14 nicht sichtbar sind, füllen Sie das Medium (das beide Arzneimittel enthält) nach 4 Tagen auf. Reduzieren Sie den Parasiten um 30 % und fügen Sie alle 7 Tage frisches Blut hinzu, um 2 % Hämatokrit zu erhalten, bis die Parasiten wieder auftreten.

11. PCR-Nachweis eines transgenen Parasiten mit gewünschter Modifikation des cdpk1-Locus

  1. Nach 2-3 Tagen Parasitenwachstum nehmen Sie 500 μl Kultur heraus und überführen Sie sie in ein 1,5 ml MCT.
  2. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 x g für 5 min. Lysieren Sie dann die Erythrozyten durch Saponinbehandlung.
    1. Für die Saponinbehandlung 10 μl 10%ige Saponinlösung zu 1 ml resuspendiertem Parasitenpellet geben und 5 Minuten lang bei 4 °C halten. Die Zellen werden bei 2.400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Rötung vollständig verschwunden ist und ein schwarzes Parasitenkügelchen erhalten wird.
  3. Waschen Sie das Parasitenpellet mit 1 mL 1x PBS durch Zentrifugation bei 2.400 x g für 5 min. Anschließend wird das Pellet in 50 μl DNase/RNase-freiem Wasser resuspendiert. Das resuspendierte Parasitenpellet 5 min lang auf 95 °C erhitzen, anschließend 10 min bei 4 °C auf 16.200 x g zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand mit der Parasiten-DNA in ein frisches Röhrchen.
  4. Verwenden Sie das oben genannte genetische Material zur PCR-Amplifikation des Gens in voller Länge unter Verwendung der Primersätze ck1f1 und ck1r3wt (siehe Tabelle 1), wobei spezifisch auf die Region außerhalb des Homologiearms abzielt, wie oben in Schritt 1.2 beschrieben. Sequenzieren Sie die Homologieregion, die die T145M-Mutation enthält, mit dem ck1f1-Primer .

12. Begrenzung der Verdünnung zur Gewinnung klonaler transgener Parasiten

  1. Nach der Sequenzverifizierung verdünnen Sie die transfizierte Parasitenkultur, um eine Endkonzentration von 1 Parasiten pro 200 μl zu erreichen. Geben Sie dann 100 μl der verdünnten Kultur in die Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Führen Sie die folgenden Schritte (12.2-12.4) durch, um 1 Parasit/200 μl zu erreichen.
  2. Bereiten Sie 10 ml parasitierte Erythrozyten mit 2 % Hämatokrit vor. Schätzen Sie den prozentualen Anteil der Parasitämie der Kultur unter Verwendung der oben beschriebenen Giemsa-Färbemethode. Zählen Sie dann die Gesamtzahl der Erythrozyten in einer verdünnten Kultur im Maßstab 1:100 mit einem Hämozytometer.
    Gesamtzahl der Erythrozyten/ml = Durchschnittliche Anzahl der gezählten Erythrozyten x Verdünnungsfaktor x 104
    Anzahl der parasitierten Erythrozyten/ml = (Prozent der Parasitämie x Gesamtzahl der Erythrozyten/ml)/100
  3. Bereiten Sie eine Verdünnung von parasitierten Erythrozyten im Verhältnis 1:10.000 vor, indem Sie die Anfangskultur 2x seriell verdünnen (jeweils 1:100 Verdünnung).
  4. Fügen Sie ein geeignetes Volumen (in Mikrolitern) aus der verdünnten Kultur hinzu, um insgesamt 50 Parasiten in 10 ml Medium zu erhalten, wobei ein Hämatokrit von 2 % gewährleistet ist. Geben Sie dann 100 μl des Mediums mit 50 Parasiten in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Die Platte wird in einen luftdichten, mit Mischgas gespülten Behälter (Zusammensetzung wie oben in Schritt 9.1 beschrieben) gestellt und bei 37 °C inkubiert. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus.
  5. Ersetzen Sie das Medium jeden 7. Tag durch cRPMI mit 2 % Hämatokrit, bis die Parasiten auftreten.
    1. Kippen Sie die 96-Well-Platte in einem Winkel von 45° und lassen Sie die RBCs absetzen. Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung und beobachten Sie eine Farbänderung zu Gelb in Vertiefungen, die Parasiten enthalten, im Kontrast zur rosa Farbe der Medien in parasitenfreien Vertiefungen. Diese Farbveränderung tritt auf, weil die Parasiten das Medium ansäuern.
  6. Nachdem Sie die Farbveränderung beobachtet haben, entnehmen Sie eine kleine Menge Kultur aus der Vertiefung, die eine Farbänderung aufweist, und bereiten Sie einen Abstrich auf einem Objektträger vor, den Sie mit einer Zahl beschriften, die der Position der Vertiefung entspricht. Färben Sie den Objektträger mit Giemsa-Beize und betrachten Sie ihn wie oben beschrieben unter dem Mikroskop.
  7. Der Inhalt der Vertiefung wird in einen T25-Kolben überführt, in dem Parasiten unter dem Mikroskop beobachtet wurden. Lassen Sie die Parasiten 4-5 Tage lang im T25-Kolben wachsen und füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf.
  8. Sobald die Parasitämie 2-3% erreicht, extrahieren Sie 500 μl Parasitenkultur. Anschließend wird die Erythrozyten saponinlysiert und das genetische Material der Parasiten nach der in Abschnitt 11 beschriebenen Methode extrahiert.
  9. Um die Erzeugung klonaler transgener Parasiten zu bestätigen, richten Sie eine PCR-Reaktion ein, wie oben in Schritt 1.1.1 beschrieben, und senden Sie das PCR-Produkt zur DNA-Sequenzierung, um die Einführung der gewünschten SNPs in den Ziellocus zu bestätigen.

13. Transkriptanalyse mittels Real-Time PCR

  1. Percoll/Sorbitol-Reinigung und Synchronisation der Parasiten
    1. Bereiten Sie einen Percoll/Sorbitol-Gradienten39,40 her, indem Sie nacheinander 3 ml à 70%ige gefolgt von 40%igen Percoll/Sorbitol-Lösungen in ein konisches 15-ml-Röhrchen schichten.
    2. Schichten Sie vorsichtig 1-2 ml Parasitenkultur, die überwiegend den Parasiten WT und CDPK1 T145M im Schizontenstadium enthält, auf den Gradienten.
    3. Zentrifugieren Sie den Gradienten bei 2.300 x g für 15 min bei RT mit der auf 4 eingestellten Debeschleunigung in der Zentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor.
    4. Den mittleren Ring mit den Trophozoiten- und Schizontenstadien des Parasiten von der Grenzfläche des Gradienten wird in einem frischen konischen 50-ml-Röhrchen gesammelt.
    5. Waschen Sie die Parasiten, indem Sie ein gleiches Volumen von 9:1 (cRPMI:10xPBS) hinzufügen, und zentrifugieren Sie dann 3 Minuten lang bei 994 x g , um die Parasiten zu pelletieren.
    6. Waschen Sie das Pellet erneut mit einer Lösung von 19:1 (cRPMI:10xPBS) und zentrifugieren Sie es dann bei 994 x g für 3 min.
    7. Jedes Parasitenpellet wird in separate Kolben gegeben, die cRPMI mit 2 % Hämatokrit enthalten (vorinkubiert bei 37 °C). Die Kolben werden 4 Stunden lang unter den in Schritt 9.1 beschriebenen Bedingungen inkubiert, um die Invasion von Merozoiten aus den angereicherten Schizonten in frische Erythrozyten zu ermöglichen.
    8. Behandeln Sie die Parasiten nach 4 h mit Sorbitol, wie oben in den Schritten 9.2-9.4 beschrieben, um hochsynchronisierte Parasiten im Ringstadium von 0 - 4 h zu erhalten.
    9. Inkubieren Sie die synchronisierten Parasiten für 44 Stunden nach der Sorbitbehandlung, um das 44 - 48 Stunden lange Schizontenstadium des Parasiten zu erhalten.
  2. RNA-Isolierung aus Schizonten sowohl von WT- als auch von CDPK1 T145M-Parasiten
    1. Ernten Sie die WT- und CDPK1 T145M-Parasiten 44-48 Stunden nach der Invasion. Waschen Sie die Parasitenpellets mit 1x PBS bei 994 x g für 5 min bei 4 °C.
    2. Resuspendieren Sie die Parasitenpellets in 1 ml 1x PBS und behandeln Sie sie mit Saponin, um die umgebenden Erythrozyten zu lysieren, wie in Schritt 11.2.1 beschrieben.
    3. Das Parasitenpellet in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz resuspendieren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C lagern.
    4. Tauen Sie das gefrorene Pellet bei 15-30 °C auf, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu erreichen.
    5. Fügen Sie 200 μl Chloroform pro mL RNA-Extraktionsreagenz hinzu und schütteln Sie die Röhrchen 15 s lang kräftig von Hand. Inkubieren Sie 2-3 Minuten bei RT.
    6. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 16.200 x g für 15 min bei 4 °C. Die RNA verbleibt ausschließlich in der farblosen oberen wässrigen Schicht. Isolieren Sie RNA mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. cDNA-Synthese aus der RNA des Parasiten WT und CDPK1 T145M
    1. Behandeln Sie die RNA-haltigen Proben mit einem DNA-Entfernungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um kontaminierende DNA zu entfernen.
    2. Synthetisieren Sie cDNA aus den isolierten RNA-Proben mit einem cDNA-Synthesekit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wir verwenden zufällige Hexamer-Primer für den reversen Transkriptionsprozess anstelle von Oligo-dT-Primern.
    3. Stellen Sie sicher, dass NO-RT-Kontrollen (Reaktionen, die ohne Zugabe des Reverse-Transkriptase-Enzyms durchgeführt werden) für jede RNA-Probe, die für die cDNA-Präparation verwendet wird, ausgeschlossen werden, um die Übertragung von genomischer DNA-Kontamination aus gereinigter RNA während der cDNA-Präparation auszuschließen.
    4. Testen Sie die cDNA, indem Sie ein beliebiges Gensegment amplifizieren, das eine intervenierende intronische Sequenz enthält, wie z. B. das cdpk1-Gen in voller Länge, um eine Kontamination der genomischen DNA auszuschließen. Verwenden Sie die PCR-Bedingung wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
  4. Transkriptexpressionsanalyse von WT- und CDPK1 T145M-Parasiten
    1. Verwenden Sie die cDNA, die aus den Parasiten WT und CDPK1 T145M hergestellt wurde, um eine Transkriptexpressionsanalyse von 11 verschiedenen Genen durch Echtzeit-PCR durchzuführen. Zu den 11 Zielgenen gehören 7 Mitglieder der CDPK-Familie und 4 Kinasen, die an der Invasion von Erythrozyten beteiligt sind (siehe Tabelle 2 für Gene und entsprechende Primer, die für die real-time PCR verwendet werden).
    2. Entwerfen Sie Primer mit Primer-Synthese-Software. Amplifizieren Sie etwa 120 bp jedes ausgewählten Gens mit genspezifischen Primern mit ähnlichen Schmelztemperaturen.
    3. Amplifizieren Sie die Zielgene mit einem Pre-Mix und lassen Sie die Platte auf einem Real-Time-PCR-System unter Verwendung der folgenden Zyklusparameter laufen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 10 s, Annealing bei 52 °C für 20 s und Verlängerung bei 62 °C für 30 s.
    4. Normalisieren Sie das Expressionsniveau jedes Gens mit zwei Housekeeping-Genen, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Threonin tRNA-Ligase (ThrRS)32. Berechnen Sie die relative Expression jeder Zielkinase im CDPK1 T145M-Parasiten im Vergleich zur WT-Kontrolle.
    5. Führen Sie die statistische Analyse mit dem R-Paket für die statistische Analyse durch. Alternativ können Sie eine andere Analysesoftware verwenden.
      HINWEIS: Globale Transkriptomik-Methoden wie RNA-Seq oder Microarray sind im Vergleich zu WT überlegene Ansätze, um einen breiteren Überblick über die Transkriptom-Neuverdrahtung bei mutierten Parasiten zu erhalten.

Ergebnisse

Rekombinantes WT CDPK1 wird als Fusionsprotein mit einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag exprimiert und mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Das gereinigte CDPK1-Protein wurde durch Western Blot unter Verwendung von Anti-CDPK1- und Anti-GST-Antikörpern nachgewiesen (Abbildung 1). Der Threonin-Gatekeeper-Rest (T145) in WT CDPK1 wurde durch Met und Ser ersetzt, wobei eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurde, um CDPK1T145M...

Diskussion

Die Generierung eines mutierten transgenen Parasiten, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, basiert auf den in vitro Kinase-Aktivitätsdaten mit rekombinanten Enzymen. Es ist besser, so viele mutierte rekombinante Proteine mit unterschiedlichen Gatekeeper-Resten wie möglich zu erzeugen. Da das Genom von P. falciparum sehr AT-reich ist, ist die Expression rekombinanter Proteine in E möglich. Coli kann eine Codon-Optimierung erfordern....

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken für die Unterstützung und die Einrichtungen, die durch die Central Instrumentation Facility, School of Life Sciences, JNU, zur Verfügung stehen. Die finanzielle Unterstützung von AB durch das Department of Biotechnology (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) wird ebenfalls dankbar gewürdigt. Wir danken Jose-Juan Lopez-Rubio für die Bereitstellung von pL6eGFP und pUF1 Plasmiden. Der Fördergeber spielt keine Rolle bei der Vorbereitung und Entscheidung über die Veröffentlichung der Arbeit. MS ist Stipendiatin des JRF-SRF-Stipendiums des Rates für wissenschaftliche und industrielle Forschung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

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