Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Zusammenfassung

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Zusammenfassung

Einer der Mechanismen, um die Wirkung von Medikamenten durch den Malariaparasiten zu untergraben, ist die Neuverdrahtung seines Transkriptoms. Der Effekt ist bei Zielgenen, die zur Multigenfamilie gehören, ausgeprägter. Plasmodium falciparum Proteinkinasen aus der CDPK-Familie sind essentiell für die Entwicklung des Blutstadiums. Daher gelten CDPKs als gute Ziele für die Entwicklung von Anti-Malaria-Wirkstoffen. Der Ansatz der chemischen Genetik wurde in der Vergangenheit verwendet, um die Funktion von Proteinkinasen in höheren Eukaryoten aufzuklären. Es erfordert die Substitution von Gatekeeper-Resten durch eine andere Aminosäure mit einer anderen Seitenkette durch genetische Manipulation. Die Aminosäuresubstitution an der Gatekeeper-Position moduliert die Aktivität einer Proteinkinase und verändert ihre Anfälligkeit für eine bestimmte Klasse von Verbindungen, die als Bumped-Kinase-Inhibitoren (BKIs) bekannt sind und bei der funktionellen Identifizierung des Zielgens helfen. Hier haben wir den Ansatz der chemischen Genetik genutzt, um die Kompensationsmechanismen zu verstehen, die von einem mutierten Parasiten entwickelt werden, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 beherbergt. Insgesamt hilft unser Ansatz bei der Identifizierung von Kompensationswegen, die gleichzeitig angesteuert werden können, um die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen gegen einzelne Kinasen zu verhindern.

Einleitung

Malaria ist eine der führenden Infektionskrankheiten, die jedes Jahr für Millionen von Todesfällen verantwortlich ist, insbesondere bei Kindern unter 5 Jahren¹. Es gibt keinen klinisch verfügbaren Impfstoff gegen Malaria. Darüber hinaus ist bekannt, dass Plasmodium falciparum, der tödlichste menschliche Malariaparasit, eine Resistenz gegen das Frontmedikament Artemisinin^{entwickelt hat 2,3,4,5}. Es besteht ein dringender Bedarf, neue Angriffspunkte für Medikamente und neuartige....

Protokoll

Die P. falciparum Parasitenstamm (NF54) wurde aus Alvaro Molina Cruz^gewonnen 21,32,33. O⁺ menschliche rote Blutkörperchen, die für die Parasitenkultur verwendet wurden, wurden vom Rotary Blood Centre in Neu-Delhi, Indien, gewonnen. Die Plasmide, pL6eGFP und pUF1, wurden von Jose-Juan Lopez-Rubio gewonnen. DSM267 wurde von Margaret A. Phillips und Pradipsinh K. Rathod bezogen. WR99210 wurde von der Jacobus Pharmaceutical Company zur Verfügung gestellt.

1. Aufbau eines Plasmids zur ....

Diskussion

Die Generierung eines mutierten transgenen Parasiten, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, basiert auf den in vitro Kinase-Aktivitätsdaten mit rekombinanten Enzymen. Es ist besser, so viele mutierte rekombinante Proteine mit unterschiedlichen Gatekeeper-Resten wie möglich zu erzeugen. Da das Genom von P. falciparum sehr AT-reich ist, ist die Expression rekombinanter Proteine in E möglich. Coli kann eine Codon-Optimierung erfordern........

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570