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Résumé

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Résumé

L’un des mécanismes permettant de subvertir l’effet des médicaments par le parasite du paludisme est le recâblage de son transcriptome. L’effet est plus prononcé pour les gènes cibles appartenant à la famille multigénique. Les protéines kinases de Plasmodium falciparum appartenant à la famille des CDPK sont essentielles au développement du stade sanguin. En tant que tels, les CDPK sont considérés comme de bonnes cibles pour le développement de composés antipaludiques. L’approche de la génétique chimique a été historiquement utilisée pour élucider la fonction des protéines kinases chez les eucaryotes supérieurs. Il nécessite la substitution du résidu gardien par un autre acide aminé avec une chaîne latérale différente par manipulation génétique. La substitution d’acides aminés à la position de gardien module l’activité d’une protéine kinase et modifie sa susceptibilité à une classe spécifique de composés connus sous le nom d’inhibiteurs de kinases bosselées (BKI) qui aident à l’identification fonctionnelle du gène cible. Ici, nous avons exploité l’approche de la génétique chimique pour comprendre les mécanismes compensatoires évolués par un parasite mutant hébergeant un allèle hypomorphe de cdpk1. Dans l’ensemble, notre approche permet d’identifier des voies compensatoires qui peuvent être ciblées simultanément pour prévenir le développement d’une résistance aux médicaments contre les kinases individuelles.

Introduction

Le paludisme est l’une des principales maladies infectieuses responsables de millions de décès chaque année, en particulier chez les enfants de moins de 5 ans1. Il n’existe pas de vaccin contre le paludisme disponible en clinique. De plus, Plasmodium falciparum, le parasite humain du paludisme le plus mortel, est connu pour avoir acquis une résistance contre le médicament de première ligne appelé artémisinine 2,3,4,5. Il est urgent d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses et de nouvelles stratégies qui peuvent être rapidement déployées pour éviter la propagation de la résistance à l’artémisinine dans le monde entier. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action des médicaments et de la base moléculaire des voies compensatoires peut aider à concevoir de meilleures stratégies pour éviter le développement d’une résistance aux médicaments.

Les protéines kinases appartenant à la famille des protéines kinases dépendantes du calcium (CDPK) sont cruciales à de nombreux stades du développement du parasite aux stades érythrocytaire, sexuel et pré-érythrocytaire6. Au cours de la réplication asexuée de P. falciparum, CDPK5 est connu pour jouer un rôle essentiel dans la sortie des mérozoïtes des schizontes matures7. La délétion conditionnelle de CDPK5 ne permet pas aux schizontes de libérer des mérozoïtes dans la circulation sanguine, entraînant la mort du parasite. Le mécanisme moléculaire de l’évacuation du parasite médiée par CDPK5 n’est pas complètement compris et on pense qu’il implique la protéine kinase G (PKG) en tant que régulateur en amont 7,8. CDPK7 est essentiel à la maturation des parasites au stade annulaire jusqu’au trophozoïte9. CDPK4 est un autre membre de la famille CDPK qui est essentiel au développement du stade sexuel chez les moustiques. Il est impliqué dans plusieurs étapes du processus d’exflagellation et est donc essentiel à la formation de gamètes mâles libres et mobiles 10,11,12,13. Composants phosphorylés CDPK1 du complexe de membrane interne et de la rométrie14,15. De plus, la délétion conditionnelle de CDPK1 entraîne une hypo-phosphorylation des protéines impliquées dans l’invasion des GR16. Il a été démontré que CDPK1 régule la décharge des organites apicaux pendant le processus d’invasion17. CDPK1 aide également à l’évacuation des mérozoïtes des globules rouges infectés en phosphorylant la protéase18 de SERA5. CDPK1 phosphorylé est préférentiellement localisé à l’extrémité apicale du mérozoïte, où il peut interagir avec d’autres protéines parasitaires nécessaires au processus d’invasion19,20. CDPK1 est également impliqué dans la formation des gamètes mâles et femelles, ce qui constitue une étape critique pour la transmission du paludisme et le développement sexuel du parasite chez les moustiques21.

L’approche de la génétique chimique a été historiquement utilisée pour l’identification des rôles fonctionnels des kinases de mammifères22,23. L’approche utilise la substitution d’un résidu en position de gardien par un acide aminé d’une chaîne latérale différente. Le changement de résidu gardien module la taille d’une poche ATP adjacente qui, à son tour, modifie l’accessibilité des composés chimiques appelés inhibiteurs de kinases à bosse (BKI) envers l’enzyme mutante par rapport au type sauvage. La substitution d’un résidu volumineux à la position de gardien par un résidu plus petit permet d’accéder aux BKI, tandis que la substitution inverse rend la kinase résistante aux BKI. Dans certains cas, la substitution du résidu gardien est associée à une diminution de l’activité kinase de l’enzyme cible, ce qui rend la modification intolérante pour les études fonctionnelles24,25. L’effet négatif de la substitution de gardien sur l’activité enzymatique peut être inversé en générant une mutation suppressive à un deuxième site dans la kinase25 intolérante. Une approche de génétique chimique a été utilisée pour étudier la fonction des protéines kinases apicomplexes. Le CDPK4 de type sauvage contenant un résidu de gardien plus petit a été inhibé sélectivement par les inhibiteurs de kinases BKI-1 et 1294, conduisant à un blocage de la gamétogenèse mâle et du développement des oocystes11,12. La substitution d’un petit résidu gardien chez CDPK4 par un résidu volumineux de méthionine a entraîné une diminution de l’inhibition médiée par BKI dans l’exflagellation11. Il a été démontré que CDPK1 de Toxoplasma gondii, un parasite apicomplexe étroitement apparenté au parasite du paludisme, est impliqué dans la motilité et l’invasion des cellules hôtes par les tachyzoïtes26,27. Une plus petite poche de gardien de la TgCDPK1 de type sauvage a été exploitée pour concevoir des inhibiteurs spécifiques qui ont diminué la pathogenèse de la maladie dans des modèles animaux28,29. Implication de P. Falciparum La protéine kinase G (PKG) dans le développement schizogonique tardif et la formation des gamètes a été démontrée en inhibant l’activité de l’enzyme à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques spécifiques30,31. La substitution de la thréonine en position de gardien par de la glutamine (T618Q) a considérablement diminué la sensibilité de l’enzyme mutante aux inhibiteurs, entraînant une gamétogenèse normale et une progression du schizonte à l’anneau30,31.

La plupart des études précédentes ont utilisé une approche de génétique chimique pour la caractérisation fonctionnelle des kinases cibles 11,12,22,23,26,30,31 cependant, nous avons adopté cette approche pour comprendre le développement de mécanismes compensatoires chez les parasites qui hébergent un allèle hypomorphe d’une protéine kinase. Nous avons précédemment montré que la substitution du résidu gardien de type sauvage dans CDPK1 par de la méthionine (T145M) entraîne une diminution de ~ 47% du potentiel de transphosphorylation de l’enzyme mutante32. Un parasite mutant contenant l’allèle hypomorphe de cdpk1 (cdpk1t145m) est pré-adapté pour l’activité réduite de CDPK1 par recâblage transcriptionnel d’autres membres de la famille CDPK. Nous pensons que cette stratégie peut être utilisée en général pour élucider les mécanismes compensatoires chez les parasites mutants contenant des allèles hypomorphes de protéines kinases essentielles. D’autres kinases qui compensent partiellement la fonction de la kinase cible peuvent être inhibées simultanément avec la kinase cible pour empêcher le développement d’une résistance aux médicaments contre les kinases individuelles. Cela pourrait servir de meilleure stratégie pour la lutte contre le paludisme.

Protocole

Le P. La souche de parasite falciparum (NF54) a été obtenue à partir d’Alvaro Molina Cruz 21,32,33. Les globules rouges humains O+ utilisés pour la culture du parasite ont été obtenus au Rotary Blood Centre, à New Delhi, en Inde. Les plasmides, pL6eGFP et pUF1, ont été obtenus auprès de Jose-Juan Lopez-Rubio. Le DSM267 a été obtenu auprès de Margaret A. Phillips et Pradipsinh K. Rathod. WR99210 a été fourni par Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Construction d’un plasmide pour l’expression de CDPK1 recombinant chez Escherichia coli

  1. Concevoir la paire d’amorces oligonucléotidiques pour amplifier le CDS complet du gène cdpk1 (PlasmoDB accession no. PF3D7_0217500) à l’aide d’un logiciel d’analyse d’amorces.
    1. Amplifier le CDS complet à l’aide de l’ADN polymérase avec une paire d’oligonucléotides spécifique au gène : Pk1fpgex et Pk1rpgex (voir Tableau 1) en utilisant de l’ADNc préparé à partir de Plasmodium falciparum comme matrice dans un volume de réaction de 20 μL. Définir les conditions d’amplification de la PCR comme suit : Dénaturation initiale à 98 °C pendant 2 min, (Dénaturation à 98 °C pendant 30 s, Recuit à 52 °C pendant 20 s, Extension à 62 °C pendant 20 s) x 36, Extension finale à 62 °C pendant 10 min. Conservez le produit PCR à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
  2. Digérer 1 μg du produit de PCR amplifié et 1 μg du plasmide d’expression pGEX4T1 avec les endonucléases de restriction BamHI (20 000 U/mL) et NotI (20 000 U/mL) pendant 3 à 4 h à 37 °C dans un volume de réaction total de 30 μL.
  3. Pour purifier le produit de PCR à double digestion et le plasmide, utilisez une trousse de nettoyage par PCR sur colonne et suivez les instructions du fabricant.
  4. Liguer 100 ng de plasmide pGEX4T1 purifié et doublement digéré avec un insert à un rapport molaire vecteur-insert de 1:5 en utilisant 1 μL d’ADN ligase T4 dans un volume de réaction total de 10 μL. Incuber la réaction de ligature à 16 °C pendant la nuit.
  5. Transformer E. Coli Cellules compétentes DH5α avec le mélange ligaturé suivant le protocole du fabricant et plaque sur plaques de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL).
  6. Criblage de quatre clones bactériens issus de la transformation pour détecter la présence du plasmide recombinant en purifiant le plasmide à l’aide d’un mini kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. Confirmer le plasmide recombinant par digestion à double restriction à l’aide de BamHI et de NotI, comme décrit ci-dessus à l’étape 1.3.
  7. Vérifiez davantage les clones positifs à la digestion de restriction pour la séquence correcte par séquençage de l’ADN de Sanger. Transformer E. Coli Cellules compétentes BLR(DE3) pLysS avec la construction plasmidique vérifiée pour l’expression de la protéine CDPK1.

2. Expression et purification de la protéine CDPK1 recombinante chez E. coli

  1. Expression de CDPK1 recombinant
    1. Inoculer un seul clone de E. Coli La souche pLysS BLR(DE3) contenant la séquence plasmidique vérifiée se construit dans 10 mL de milieu LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL). Incuber la culture pendant la nuit à 37 °C en secouant à 200-250 tr/min.
    2. Inoculer la culture secondaire avec 1 % de la culture primaire et laisser les cellules bactériennes se développer jusqu’à la phase mi-log à 37 °C. Lorsque la densité optique (DO) de la culture secondaire atteint 0,7-0,9 à 600 nm, induire l’expression du CDPK1 recombinant pleine longueur en ajoutant 1 mM d’isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et incuber pendant 10-12 h à 24 °C.
    3. Après l’incubation, récoltez l’E. cellules coli par centrifugation à 5 000 x g pendant 10 min. Décantez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
    4. Préparez le tampon de lyse avec la composition suivante : 1 mM de dithiothréitol (DTT), 0,1 mg/mL de lysozyme, 1 mM d’EDTA, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et un cocktail d’inhibiteur de protéase 1x dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    5. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 fois le volume en poids de la pastille du tampon de lyse. Sonicer la suspension cellulaire pendant 15 min par intervalles de 9 s On, 15 s Off pour éviter un échauffement localisé qui peut entraîner une dénaturation des protéines.
    6. Centrifugez le lysat à 17 000 x g pendant 1 h et incubez le surnageant clair avec des billes de glutathion pendant la nuit à 4 °C. Suivez le protocole mentionné ci-dessous pour obtenir la protéine CDPK1 recombinante purifiée.
  2. Chromatographie d’affinité utilisant des billes de glutathion pour la purification de CDPK1 marqué GST
    1. Prélever 500 μL de billes de glutathion complètement remises en suspension pour 250 mL de culture bactérienne et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Décanter soigneusement le surnageant.
    2. Lavez les billes avec 5 mL de tampon de liaison (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) et retournez pour mélanger.
    3. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez le lavage et la centrifugation pour 3x-4x.
    4. Ajouter les billes dans le lysat cellulaire de la bactérie et incuber pendant 12 h à 4 °C en secouant légèrement (20-30 tr/min).
    5. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Le surnageant peut être enregistré pour estimer la quantité de CDPK1 recombinante qui reste non liée.
    6. Laver les billes liées à CDPK1 au moins 5 à 6 fois avec du PBS contenant 1 mM de DTT, suivi d’un lavage avec 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, pH 7,5.
    7. Éluez la protéine liée 2x d’abord avec 250 μL de tampon d’élution 1 (EB1), puis 2x avec 250 μL de tampon d’élution 2 (EB2). La composition d’EB1 et d’EB2 est la suivante : 10 mM de glutathion réduit dans 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5 et 20 mM de glutathion réduit dans 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl et pH 7,5, respectivement.
    8. Incuber les billes liées à CDPK1 dans les tampons d’élution 1 et 2 à température ambiante (RT) pendant 5 à 10 minutes en utilisant une légère agitation ou une rotation de bout en bout.
    9. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et transférer soigneusement le surnageant contenant la protéine recombinante CDPK1 éluée dans un tube séparé.
    10. Répétez les étapes 2.2.8 et 2.2.9 pour obtenir 2 élus avec EB1 et EB2 chacun.

3. Mutagénèse dirigée pour la génération de protéines mutantes recombinantes CDPK1

  1. Utilisez le plasmide pGEX4T1 contenant la séquence du gène cdpk1 vérifiée. Nous préférons utiliser le même plasmide que celui utilisé pour la transformation de la souche pLysS BLR(DE3) d’E. coli .
  2. Concevez les amorces pour introduire une mutation gatekeeper dans la séquence du gène cdpk1 de type sauvage. Le résidu gardien de type sauvage (T145) est codé par un codon ACC dans le gène cdpk1 . Remplacez le gardien de la thréonine par des résidus de gardien petits (sérine, T145S) et volumineux (méthionine, T145M) qui sont codés par les codons AGC et ATG, respectivement.
  3. Suivez les directives mentionnées ci-dessous pour concevoir les amorces avant et inverse pour la mutagénèse dirigée.
    1. Assurez-vous que les deux amorces sont complémentaires l’une de l’autre. Conservez 15 à 20 nucléotides de séquence non modifiée des deux côtés de la mutation. Assurez-vous que Tm est compris entre 50 °C et 55 °C pour la séquence, à l’exclusion du site muté.
  4. Utilisez le kit de mutagenèse dirigée pour générer les constructions mutantes gatekeeper de cdpk1. Suivez les instructions du fabricant pour introduire la mutation souhaitée. Les amorces utilisées pour la mutagénèse ciblée sont énumérées dans le tableau 1.
  5. Traitez le mélange réactionnel avec 0,5 μL d’enzyme DpnI (20 000 U/mL) pour digérer le plasmide méthylé parental. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 3 h. Transformer les cellules compétentes d’E. coli DH5α avec le mélange réactionnel traité au DpnI.
  6. Criblez quatre clones de chacune des constructions plasmidiques T145M et T145S pour vérifier l’introduction de la mutation souhaitée dans la séquence du gène cdpk1 par séquençage de l’ADN.
  7. Transformer les plasmides dont la séquence a été vérifiée dans la souche pLysS BLR(DE3) d’E. coli pour l’expression des protéines recombinantes CDPK1 T145M/S, comme décrit à l’étape 1.5.
  8. Exprimer et purifier les protéines mutantes gardiennes CDPK1 en suivant les étapes décrites dans la section 2 pour la protéine CDPK1 de type sauvage.

4. Dosage in vitro de l’activité kinase de CDPK1

REMARQUE : L’activité kinase de CDPK1 de type sauvage recombinant et des protéines mutantes gatekeeper est évaluée par une approche de marquage d’épitopes semi-synthétiques telle que décrite par Allen et al.34.

  1. Incuber 50 ng de protéine recombinante dans le tampon contenant 50 mM de Tris, 50 mM de MgCl2, 1x cocktail d’inhibiteurs de phosphate avec 2 μg de protéine basique de myéline (MBP) en tant que substrat exogène de CDPK1 dans le mélange réactionnel total de 50 μL.
  2. Selon les conditions nécessitant la présence ou l’absence de calcium, ajouter du CaCl2 ou de l’EGTA, respectivement, pour obtenir la concentration finale de 2,5 mM chacun dans le tampon de dosage des kinases. Ajouter de l’ATPγS à la concentration finale de 100 μM dans le tampon pour l’utiliser comme source du groupe phosphate terminal transférable.
  3. Incuber le mélange réactionnel à 30 °C dans un bain-marie pendant 1 h, suivi de la fin de la réaction par l’ajout de 5 mM d’EGTA. Ajouter 5 μl de mésylate de p-nitrobenzyle (PNBM) de 50 mM au mélange réactionnel et laisser incuber à 20 °C dans un bain-marie pendant 2 h pour l’alkylation des résidus de sérine et de thréonine phosphorylés dans la transphosphorylation MBP et CDPK1 autophosphorylés.
  4. Pour obtenir un total de 55 μL de mélange réactionnel, ajouter 19 μL de tampon d’échantillon 4x SDS et chauffer à 95 °C pendant 5 min.

5. Analyse par transfert Western pour détecter les produits thiophosphorylés de l’essai de kinase in vitro

  1. Préparez 12 % de gel SDS-PAGE et chargez 15 μL de chaque échantillon. Séparez le mélange réactionnel pour visualiser CDPK1 autophosphorylé et MBP transphosphorylé.
  2. Transférez les protéines séparées du gel SDS-PAGE vers une membrane PVDF en utilisant la méthode de transfert humide32.
  3. Bloquez les sites non spécifiques sur la membrane en PVDF en l’incubant avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris (20 mM de Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM de NaCl) contenant 0,05 % de Tween 20 pendant 1 h à RT.
  4. Incuber la membrane PVDF avec l’anticorps primaire de lapin contre les adduits thiophosphorylés alkylés à une dilution de 1:2 500 pendant une nuit à 4 °C dans le tampon de blocage.
  5. Après une nuit d’incubation, laver le blot 3 fois avec une solution saline tamponnée au Tris avec 0,05 % de Tween 20 pendant 10 min chacune.
  6. Incuber davantage le transfert avec un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre dans un tampon bloquant à une dilution de 1:5 000 pendant 1 h à RT, suivi d’un lavage avec une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,05 % de Tween 20.
  7. Recouvrir le transfert d’un substrat chimiluminescent en mélangeant une proportion égale de la solution A et de la solution B selon les instructions du fabricant et exposer sur un film radiographique dans une chambre noire pour obtenir des signaux d’autophosphorylation de CDPK1 et de transphosphorylation de MBP.

6. Clonage de la séquence guide pour ciblerle locuscdpk1 afin d’introduire la substitution de gardien  

REMARQUE : La séquence guide de 20 nucléotides a été sélectionnée par curation manuelle et clonée dans le plasmide pL6eGFP au site BtgZI en utilisant les étapes suivantes.

  1. Digestion de pL6eGFP à l’aide de l’enzyme BtgZI
    1. Digérer 1 μg du plasmide35 pL6eGFP avec 1 μL d’enzyme BtgZI (5 000 unités/mL) pendant 4 h à 60 °C dans un mélange réactionnel de 20 μL, en suivant le protocole du fabricant de l’enzyme pour les conditions de réaction.
    2. Après la période d’incubation de 4 h, faites passer le plasmide digéré sur un gel d’agarose à 1 % et excisez le morceau de gel (~ 9,8 kb) contenant le plasmide digéré. Purifier le plasmide digéré à l’aide d’un kit d’extraction de gel sur colonne selon les instructions du fabricant.
  2. Recuit d’oligos
    1. Reconstituer les oligonucléotides (Ck1GUIDEFWD et Ck1GUIDEREV) dans de l’eau exempte de DNase/RNase pour préparer une solution mère de 100 μM.
    2. Combinez 20 μM de chaque oligonucléotide dans une solution contenant 10 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl et 1 mM d’EDTA. Incuber le mélange à 95 °C dans un bain sec pendant 5 min et laisser refroidir la réaction à température ambiante. Il faut généralement 1 h pour que la température du mélange réactionnel atteigne la RT.
    3. Diluer les oligonucléotides recuits à 0,5 μM dans Tris pH 8,0, ce qui permet d’obtenir un volume total de mélange réactionnel de 100 μL.
  3. Réaction en perfusion
    1. Combinez 1,5 μL d’oligonucléotides dilués avec 100 ng de plasmide linéarisé digéré par BtgZI dans un prémélange enzymatique 5x In-Fusion dans un volume de réaction total de 10 μL pour générer un guide CDPK1 contenant le plasmide pL6CK1G.
    2. Incuber la réaction pendant 15 min à 50 °C. Stocker la réaction à 4 °C jusqu’à ce qu’elle procède à la transformation de E. coli.
      REMARQUE : Pour un stockage à long terme, le mélange réactionnel peut être stocké à -20 °C.
  4. Transformation de E. Coli Des cellules compétentes stellaires
    1. Ajouter 2,5 μL du mélange réactionnel à l’E. Coli Stellar compétentes cellules et procéder au processus de transformation en suivant le protocole du fabricant.
    2. Placez les cellules compétentes transformées sur une plaque d’ampicilline LB (100 μg/mL) et laissez les bactéries transformées se développer à 37 °C pendant la nuit.
    3. Sélectionnez les colonies transformées et extrayez le plasmide à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide disponible dans le commerce. Suivez les instructions du fabricant pour la purification des plasmides. Valider l’insertion du guide dans le plasmide par séquençage de l’ADN de Sanger.

7. Clonage du bras d’homologie pour la réparation du locus cdpk1 restreint à l’endonucléase Cas9

REMARQUE : Un bras d’homologie comprenant les SNP à introduire dans le locus cible est synthétisé commercialement. Nous prenons généralement un bras d’homologie de 400 à 1000 pb de longueur. Le bras d’homologie contient des mutations silencieuses dans la région de l’ARN guide et le PAM pour empêcher la re-coupe du locus modifié après l’incorporation des SNP souhaités. Le bras d’homologie (correspondant aux nucléotides 133 à 553 de CDPK1), incorporant la mutation Met ou Ser gatekeeper et les mutations silencieuses, est flanqué des sites de restriction AflII et SpeI.

  1. Digestion double de 1 μg de pL6CK1G et du plasmide contenant le bras d’homologie en utilisant 0,5 μL de chacune des enzymes de restriction AflII (20 000 U/ml) et SpeI (20 000 U/ml) pendant 4 h à 37 °C dans un mélange réactionnel de 20 μL.
  2. Exécutez la réaction complète de plasmides doublement digérés sur un gel d’agarose à 1,5 % et purifiez les bandes correspondant au bras d’homologie et au squelette plasmidique de pL6CK1 à l’aide d’un kit d’extraction de gel en suivant les instructions du fabricant.
  3. Lister le bras d’homologie digéré avec 100 ng de plasmide pL6CK1 dans un rapport vecteur/insert de 1:5 dans un volume de réaction total de 10 μL en utilisant l’ADN ligase T4. Incuber la réaction de ligature pendant la nuit à 16 °C. Transformez les cellules compétentes d’E. coli DH5α avec le mélange de ligature complet selon les instructions du fabricant.
  4. Placez les cellules transformées sur des plaques de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) pour sélectionner des transformants positifs. Sélectionnez des colonies uniques dans la plaque d’ampicilline LB et purifiez le plasmide à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide.
  5. Confirmez la présence du groupe d’homologie chez le clone en digérant le plasmide purifié avec les enzymes AflII et SpeI en utilisant les mêmes conditions de digestion que celles décrites à l’étape 7.3. Confirmer les clones positifs à la double digestion par séquençage de l’ADN de Sanger pour valider la séquence complète du bras d’homologie.

8. Purification des plasmides pL6CK1Met, pL6CK1Ser et pUF1 pour la transfection du parasite du paludisme

  1. Placer 5 mL de cultures primaires de clones de pL6CK1Met, pL6CK1Ser et pUF1 dans des milieux LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et incuber pendant 10 h. Transférez la culture primaire dans la culture secondaire dans un rapport de 1:1000 et incubez pendant 12 heures supplémentaires.
  2. Granuler la culture bactérienne par centrifugation à 5000 x g pendant 10 min dans un flacon à centrifuger.
  3. Isolez les plasmides à l’aide d’un kit de purification des plasmides selon le protocole du fabricant. Dissoudre l’ADN plasmidique dans de l’eau exempte de DNase/RNase pour une transfection directe du parasite.

9. Culture in vitro de Plasmodium falciparum et synchronisation du sorbitol pour la transfection

REMARQUE : La culture in vitro de P. falciparum dans des globules rouges humains (GR) est réalisée selon la méthode décrite par Trager et Jensen36.

  1. Propager la souche NF54 de P. falciparum par culture dans des globules rouges humains O+ à un hématocrite de 2 % dans un milieu RPMI complet (cRPMI) contenant du RPMI 1640 complété par de la L-glutamine, 25 mM HEPES, 25 mM de bicarbonate de sodium et 50 μg/mL d’hypoxanthine. Compléter le milieu avec 0,5 % d’AlbuMAX II et 10 μg/mL de gentamicine et maintenir la culture à 37 °C sous une atmosphère de 5 % d’O2, 5 % de CO2 et 90 % de N2.
  2. Pour que la synchronisation du sorbitol obtienne un parasite à l’étage annulaire, granuler les parasites asynchrones dans un tube conique de 50 mL par centrifugation à 2 300 x g pendant 3 min à RT. Jeter le surnageant.
  3. Incuber les globules rouges parasités avec 9 volumes de sorbitol à 5 % pendant 10 min à 37 °C. Après l’incubation, réduire les globules rouges par centrifugation à 2 300 x g pendant 3 minutes et jeter le sorbitol.
  4. Laver les parasites traités au sorbitol avec du RPMI incomplet, de l’iRPMI (milieu RPMI sans albumax et bicarbonate de sodium) et les incuber ensuite dans du cRPMI. Utilisez les parasites au stade annulaire dans le cycle suivant pour la transfection plasmidique.

10. Transfection du parasite au stade annulaire avec les plasmides pL6CK1Met, pL6CK1Ser et pUF1

REMARQUE : Les étapes suivantes sont utilisées pour la transfection directe de parasites au stade annulaire avec de l’ADN plasmidique.

  1. Préparez 2x cytomix buffer37 en le dissolvant dans 30 mL d’eau, 240 mM de KCl, 0,3 mM de CaCl2, 4 mM d’EGTA, 10 mM de MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 et 50 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,6. Ajustez le volume final à 50 ml. Filtre : stérilisez le tampon à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Ensuite, diluez le tampon cytomix 2x avec de l’eau stérile pour obtenir un tampon cytomix 1x.
  2. Dans un tube conique stérile de 15 ml, ajoutez 100 μL de globules rouges parasités étagés en anneau et lavez-les 2 fois avec 5 ml de 1 tampon cytomix. Effectuer les lavages par centrifugation à 994 x g pendant 3 min à RT.
  3. Après le lavage, retirez le tampon et ajoutez 50 μg de chaque plasmide (pL6CK1Met/pUF1 pour générer la mutation T145M et pL6CK1Ser/pUF1 pour générer la mutation T145S) dans les globules rouges parasités emballés. Ensuite, ajoutez 2x tampon en fonction du volume de plasmide et ajustez le volume à 400 μL avec 1x concentration de tampon.
  4. Transvaser 400 μL de la solution ci-dessus dans des cuvettes de 0,2 cm pour chaque transfection. Électroporat dans les conditions suivantes : 0,31 kV, 950 μF et résistance réglée sur Infini.
  5. Après l’électroporation, retirer les parasites transfectés de la cuvette, les mélanger avec du cRPMI et les transférer dans une fiole T25 d’un volume total de 15 ml. Incuber les parasites pendant 2 h dans les conditions mentionnées à l’étape 9.1.
  6. Après l’incubation, transvaser les parasites transfectés dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 994 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et laver les parasites avec 10 mL d’IPRP incomplet. Cultivez-les avec du cRPMI frais pendant 2 jours, en réapprovisionnant le milieu de culture après 24 h.
  7. Après 48 h, retirer le cRPMI de chaque flacon et remettre en suspension la culture dans du cRPMI contenant 2 nM de WR99210 et 150 nM de DSM26738. Ensuite, transvasez la culture dans une fiole T75 en ajoutant 400 μL de globules rouges frais. Réapprovisionnez quotidiennement le milieu avec du cRPMI contenant du WR99210 et du DSM267 pendant 7 jours. Par la suite, ajoutez l’IARPC contenant les deux médicaments tous les deux jours jusqu’au 14e jour après la transfection.
  8. Le 14e jour, aliquote 200 μL de culture transfectée dans 1,5 mL de tube de microcentrifugation (TCM) pour la préparation des lames. Granulez les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirez le surnageant et transférez les cellules sur la lame. Faites un frottis à l’aide d’une autre lame en la plaçant à un angle de 45°.
  9. Fixez la lame dans du méthanol et préparez la coloration Giemsa en la diluant 1:10 dans de l’eau ultra-pure. Ensuite, colorez la lame en l’immergeant complètement dans la teinture Giemsa pendant 20 min. Lavez la lame sous l’eau courante et séchez-la soigneusement. Ensuite, observez la lame au microscope optique à un grossissement de 100x en appliquant de l’huile d’immersion.
  10. Une fois que les parasites sont visualisés, réapprovisionnez le milieu quotidiennement et laissez-les se développer pendant 2-3 jours. Ensuite, retirez les parasites pour vérifier la modification souhaitée dans la séquence du gène cible au locus ciblé.
    REMARQUE : Si les parasites ne sont pas visibles le jour 14, réapprovisionnez le milieu (contenant les deux médicaments) après 4 jours. Coupez le parasite de 30% et ajoutez du sang frais pour maintenir 2% d’hématocrite tous les 7 jours jusqu’à ce que les parasites réapparaissent.

11. Vérification par PCR d’un parasite transgénique avec modification souhaitée du locus cdpk1

  1. Après 2 à 3 jours de croissance du parasite, prélever 500 μL de culture et le transférer dans un TCM de 1,5 ml.
  2. Granuler les cellules par centrifugation à 2 400 x g pendant 5 min. Ensuite, lyser les globules rouges par traitement à la saponine.
    1. Pour le traitement des saponines, ajouter 10 μL de solution de saponine à 10 % à 1 mL de pastille de parasite en suspension et maintenir à 4 °C pendant 5 min. Centrifugez les cellules à 2 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jetez le surnageant. Répétez cette étape jusqu’à ce que la rougeur disparaisse complètement et qu’une pastille de parasites de couleur noire soit obtenue.
  3. Laver la pastille parasitaire avec 1 mL de 1x PBS par centrifugation à 2 400 x g pendant 5 min. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 50 μL d’eau exempte de DNase/RNase. Chauffer la pastille parasitaire remise en suspension à 95 °C pendant 5 min, puis la centrifuger à 16 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez le surnageant contenant l’ADN du parasite dans un tube frais.
  4. Utilisez le matériel génétique ci-dessus pour amplifier par PCR le gène complet en utilisant l’ensemble d’amorces ck1f1 et ck1r3wt (voir tableau 1), en ciblant spécifiquement la région à l’extérieur du bras d’homologie, comme décrit ci-dessus à l’étape 1.2. Séquencez la région d’homologie contenant la mutation T145M à l’aide de l’amorce ck1f1 .

12. Limitation de la dilution pour l’obtention de parasites transgéniques clonaux

  1. Après vérification de la séquence, diluer la culture de parasite transfectée pour obtenir une concentration finale de 1 parasite par 200 μL. Ensuite, ajoutez 100 μL de la culture diluée dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Effectuez les étapes suivantes (12.2-12.4) pour obtenir 1 parasite/200 μL.
  2. Préparez 10 ml de globules rouges parasités avec 2 % d’hématocrite. Estimez le pourcentage de parasitémie de la culture à l’aide de la méthode de coloration Giemsa décrite ci-dessus. Ensuite, comptez le nombre total de globules rouges dans une culture diluée à l’aide d’un hémocytomètre.
    Nombre total de globules rouges/mL = Nombre moyen de globules rouges dénombrés x facteur de dilution x 104
    Nombre de globules rouges parasités/mL = (pourcentage de parasitémie x nombre total de globules rouges/mL)/100
  3. Préparez une dilution de 1:10 000 des globules rouges parasités en diluant en série la culture initiale 2x (dilution de 1:100 chacune).
  4. Ajouter un volume approprié (en microlitres) de la culture diluée pour obtenir un total de 50 parasites dans 10 mL de milieu, en assurant un hématocrite de 2 %. Ensuite, ajoutez 100 μL du milieu contenant 50 parasites dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Placez la plaque dans un sécador hermétique rincé avec un mélange de gaz (composition décrite ci-dessus à l’étape 9.1) et incubez à 37 °C. Remplacez le support tous les 2 jours.
  5. Remplacer le milieu par du cRPMI contenant 2% d’hématocrite tous les 7e jours jusqu’à l’apparition des parasites.
    1. Inclinez la plaque à 96 puits à un angle de 45° et laissez les globules rouges se stabiliser. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement le milieu de chaque puits et observez un changement de couleur au jaune dans les puits contenant des parasites, contrastant avec la couleur rose des milieux dans les puits sans parasites. Ce changement de couleur se produit parce que les parasites acidifient le milieu.
  6. Après avoir observé le changement de couleur, prélevez une petite quantité de culture du puits présentant un changement de couleur et préparez un frottis sur une lame, en l’étiquetant avec un numéro correspondant à la position du puits. Teignez la lame avec un colorant Giemsa et observez-la au microscope comme décrit ci-dessus.
  7. Transférez le contenu du puits dans une fiole T25 où les parasites ont été observés au microscope. Laissez les parasites se développer dans le ballon T25 pendant 4 à 5 jours et réapprovisionnez le milieu tous les deux jours.
  8. Une fois que la parasitémie atteint 2-3 %, extrayez 500 μL de culture parasitaire. Ensuite, analysez les globules rouges par la saponine et procédez à l’extraction du matériel génétique du parasite en utilisant la méthode décrite à la section 11.
  9. Pour confirmer la génération de parasites transgéniques clonaux, mettez en place une réaction PCR comme décrit ci-dessus à l’étape 1.1.1 et envoyez le produit PCR pour le séquençage de l’ADN afin de confirmer l’introduction des SNP souhaités dans le locus cible.

13. Analyse des relevés de notes à l’aide de la PCR en temps réel

  1. Purification par Percoll/Sorbitol et synchronisation des parasites
    1. Préparez un gradient Percoll/Sorbitol39,40 en superposant séquentiellement 3 mL chacun de 70 % suivi de solutions à 40 % de percoll/sorbitol dans un tube conique de 15 mL.
    2. Déposer délicatement 1 à 2 mL de culture de parasites contenant principalement le parasite au stade schizonte de WT et CDPK1 T145M sur le gradient.
    3. Centrifugez le gradient à 2 300 x g pendant 15 min à RT en utilisant la désaccélération réglée à 4 dans la centrifugeuse dans un rotor à godets oscillants.
    4. Prélever l’anneau intermédiaire contenant les stades trophozoïte et schizont du parasite à l’interface du gradient dans un tube conique frais de 50 ml.
    5. Lavez les parasites en ajoutant un volume égal de 9:1 (cRPMI :10xPBS), puis centrifugez à 994 x g pendant 3 min pour granuler les parasites.
    6. Lavez à nouveau la pastille avec une solution de 19:1 (cRPMI :10xPBS), puis centrifugez-la à 994 x g pendant 3 min.
    7. Ajouter chaque pastille parasitaire dans des flacons séparés contenant du cRPMI avec 2 % d’hématocrite (pré-incubé à 37 °C). Incuber les flacons pendant 4 h dans les conditions décrites ci-dessus à l’étape 9.1 pour permettre l’invasion des mérozoïtes des schizontes enrichis dans les globules rouges frais.
    8. Après 4 h, traitez les parasites avec du sorbitol comme décrit ci-dessus aux étapes 9.2-9.4 pour obtenir des parasites en anneau hautement synchronisés de 0 à 4 h.
    9. Incuber les parasites synchronisés pendant 44 h après le traitement au sorbitol pour obtenir le stade de schizonte de 44 à 48 h du parasite.
  2. Isolement de l’ARN à partir de schizontes de parasites WT et CDPK1 T145M
    1. Récoltez les parasites WT et CDPK1 T145M 44-48 h après l’invasion. Laver les granulés antiparasitaires avec 1x PBS à 994 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Remettre les pastilles de parasite en suspension dans 1 mL de 1x PBS et les traiter avec de la saponine pour lyser les globules rouges environnants comme décrit à l’étape 11.2.1.
    3. Remettre en suspension la pastille de parasite dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et la conserver à -80 °C jusqu’à la suite du traitement.
    4. Décongeler la pastille congelée à 15-30 °C pour une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
    5. Ajouter 200 μL de chloroforme par mL de réactif d’extraction d’ARN et agiter vigoureusement les tubes à la main pendant 15 s. Incuber à RT pendant 2-3 min.
    6. Centrifuger le mélange à 16 200 x g pendant 15 min à 4 °C. L’ARN restera exclusivement dans la couche aqueuse supérieure incolore. Isolez l’ARN à l’aide d’un kit selon les instructions du fabricant.
  3. Synthèse de l’ADNc à partir de l’ARN du parasite WT et CDPK1 T145M
    1. Traitez les échantillons contenant de l’ARN à l’aide d’une trousse de prélèvement d’ADN en suivant les instructions du fabricant pour éliminer l’ADN contaminant.
    2. Synthétisez l’ADNc à partir des échantillons d’ARN isolés à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc selon le protocole du fabricant. Nous utilisons des amorces hexamères aléatoires pour le processus de transcription inverse au lieu d’amorces oligo-dT.
    3. Assurer des contrôles NO-RT (réactions mises en place sans ajout de l’enzyme transcriptase inverse) pour chaque échantillon d’ARN utilisé pour la préparation de l’ADNc afin d’exclure le transfert de contamination de l’ADN génomique de l’ARN purifié pendant la préparation de l’ADNc.
    4. Testez l’ADNc en amplifiant tout segment de gène contenant une séquence intronique intermédiaire, telle que le gène cdpk1 complet, afin d’exclure la contamination par l’ADN génomique. Utilisez la condition PCR comme décrit à l’étape 1.1.1.
  4. Analyse de l’expression de la transcription des parasites WT et CDPK1 T145M
    1. Utilisez l’ADNc préparé à partir des parasites WT et CDPK1 T145M pour effectuer une analyse de l’expression des transcrits de 11 gènes différents par PCR en temps réel. Les 11 gènes cibles comprennent 7 membres de la famille CDPK et 4 kinases impliquées dans l’invasion des globules rouges (voir le tableau 2 pour les gènes et les amorces correspondantes utilisées pour la PCR en temps réel).
    2. Concevez des amorces à l’aide d’un logiciel de synthèse d’amorces. Amplifiez environ 120 pb de chaque gène sélectionné à l’aide d’amorces spécifiques au gène avec des températures de fusion similaires.
    3. Amplifiez les gènes cibles à l’aide d’un pré-mélange et exécutez la plaque sur un système de PCR en temps réel en utilisant les paramètres de cycle suivants : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, recuit à 52 °C pendant 20 s et extension à 62 °C pendant 30 s.
    4. Normalisez le niveau d’expression de chaque gène à l’aide de deux gènes d’entretien, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et la thréonine ARNt ligase (ThrRS)32. Calculez l’expression relative de chaque kinase cible dans le parasite CDPK1 T145M par rapport au témoin WT.
    5. Effectuez l’analyse statistique à l’aide du progiciel d’analyse statistique R. Vous pouvez également utiliser un autre logiciel d’analyse.
      REMARQUE : Les méthodes de transcriptomique globale telles que RNA-Seq ou les microréseaux sont des approches supérieures pour obtenir une vue plus large du recâblage du transcriptome chez les parasites mutants par rapport à WT.

Résultats

La WT CDPK1 recombinante est exprimée sous la forme d’une protéine de fusion avec un marqueur N-terminal de glutathion S-transférase (GST) et purifiée par chromatographie d’affinité GST. La protéine CDPK1 purifiée a été détectée par transfert Western à l’aide d’anticorps anti-CDPK1 et anti-GST (figure 1). Le résidu gardien de la thréonine (T145) dans WT CDPK1 a été remplacé par Met et Ser en utilisant la mutagenèse dirigée pour gé...

Discussion

La génération d’un parasite transgénique mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 est basée sur les données d’activité kinase in vitro avec des enzymes recombinantes. Il est préférable de générer autant de protéines recombinantes mutantes avec différents résidus de gardien que possible. Étant donné que le génome de P. falciparum est très riche en AT, l’expression de protéines recombinantes dans E. coli peut néce...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous reconnaissons le soutien et les installations disponibles par l’intermédiaire de l’Installation centrale d’instrumentation de l’École des sciences de la vie de la JNU. Le soutien financier du Département de biotechnologie (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) à l’AB est également vivement remercié. Nous remercions Jose-Juan Lopez-Rubio pour la fourniture des plasmides pL6eGFP et pUF1. L’organisme subventionnaire n’a aucun rôle dans la préparation et la décision de publication de l’œuvre. MS est récipiendaire d’une bourse JRF-SRF du Conseil pour la recherche scientifique et industrielle.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

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