Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Riepilogo

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Abstract

Uno dei meccanismi per sovvertire l'effetto dei farmaci da parte del parassita della malaria è attraverso il ricablaggio del suo trascrittoma. L'effetto è più pronunciato per i geni bersaglio appartenenti alla famiglia multigenica. Le protein chinasi del Plasmodium falciparum appartenenti alla famiglia CDPK sono essenziali per lo sviluppo dello stadio ematico. In quanto tali, i CDPK sono considerati buoni bersagli per lo sviluppo di composti antimalarici. L'approccio della genetica chimica è stato storicamente utilizzato per chiarire la funzione delle protein chinasi negli eucarioti superiori. Richiede la sostituzione del residuo gatekeeper con un altro amminoacido con una catena laterale diversa attraverso la manipolazione genetica. La sostituzione di amminoacidi nella posizione di gatekeeper modula l'attività di una proteina chinasi e modifica la sua suscettibilità a una specifica classe di composti noti come inibitori della chinasi urtata (BKI) che aiutano nell'identificazione funzionale del gene bersaglio. Qui, abbiamo sfruttato l'approccio della genetica chimica per comprendere i meccanismi compensatori evoluti da un parassita mutante che ospita un allele ipomorfico di cdpk1. Nel complesso, il nostro approccio aiuta a identificare percorsi compensatori che possono essere contemporaneamente mirati a prevenire lo sviluppo di resistenza ai farmaci contro le singole chinasi.

Introduzione

La malaria è una delle principali malattie infettive responsabile di milioni di decessi ogni anno, soprattutto nei bambini di età inferiore ai 5 anni di¹. Non esiste un vaccino clinicamente disponibile contro la malaria. Inoltre, il Plasmodium falciparum, il parassita della malaria umana più letale, è noto per aver acquisito resistenza contro il farmaco di prima linea chiamato artemisinina 2,3,4,5. C'è un'urgente necessità di identificare nuovi bersagli farmacologici e nuove ....

Protocollo

Il P. Il ceppo di parassita falciparum (NF54) è stato ottenuto da Alvaro Molina Cruz 21,32,33. I globuli rossi umani O⁺ utilizzati per la coltura del parassita sono stati ottenuti dal Rotary Blood Centre di Nuova Delhi, in India. I plasmidi, pL6eGFP e pUF1, sono stati ottenuti da Jose-Juan Lopez-Rubio. Il DSM267 è stato ottenuto da Margaret A. Phillips e Pradipsinh K. Rathod. WR99210 è stato fornito da Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Costruzione di plasmidi per l'espressione di....

Discussione

La generazione di un parassita transgenico mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 si basa sui dati di attività chinasica in vitro con enzimi ricombinanti. È meglio generare il maggior numero possibile di proteine ricombinanti mutanti con diversi residui gatekeeper. Poiché il genoma di P. falciparum è altamente ricco di AT, quindi, l'espressione di proteine ricombinanti in E. coli può richiedere l'ottimizzazione del codone. Ciò .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570