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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Abstract

Uno dei meccanismi per sovvertire l'effetto dei farmaci da parte del parassita della malaria è attraverso il ricablaggio del suo trascrittoma. L'effetto è più pronunciato per i geni bersaglio appartenenti alla famiglia multigenica. Le protein chinasi del Plasmodium falciparum appartenenti alla famiglia CDPK sono essenziali per lo sviluppo dello stadio ematico. In quanto tali, i CDPK sono considerati buoni bersagli per lo sviluppo di composti antimalarici. L'approccio della genetica chimica è stato storicamente utilizzato per chiarire la funzione delle protein chinasi negli eucarioti superiori. Richiede la sostituzione del residuo gatekeeper con un altro amminoacido con una catena laterale diversa attraverso la manipolazione genetica. La sostituzione di amminoacidi nella posizione di gatekeeper modula l'attività di una proteina chinasi e modifica la sua suscettibilità a una specifica classe di composti noti come inibitori della chinasi urtata (BKI) che aiutano nell'identificazione funzionale del gene bersaglio. Qui, abbiamo sfruttato l'approccio della genetica chimica per comprendere i meccanismi compensatori evoluti da un parassita mutante che ospita un allele ipomorfico di cdpk1. Nel complesso, il nostro approccio aiuta a identificare percorsi compensatori che possono essere contemporaneamente mirati a prevenire lo sviluppo di resistenza ai farmaci contro le singole chinasi.

Introduzione

La malaria è una delle principali malattie infettive responsabile di milioni di decessi ogni anno, soprattutto nei bambini di età inferiore ai 5 anni di1. Non esiste un vaccino clinicamente disponibile contro la malaria. Inoltre, il Plasmodium falciparum, il parassita della malaria umana più letale, è noto per aver acquisito resistenza contro il farmaco di prima linea chiamato artemisinina 2,3,4,5. C'è un'urgente necessità di identificare nuovi bersagli farmacologici e nuove strategie che possono essere rapidamente implementate per evitare la diffusione della resistenza all'artemisinina in tutto il mondo. Una migliore comprensione del meccanismo d'azione dei farmaci e delle basi molecolari delle vie compensatorie può aiutare a elaborare strategie migliori per evitare lo sviluppo di resistenza ai farmaci.

Le protein chinasi appartenenti alla famiglia delle proteina chinasi calcio-dipendenti (CDPK) sono cruciali in molte fasi dello sviluppo del parassita durante gli stadi eritrocitici, sessuali e pre-eritrocitici6. Durante la replicazione asessuata di P. falciparum, CDPK5 è noto per svolgere un ruolo critico nell'uscita dei merozoiti da schizonti maturi7. La delezione condizionale di CDPK5 non consente agli schizonti di rilasciare merozoiti nel flusso sanguigno, portando alla morte del parassita. Il meccanismo molecolare dell'uscita del parassita mediata da CDPK5 non è completamente compreso e si ritiene che coinvolga la proteina chinasi G (PKG) come regolatore a monte 7,8. CDPK7 è essenziale per la maturazione dei parassiti allo stadio anulare in trofozoite9. CDPK4 è un altro membro della famiglia CDPK che è fondamentale per lo sviluppo della fase sessuale all'interno delle zanzare. È coinvolto in più fasi durante il processo di esflagellazione ed è quindi fondamentale per la formazione di gameti maschili liberi e mobili 10,11,12,13. CDPK1 fosforilano i componenti del complesso di membrana interna e della rotria14,15. Inoltre, la delezione condizionale di CDPK1 provoca ipo-fosforilazione delle proteine coinvolte nell'invasione dei globuli rossi16. CDPK1 ha dimostrato di regolare lo scarico degli organelli apicali durante il processo di invasione17. CDPK1 aiuta anche nell'uscita dei merozoiti dai globuli rossi infetti fosforilando la proteasi18 SERA5. CDPK1 fosforilata è localizzata preferenzialmente all'estremità apicale della merozoite, dove può interagire con altre proteine del parassita necessarie per il processo di invasione19,20. CDPK1 è anche coinvolto nella formazione di gameti maschili e femminili, che è un passaggio critico per la trasmissione della malaria e lo sviluppo sessuale del parassita all'interno delle zanzare21.

L'approccio della genetica chimica è stato storicamente utilizzato per l'identificazione dei ruoli funzionali delle chinasi dei mammiferi22,23. L'approccio utilizza la sostituzione di un residuo nella posizione del gatekeeper con un amminoacido di una diversa catena laterale. Il cambiamento del residuo gatekeeper modula la dimensione di una tasca di ATP adiacente che, a sua volta, modifica l'accessibilità dei composti chimici chiamati inibitori della chinasi urtata (BKI) verso l'enzima mutante rispetto al tipo selvatico. La sostituzione di un residuo ingombrante nella posizione del gatekeeper con un residuo più piccolo consente l'accesso ai BKI, mentre la sostituzione inversa rende la chinasi resistente ai BKI. In alcuni casi, la sostituzione del residuo gatekeeper è associata ad una diminuzione dell'attività chinasica dell'enzima bersaglio, rendendo la modifica intollerante per gli studi funzionali24,25. L'effetto negativo della sostituzione gatekeeper sull'attività enzimatica può essere invertito generando mutazioni soppressori in un secondo sito nella chinasi intollerante25. Un approccio di genetica chimica è stato utilizzato per studiare la funzione delle protein chinasi Apicomplexan. Il CDPK4 wild-type contenente un residuo gatekeeper più piccolo è stato inibito selettivamente dagli inibitori della chinasi BKI-1 e 1294, portando a un blocco della gametogenesi maschile e dello sviluppo dell'oocisti11,12. La sostituzione di un piccolo residuo gatekeeper in CDPK4 con un residuo ingombrante di metionina ha portato ad una diminuzione dell'inibizione mediata da BKI nell'esflagellazione11. CDPK1 di Toxoplasma gondii, un parassita Apicomplexan strettamente correlato al parassita della malaria, ha dimostrato di essere coinvolto nella motilità e nell'invasione delle cellule ospiti da parte dei tachizoiti26,27. Una tasca gatekeeper più piccola del tipo selvatico TgCDPK1 è stata sfruttata per progettare inibitori specifici che riducono la patogenesi della malattia in modelli animali28,29. Coinvolgimento di P. Falciparum La proteina chinasi G (PKG) nello sviluppo schizogonico tardivo e nella formazione di gameti è stata dimostrata inibendo l'attività dell'enzima utilizzando specifici inibitori farmacologici30,31. La sostituzione della treonina nella posizione di gatekeeper con glutammina (T618Q) ha notevolmente diminuito la sensibilità dell'enzima mutante agli inibitori, con conseguente normale gametogenesi e progressione schizonte-anello30,31.

La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato un approccio di genetica chimica per la caratterizzazione funzionale delle chinasi bersaglio 11,12,22,23,26,30,31, tuttavia, abbiamo adottato questo approccio per comprendere lo sviluppo di meccanismi compensatori in parassiti che ospitano l'allele ipomorfico di una proteina chinasi. Abbiamo precedentemente dimostrato che la sostituzione del residuo gatekeeper wild-type in CDPK1 con metionina (T145M) determina una diminuzione del ~ 47% del potenziale di transfosforilazione dell'enzimamutante 32. Un parassita mutante contenente l'allele ipomorfico di cdpk1 (cdpk1t145m) è pre-adattato per la ridotta attività di CDPK1 mediante ricablaggio trascrizionale di altri membri della famiglia CDPK. Riteniamo che questa strategia possa essere utilizzata in generale per chiarire i meccanismi compensatori in parassiti mutanti contenenti alleli ipomorfici di protein chinasi essenziali. Altre chinasi che compensano parzialmente la funzione della chinasi bersaglio possono essere inibite contemporaneamente insieme alla chinasi bersaglio per prevenire lo sviluppo di resistenza ai farmaci contro le singole chinasi. Questo può servire come strategia migliore per il controllo della malaria.

Protocollo

Il P. Il ceppo di parassita falciparum (NF54) è stato ottenuto da Alvaro Molina Cruz 21,32,33. I globuli rossi umani O+ utilizzati per la coltura del parassita sono stati ottenuti dal Rotary Blood Centre di Nuova Delhi, in India. I plasmidi, pL6eGFP e pUF1, sono stati ottenuti da Jose-Juan Lopez-Rubio. Il DSM267 è stato ottenuto da Margaret A. Phillips e Pradipsinh K. Rathod. WR99210 è stato fornito da Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Costruzione di plasmidi per l'espressione di CDPK1 ricombinante in Escherichia coli

  1. Progettare la coppia di primer oligonucleotidici per amplificare la CDS completa del gene cdpk1 (PlasmoDB accession no. PF3D7_0217500) utilizzando software di analisi dei primer.
    1. Amplificare il CDS completo utilizzando la DNA polimerasi con una coppia di oligonucleotidi gene-specifica: Pk1fpgex e Pk1rpgex (vedi Tabella 1) utilizzando il cDNA preparato da Plasmodium falciparum come modello in un volume di reazione di 20 μL. Impostare le condizioni di amplificazione della PCR come segue: Denaturazione iniziale a 98 °C per 2 min, (Denaturazione a 98 °C per 30 s, Ricottura a 52 °C per 20 s, Prolunga a 62 °C per 20 s) x 36, Prolunga finale a 62°C per 10 min. Conservare il prodotto PCR a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
  2. Digerire 1 μg del prodotto della PCR amplificata e 1 μg del plasmide di espressione pGEX4T1 con endonucleasi di restrizione BamHI (20.000 U/mL) e NotI (20.000 U/mL) per 3-4 ore a 37 °C in un volume di reazione totale di 30 μL.
  3. Per purificare il prodotto PCR a doppia digestione e il plasmide, utilizzare un kit di pulizia PCR basato su colonna e seguire le istruzioni del produttore.
  4. Ligate 100 ng di plasmide pGEX4T1 purificato a doppia digestione con un inserto in un rapporto molare vettore-inserto di 1:5 utilizzando 1 μL di DNA ligasi T4 in un volume di reazione totale di 10 μL. Incubare la reazione di legatura a 16 °C durante la notte.
  5. Trasforma E. Coli Cellule competenti DH5α con la miscela legata seguendo il protocollo del produttore e piastra su piastre di agar LB contenenti ampicillina (100 μg/mL).
  6. Screening di quattro cloni batterici ottenuti dalla trasformazione per la presenza del plasmide ricombinante purificando il plasmide utilizzando un mini kit di purificazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore. Confermare il plasmide ricombinante mediante digestione a doppia restrizione utilizzando BamHI e NotI, come descritto sopra al punto 1.3.
  7. Verificare ulteriormente i cloni positivi alla digestione di restrizione per la corretta sequenza mediante sequenziamento del DNA Sanger. Trasforma E. Coli BLR(DE3) pLysS con il costrutto plasmidico verificato in sequenza per l'espressione della proteina CDPK1.

2. Espressione e purificazione della proteina CDPK1 ricombinante in E. coli

  1. Espressione di CDPK1 ricombinante
    1. Inoculare un singolo clone di E. Coli Ceppo BLR(DE3) pLysS contenente il costrutto plasmidico verificato in 10 mL di terreno LB contenente ampicillina (100 μg/mL). Incubare la coltura per una notte a 37 °C con agitazione a 200-250 giri/min.
    2. Inoculare la coltura secondaria con l'1% della coltura primaria e lasciare che le cellule batteriche crescano fino alla fase di log medio a 37 °C. Quando la densità ottica (OD) della coltura secondaria raggiunge 0,7-0,9 a 600 nm, indurre l'espressione del CDPK1 ricombinante a lunghezza intera aggiungendo 1 mM di isopropil ß-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare per 10-12 ore a 24 °C.
    3. Dopo l'incubazione, raccogliere l'E. cellule di coli mediante centrifugazione a 5.000 x g per 10 min. Decantare il surnatante e trattenere il pellet cellulare.
    4. Preparare il tampone di lisi con la seguente composizione: 1 mM di ditiotreitolo (DTT), 0,1 mg/mL di lisozima, 1 mM di EDTA, 1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e un cocktail di inibitori della proteasi 1x in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    5. Risospendere il pellet della cella in 10 volte il volume del peso del pellet del tampone di lisi. Sonicare la sospensione cellulare per 15 minuti a intervalli di 9 s On, 15 s Off per evitare un riscaldamento localizzato che può portare alla denaturazione delle proteine.
    6. Centrifugare il lisato a 17.000 x g per 1 ora e incubare il surnatante limpido con perle di glutatione per una notte a 4 °C. Seguire il protocollo indicato di seguito per ottenere la proteina CDPK1 ricombinante purificata.
  2. Cromatografia di affinità con perle di glutatione per la purificazione di CDPK1 con tag GST
    1. Prelevare 500 μL di perle di glutatione completamente risospese per 250 mL di coltura batterica e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Decantare accuratamente il surnatante.
    2. Lavare le perle con 5 mL di tampone legante (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) e capovolgere per mescolare.
    3. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione per 3x-4x.
    4. Aggiungere le perle al lisato di cellule batteriche e incubare per 12 ore a 4 °C agitando leggermente (20-30 giri/min).
    5. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il surnatante. Il surnatante può essere salvato per stimare la quantità di CDPK1 ricombinante che rimane non legata.
    6. Lavare le perle legate a CDPK1 almeno 5-6 volte con PBS contenente 1 mM DTT seguito da un lavaggio con 50 mM di Tris, 100 mM di NaCl, 1 mM di DTT, pH 7,5.
    7. Eluire la proteina legata 2 volte prima con 250 μL di tampone di eluizione 1 (EB1) seguito da 2 x con 250 μL di tampone di eluizione 2 (EB2). La composizione di EB1 ed EB2 è di 10 mM di glutatione ridotto in 50 mM di Tris, 100 mM di NaCl, pH 7,5 e 20 mM di glutatione ridotto in 50 mM di Tris, 100 mM di NaCl e pH 7,5, rispettivamente.
    8. Incubare le perle legate a CDPK1 nei tamponi di eluizione 1 e 2 a temperatura ambiente (RT) per 5-10 minuti agitando delicatamente o ruotando end-over-end.
    9. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e trasferire con cura il surnatante contenente la proteina ricombinante CDPK1 eluita in una provetta separata.
    10. Ripetere i passaggi 2.2.8 e 2.2.9 per ottenere 2 eluizioni ciascuna con EB1 ed EB2.

3. Mutagenesi sito-specifica per la generazione di proteine mutanti ricombinanti CDPK1 gatekeeper

  1. Utilizzare il plasmide pGEX4T1 contenente il gene cdpk1 in sequenza verificata. Preferiamo utilizzare lo stesso plasmide che è stato utilizzato per la trasformazione del ceppo pLysS di E. coli BLR(DE3).
  2. Progettare i primer per introdurre una mutazione gatekeeper nella sequenza genica cdpk1 wild-type. Il residuo gatekeeper wild-type (T145) è codificato da un codone ACC nel gene cdpk1 . Sostituire il gatekeeper della treonina con residui di gatekeeper piccoli (serina, T145S) e ingombranti (metionina, T145M) codificati rispettivamente dai codoni AGC e ATG.
  3. Seguire le linee guida indicate di seguito per progettare i primer diretti e inversi per la mutagenesi sito-specifica.
    1. Assicurati che entrambi i primer siano complementari l'uno all'altro. Mantenere 15-20 nucleotidi di sequenza non modificata su entrambi i lati della mutazione. Assicurarsi che la Tm sia compresa tra 50 °C e 55 °C per la sequenza, escluso il sito mutato.
  4. Utilizzare il kit di mutagenesi sito-specifica per generare i costrutti mutanti gatekeeper di cdpk1. Seguire le istruzioni del produttore per introdurre la mutazione desiderata. I primer utilizzati per la mutagenesi sito-specifica sono elencati nella Tabella 1.
  5. Trattare la miscela di reazione con l'enzima 0,5 μL di DpnI (20.000 U/mL) per digerire il plasmide metilato parentale. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 3 ore. Trasformare le cellule competenti di E. coli DH5α con la miscela di reazione trattata con DpnI.
  6. Esaminare quattro cloni di costrutti plasmidici T145M e T145S per verificare l'introduzione della mutazione desiderata nella sequenza genica cdpk1 attraverso il sequenziamento del DNA.
  7. Trasformare i plasmidi verificati in sequenza nel ceppo pLysS di E. coli BLR(DE3) per l'espressione delle proteine ricombinanti CDPK1 T145M/S come descritto nel passaggio 1.5.
  8. Esprimere e purificare le proteine mutanti CDPK1 gatekeeper seguendo i passaggi descritti nella sezione 2 per la proteina CDPK1 wild-type.

4. Saggio in vitro dell'attività chinasica di CDPK1

NOTA: L'attività chinasica di CDPK1 wild-type ricombinante e delle proteine mutanti gatekeeper è valutata mediante un approccio di marcatura semisintetica degli epitopi come descritto da Allen et al.34.

  1. Incubare 50 ng di proteina ricombinante nel tampone contenente 50 mM di Tris, 50 mM di MgCl2, 1x cocktail di inibitori del fosfato con 2 μg di proteina basica della mielina (MBP) come substrato esogeno di CDPK1 nella miscela di reazione totale di 50 μL.
  2. A seconda delle condizioni che richiedono la presenza o l'assenza di calcio, aggiungere rispettivamente CaCl2 o EGTA per ottenere la concentrazione finale di 2,5 mM ciascuno nel tampone del saggio chinasi. Aggiungere ATPγS alla concentrazione finale di 100 μM al tampone per utilizzarlo come fonte del gruppo fosfato terminale trasferibile.
  3. Incubare la miscela di reazione a 30 °C in un bagno d'acqua per 1 ora, quindi terminare la reazione con l'aggiunta di 5 mM di EGTA. Aggiungere 5 μl di 50 mM di p-nitrobenzil mesilato (PNBM) alla miscela di reazione e lasciarla incubare a 20 °C in bagnomaria per 2 ore per l'alchilazione dei residui fosforilati di serina e treonina nella transfosforilazione MBP e CDPK1 autofosforilata.
  4. Ai 55 μl totali di miscela di reazione, aggiungere 19 μl di tampone campione SDS 4x e riscaldare a 95 °C per 5 minuti.

5. Analisi Western blot per rilevare i prodotti tiofosforilati del saggio in vitro della chinasi

  1. Preparare il gel SDS-PAGE al 12% e caricare 15 μl di ciascun campione. Separare la miscela di reazione per visualizzare CDPK1 autofosforilato e MBP transfosforilato.
  2. Trasferire le proteine separate dal gel SDS-PAGE a una membrana PVDF utilizzando il metodo di trasferimento a umido32.
  3. Bloccare i siti aspecifici sulla membrana PVDF incubandola con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con Tris (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) contenente lo 0,05% di Tween 20 per 1 ora a RT.
  4. Incubare la membrana in PVDF con l'anticorpo primario di coniglio contro gli addotti tiofosforilati alchilati a una diluizione 1:2.500 per una notte a 4 °C nel tampone bloccante.
  5. Dopo l'incubazione notturna, lavare il blot 3 volte con soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 allo 0,05% per 10 minuti ciascuno.
  6. Incubare ulteriormente il blot con anticorpo secondario anti-coniglio di capra in tampone bloccante a una diluizione di 1:5.000 per 1 ora a RT, seguito da lavaggio con soluzione fisiologica tamponata con Tris contenente lo 0,05% di Tween 20.
  7. Sovrapporre il blot con un substrato chemiluminescente mescolando una proporzione uguale di soluzione A e soluzione B secondo le istruzioni del produttore ed esporre su pellicola a raggi X in una camera oscura per ottenere segnali di autofosforilazione CDPK1 e transfosforilazione MBP.

6. Clonazione della sequenza guida per il targeting dellocuscdpk1 per l'introduzione della sostituzione gatekeeper  

NOTA: La sequenza guida di 20 nucleotidi è stata selezionata mediante cura manuale e clonata nel plasmide pL6eGFP nel sito BtgZI impiegando i seguenti passaggi.

  1. Digestione di pL6eGFP utilizzando l'enzima BtgZI
    1. Digerire 1 μg di plasmide35 pL6eGFP con 1 μL di enzima BtgZI (5.000 unità/mL) per 4 ore a 60 °C in una miscela di reazione di 20 μL, seguendo il protocollo del produttore dell'enzima per le condizioni di reazione.
    2. Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, eseguire il plasmide digerito su un gel di agarosio all'1% e asportare il pezzo di gel (~ 9,8 kb) contenente il plasmide digerito. Purificare il plasmide digerito utilizzando un kit di estrazione con gel a colonna secondo le istruzioni del produttore.
  2. Ricottura di oligo
    1. Ricostituire gli oligonucleotidi (Ck1GUIDEFWD e Ck1GUIDEREV) in acqua priva di DNasi/RNasi per preparare una soluzione madre da 100 μM.
    2. Combinare 20 μM di ciascun oligonucleotide in una soluzione contenente 10 mM di Tris (pH 8,0), 50 mM di NaCl e 1 mM di EDTA. Incubare la miscela a 95 °C in un bagno asciutto per 5 minuti e lasciare raffreddare la reazione a temperatura ambiente. Di solito ci vuole 1 ora perché la temperatura della miscela di reazione raggiunga RT.
    3. Diluire gli oligonucleotidi ricotti a 0,5 μM in Tris pH 8,0, ottenendo un volume totale della miscela di reazione di 100 μL.
  3. Reazione di fusione
    1. Combinare 1,5 μl di oligonucleotidi diluiti con 100 ng di plasmide linearizzato digerito da BtgZI in 5 premiscele enzimatiche In-Fusion in un volume di reazione totale di 10 μl per generare una guida CDPK1 contenente plasmide pL6CK1G.
    2. Incubare la reazione per 15 minuti a 50 °C. Conservare la reazione a 4 °C fino a procedere con la trasformazione di E. coli.
      NOTA: Per la conservazione a lungo termine, la miscela di reazione può essere conservata a -20 °C.
  4. Trasformazione di E. Coli Cellule competenti stellari
    1. Aggiungere 2,5 μl della miscela di reazione all'E. Coli Stellare le cellule competenti e procedere con il processo di trasformazione seguendo il protocollo del produttore.
    2. Piastra le cellule competenti trasformate su piastra di ampicillina LB (100 μg/mL) e lascia che i batteri trasformati crescano a 37 °C durante la notte.
    3. Seleziona le colonie trasformate ed estrai il plasmide utilizzando un kit di miniprep plasmidico disponibile in commercio. Seguire le istruzioni del produttore per la purificazione dei plasmidi. Convalidare l'inserimento della guida nel plasmide attraverso il sequenziamento del DNA Sanger.

7. Clonaggio del braccio di omologia per la riparazione del locus cdpk1 ristretto all'endonucleasi Cas9

NOTA: Viene sintetizzato commercialmente un braccio di omologia comprendente gli SNP da introdurre nel locus bersaglio. Di solito prendiamo un braccio di omologia di 400-1000 bp di lunghezza. Il braccio di omologia contiene mutazioni silenti nella regione dell'RNA guida e nella PAM per prevenire il ritaglio del locus modificato dopo l'incorporazione degli SNP desiderati. Il braccio di omologia (corrispondente ai nucleotidi da 133 a 553 di CDPK1), che incorpora mutazioni Met o Ser gatekeeper e mutazioni silenti, è affiancato da siti di restrizione AflII e SpeI.

  1. Digerire due volte 1 μg di pL6CK1G e il plasmide contenente il braccio di omologia utilizzando 0,5 μl ciascuno di enzimi di restrizione AflII (20.000 U/ml) e SpeI (20.000 U/ml) per 4 ore a 37 °C in una miscela di reazione di 20 μl.
  2. Eseguire la reazione completa dei plasmidi a doppia digestione su gel di agarosio all'1,5% e purificare le bande corrispondenti al braccio di omologia e alla spina dorsale plasmidica di pL6CK1 utilizzando un kit di estrazione su gel seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Legare il braccio di omologia digerito con 100 ng di plasmide pL6CK1 in un rapporto vettore-inserto di 1:5 in un volume di reazione totale di 10 μL utilizzando la DNA ligasi T4. Incubare la reazione di legatura per una notte a 16 °C. Trasformare le cellule competenti di E. coli DH5α con la miscela di legatura completa secondo le istruzioni del produttore.
  4. Piastra le cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti ampicillina (100 μg/mL) per selezionare i trasformanti positivi. Seleziona singole colonie dalla piastra di ampicillina LB e purifica il plasmide utilizzando un kit di estrazione del plasmide.
  5. Confermare la presenza del braccio di omologia del clone digerendo il plasmide purificato con gli enzimi AflII e SpeI utilizzando le stesse condizioni di digestione descritte al punto 7.3. Confermare ulteriormente i cloni positivi alla doppia digestione mediante sequenziamento del DNA Sanger per convalidare la sequenza completa del braccio di omologia.

8. Purificazione dei plasmidi pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1 per la trasfezione del parassita della malaria

  1. Impostare 5 mL di colture primarie di cloni verificati in sequenza di pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1 in terreno LB contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare per 10 ore. Trasferire la coltura primaria nella coltura secondaria con un rapporto di 1:1000 e incubare per altre 12 ore.
  2. Pellettare la coltura batterica mediante centrifugazione a 5000 x g per 10 minuti in un flacone da centrifuga.
  3. Isolare i plasmidi utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi secondo il protocollo del produttore. Sciogliere il DNA plasmidico in acqua priva di DNasi/RNasi per la trasfezione diretta del parassita.

9. Coltura in vitro di Plasmodium falciparum e sincronizzazione del sorbitolo per la trasfezione

NOTA: La coltura in vitro di P. falciparum in globuli rossi umani (RBC) viene eseguita secondo il metodo delineato da Trager e Jensen36.

  1. Propagare il ceppo NF54 di P. falciparum coltivando in globuli rossi umani O+ a un ematocrito del 2% in terreno RPMI completo (cRPMI) contenente RPMI 1640 integrato con L-glutammina, 25 mM HEPES, 25 mM di bicarbonato di sodio e 50 μg/mL di ipoxantina. Integrare il terreno con AlbuMAX II allo 0,5% e 10 μg/mL di gentamicina e mantenere la coltura a 37 °C in un'atmosfera di 5% O2, 5% CO2 e 90% N2.
  2. Per la sincronizzazione del sorbitolo per ottenere il parassita dello stadio ad anello, pellettare i parassiti asincroni in una provetta conica da 50 mL mediante centrifugazione a 2.300 x g per 3 minuti a RT. Scartare il surnatante.
  3. Incubare i globuli rossi parassitizzati con 9 volumi di sorbitolo al 5% per 10 minuti a 37 °C. Dopo l'incubazione, pellettare i globuli rossi mediante centrifugazione a 2.300 x g per 3 minuti e scartare il sorbitolo.
  4. Lavare i parassiti trattati con sorbitolo con RPMI incompleto, iRPMI (terreni RPMI senza albumax e bicarbonato di sodio) e successivamente incubarli in cRPMI. Utilizzare i parassiti dello stadio ad anello nel ciclo successivo per la trasfezione plasmidica.

10. Trasfezione di parassiti allo stadio anulare con plasmidi pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1

NOTA: I seguenti passaggi sono impiegati per la trasfezione diretta di parassiti allo stadio anulare con DNA plasmidico.

  1. Preparare 2 tamponi cytomix37 sciogliendoli in 30 mL di acqua, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 e 50 mM HEPES. Regolare il pH a 7,6. Regolare il volume finale a 50 ml. Filtro Sterilizzare il tampone utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm. Quindi, diluire il tampone 2x cytomix con acqua sterile per ottenere un tampone 1x cytomix.
  2. In una provetta conica sterile da 15 mL, aggiungere 100 μL di globuli rossi parassitati ad anello confezionati e lavarli 2 volte con 5 mL di tampone 1x Cytomix. Eseguire i lavaggi per centrifugazione a 994 x g per 3 min a RT.
  3. Dopo il lavaggio, rimuovere il tampone e aggiungere 50 μg di ciascun plasmide (pL6CK1Met/pUF1 per generare la mutazione T145M e pL6CK1Ser/pUF1 per generare la mutazione T145S) nei globuli rossi parassitati impaccati. Quindi, aggiungere 2 tamponi in base al volume del plasmide e regolare il volume a 400 μl con una concentrazione di tampone 1x.
  4. Trasferire 400 μl della soluzione di cui sopra in cuvette da 0,2 cm per ogni trasfezione. Elettroporazione utilizzando le seguenti condizioni: 0,31 kV, 950 μF e resistenza impostata su Infinito.
  5. Dopo l'elettroporazione, rimuovere i parassiti trasfettati dalla cuvetta, mescolarli con cRPMI e trasferirli in un pallone T25 con un volume totale di 15 ml. Incubare i parassiti per 2 ore nelle condizioni menzionate al punto 9.1.
  6. Dopo l'incubazione, trasferire i parassiti trasfettati in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 994 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e lavare i parassiti con 10 ml di RPMI incompleto. Coltivali con cRPMI fresco per 2 giorni, reintegrando il terreno di coltura dopo 24 ore.
  7. Dopo 48 ore, rimuovere il cRPMI da ciascun pallone e risospendere la coltura in cRPMI contenente 2 nM di WR99210 e 150 nM di DSM26738. Quindi, trasferire la coltura in un pallone T75 aggiungendo 400 μl di globuli rossi freschi. Rifornire quotidianamente il terreno con cRPMI contenente WR99210 e DSM267 per 7 giorni. Successivamente, aggiungere cRPMI contenente entrambi i farmaci a giorni alterni fino al giorno 14 dopo la trasfezione.
  8. Il giorno 14, aliquotare 200 μL di coltura trasfettata in 1,5 mL di provetta per microcentrifuga (MCT) per la preparazione del vetrino. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante e trasferire le cellule sul vetrino. Fai una sbavatura usando un altro vetrino posizionandolo a un angolo di 45°.
  9. Fissare il vetrino in metanolo e preparare la colorazione Giemsa diluendola 1:10 in acqua ultrapura. Quindi, colorare il vetrino immergendolo completamente nel colorante Giemsa per 20 minuti. Lavare lo scivolo sotto l'acqua corrente e asciugarlo accuratamente. Quindi, osservare il vetrino al microscopio ottico con un ingrandimento di 100x applicando olio da immersione.
  10. Una volta visualizzati i parassiti, rifornisci i terreni ogni giorno e lasciali crescere per 2-3 giorni. Quindi, rimuovere i parassiti per verificare la modifica desiderata nella sequenza genica bersaglio nel locus bersaglio.
    NOTA: Se i parassiti non sono visibili il giorno 14, reintegrare il terreno (contenente entrambi i farmaci) dopo 4 giorni. Taglia il parassita del 30% e aggiungi sangue fresco per mantenere il 2% di ematocrito ogni 7 giorni fino a quando i parassiti non ricompaiono.

11. Verifica PCR del parassita transgenico con modifica desiderata del locus cdpk1

  1. Dopo 2-3 giorni di crescita dei parassiti, prelevare 500 μL di coltura e trasferirli in un MCT da 1,5 mL.
  2. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 2.400 x g per 5 min. Quindi, lisare i globuli rossi mediante trattamento con saponine.
    1. Per il trattamento con saponine, aggiungere 10 μL di soluzione di saponina al 10% a 1 mL di pellet di antiparassitario risospeso e mantenere a 4 °C per 5 minuti. Centrifugare le celle a 2.400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio fino a quando il rossore non scompare completamente e si ottiene una pallina di parassiti di colore nero.
  3. Lavare il pellet antiparassitario con 1 mL di 1x PBS mediante centrifugazione a 2.400 x g per 5 min. Successivamente, risospendere il pellet in 50 μL di acqua priva di DNasi/RNasi. Riscaldare il pellet di parassita risospeso a 95 °C per 5 minuti, quindi centrifugare a 16.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante contenente il DNA del parassita in una nuova provetta.
  4. Utilizzare il materiale genetico di cui sopra per amplificare con la PCR l'intera lunghezza del gene utilizzando il set di primer ck1f1 e ck1r3wt (vedi Tabella 1), mirando specificamente alla regione al di fuori del braccio di omologia come descritto sopra nel passaggio 1.2. Sequenziare la regione di omologia contenente la mutazione T145M utilizzando il primer ck1f1 .

12. Diluizione limitante per l'ottenimento di parassiti clonali transgenici

  1. Dopo la verifica della sequenza, diluire la coltura di parassita trasfettata per ottenere una concentrazione finale di 1 parassita per 200 μl. Quindi, aggiungere 100 μl della coltura diluita ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Eseguire i seguenti passaggi (12,2-12,4) per ottenere 1 parassita/200 μL.
  2. Preparare 10 ml di globuli rossi parassitati con ematocrito al 2%. Stimare la percentuale di parassitemia della coltura utilizzando il metodo di colorazione Giemsa descritto sopra. Quindi, contare il numero totale di globuli rossi in una coltura diluita 1:100 utilizzando un emocitometro.
    Numero totale di globuli rossi/mL = Numero medio di globuli rossi contati x Fattore di diluizione x 104
    Numero di globuli rossi parassitati/mL = (percentuale di parassitemia x Numero totale di globuli rossi/mL)/100
  3. Preparare una diluizione 1:10.000 di globuli rossi parassitizzati diluendo in serie la coltura iniziale 2 volte (diluizione 1:100 ciascuna).
  4. Aggiungere un volume appropriato (in microlitri) dalla coltura diluita per ottenere un totale di 50 parassiti in 10 mL di terreno, garantendo il 2% di ematocrito. Quindi, aggiungere 100 μl del terreno contenente 50 parassiti a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Porre la piastra in un secador ermetico lavato con gas miscelato (composizione come descritto sopra al punto 9.1) e incubare a 37 °C. Sostituire il supporto ogni 2 giorni.
  5. Sostituire il terreno con cRPMI contenente il 2% di ematocrito ogni 7giorni fino alla comparsa dei parassiti.
    1. Inclinare la piastra a 96 pozzetti a un angolo di 45° e lasciare che i globuli rossi si stabilizzino. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cura il terreno da ciascun pozzetto e osservare un cambiamento di colore verso il giallo nei pozzetti contenenti parassiti, in contrasto con il colore rosa dei terreni nei pozzetti privi di parassiti. Questo cambiamento di colore si verifica perché i parassiti acidificano il mezzo.
  6. Dopo aver osservato il cambiamento di colore, estrarre una piccola quantità di coltura dal pozzetto che mostra il cambiamento di colore e preparare una sbavatura su un vetrino, etichettandola con un numero corrispondente alla posizione del pozzetto. Colorare il vetrino con la macchia Giemsa e osservarlo al microscopio come descritto sopra.
  7. Trasferire il contenuto del pozzetto in un pallone T25 dove sono stati osservati i parassiti al microscopio. Lasciare che i parassiti crescano nel pallone T25 per 4-5 giorni e reintegrare il terreno a giorni alterni.
  8. Una volta che la parassitemia raggiunge il 2-3%, estrarre 500 μL di coltura del parassita. Quindi, saponin-lissi dei globuli rossi e procedere all'estrazione del materiale genetico del parassita utilizzando il metodo descritto nella sezione 11.
  9. Per confermare la generazione di parassiti clonali transgenici, impostare una reazione PCR come descritto sopra nella fase 1.1.1 e inviare il prodotto PCR per il sequenziamento del DNA per confermare l'introduzione degli SNP desiderati nel locus target.

13. Analisi del trascritto mediante PCR in tempo reale

  1. Purificazione e sincronizzazione dei parassiti con percoll/sorbitolo
    1. Preparare un gradiente di percoll/sorbitolo39,40 stratificando in sequenza 3 mL ciascuno di 70% seguito da soluzioni al 40% di percoll/sorbitolo in una provetta conica da 15 mL.
    2. Sovrapporre delicatamente 1-2 mL di coltura di parassiti contenente prevalentemente il parassita allo stadio schizonte di WT e CDPK1 T145M sopra il gradiente.
    3. Centrifugare il gradiente a 2.300 x g per 15 minuti a RT utilizzando la deaccelerazione impostata a 4 in centrifuga in un rotore a secchiello oscillante.
    4. Raccogliere l'anello centrale contenente gli stadi di trofozoite e schizonte del parassita dall'interfaccia del gradiente in una provetta conica fresca da 50 mL.
    5. Lavare i parassiti aggiungendo un volume uguale di 9:1 (cRPMI:10xPBS), quindi centrifugare a 994 x g per 3 minuti per pellettare i parassiti.
    6. Lavare nuovamente il pellet con una soluzione di 19:1 (cRPMI:10xPBS), quindi centrifugare a 994 x g per 3 minuti.
    7. Aggiungere ciascun pellet di parassita in fiasche separate contenenti cRPMI con ematocrito al 2% (pre-incubato a 37 °C). Incubare i flaconi per 4 ore nelle condizioni descritte sopra al punto 9.1 per consentire l'invasione dei merozoiti dagli schizonti arricchiti in globuli rossi freschi.
    8. Dopo 4 ore, trattare i parassiti con sorbitolo come descritto sopra nei passaggi 9.2-9.4 per ottenere parassiti altamente sincronizzati 0 - 4 ore allo stadio dell'anello.
    9. Incubare i parassiti sincronizzati per 44 ore dopo il trattamento con sorbitolo per ottenere lo stadio schizonte di 44 - 48 ore del parassita.
  2. Isolamento dell'RNA dagli schizonti di entrambi i parassiti WT e CDPK1 T145M
    1. Raccogli i parassiti WT e CDPK1 T145M a 44-48 ore dopo l'invasione. Lavare i pellet antiparassitari con 1x PBS a 994 x g per 5 minuti a 4 °C.
    2. Risospendere i pellet di parassiti in 1 mL di 1x PBS e trattarli con saponina per lisare i globuli rossi circostanti come descritto al punto 11.2.1.
    3. Risospendere il pellet del parassita in 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA e conservarlo a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
    4. Scongelare il pellet congelato a 15-30 °C per la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.
    5. Aggiungere 200 μL di cloroformio per mL di reagente di estrazione dell'RNA e agitare energicamente le provette a mano per 15 s. Incubare a RT per 2-3 min.
    6. Centrifugare la miscela a 16.200 x g per 15 minuti a 4 °C. L'RNA rimarrà esclusivamente nello strato acquoso superiore incolore. Isolare l'RNA utilizzando un kit secondo le istruzioni del produttore.
  3. Sintesi di cDNA dall'RNA del parassita WT e CDPK1 T145M
    1. Trattare i campioni contenenti RNA con un kit di rimozione del DNA seguendo le istruzioni del produttore per rimuovere il DNA contaminante.
    2. Sintetizzare il cDNA dai campioni di RNA isolati utilizzando un kit di sintesi del cDNA secondo il protocollo del produttore. Utilizziamo primer esamero casuali per il processo di trascrizione inversa invece di primer oligo-dT.
    3. Assicurarsi che i controlli NO-RT (reazioni impostate senza l'aggiunta dell'enzima trascrittasi inversa) per ogni campione di RNA utilizzato per la preparazione del cDNA escluda il carryover della contaminazione del DNA genomico dall'RNA purificato durante la preparazione del cDNA.
    4. Testare il cDNA amplificando qualsiasi segmento genico contenente una sequenza intronica intermedia, come il gene cdpk1 a lunghezza intera, per escludere la contaminazione del DNA genomico. Utilizzare la condizione PCR come descritto nel passaggio 1.1.1.
  4. Analisi dell'espressione del trascritto del parassita WT e CDPK1 T145M
    1. Utilizzare il cDNA preparato dai parassiti WT e CDPK1 T145M per condurre l'analisi dell'espressione del trascritto di 11 geni diversi attraverso la PCR in tempo reale. Gli 11 geni bersaglio includono 7 membri della famiglia CDPK e 4 chinasi coinvolte nell'invasione dei globuli rossi (vedere la Tabella 2 per i geni e i corrispondenti primer utilizzati per la PCR in tempo reale).
    2. Progetta primer utilizzando il software di sintesi dei primer. Amplificare circa 120 bp di ciascun gene selezionato utilizzando primer specifici per il gene con temperature di fusione simili.
    3. Amplificare i geni target utilizzando una premiscela ed eseguire la piastra su un sistema PCR in tempo reale utilizzando i seguenti parametri ciclici: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura a 52 °C per 20 s ed estensione a 62 °C per 30 s.
    4. Normalizzare il livello di espressione di ciascun gene utilizzando due geni housekeeping, la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e la treonina tRNA ligasi (ThrRS)32. Calcolare l'espressione relativa di ciascuna chinasi bersaglio nel parassita CDPK1 T145M rispetto al controllo WT.
    5. Eseguire l'analisi statistica utilizzando il pacchetto di analisi statistica R. In alternativa, utilizzare qualsiasi altro software di analisi.
      NOTA: I metodi di trascrittomica globale come l'RNA-Seq o il microarray sono approcci superiori per ottenere una visione più ampia del ricablaggio del trascrittoma nei parassiti mutanti rispetto al WT.

Risultati

La WT CDPK1 ricombinante è espressa come proteina di fusione con un tag N-terminale di glutatione S-transferasi (GST) e purificata mediante cromatografia di affinità GST. La proteina CDPK1 purificata è stata rilevata attraverso Western blot utilizzando anticorpi anti-CDPK1 e anti-GST (Figura 1). Il residuo gatekeeper della treonina (T145) in WT CDPK1 è stato sostituito con Met e Ser utilizzando la mutagenesi sito-specifica per generare rispettivamente pr...

Discussione

La generazione di un parassita transgenico mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 si basa sui dati di attività chinasica in vitro con enzimi ricombinanti. È meglio generare il maggior numero possibile di proteine ricombinanti mutanti con diversi residui gatekeeper. Poiché il genoma di P. falciparum è altamente ricco di AT, quindi, l'espressione di proteine ricombinanti in E. coli può richiedere l'ottimizzazione del codone. Ciò ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Riconosciamo il supporto e le strutture disponibili attraverso la Central Instrumentation Facility, School of Life Sciences, JNU. Si ringrazia anche il sostegno finanziario del Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) ad AB. Ringraziamo Jose-Juan Lopez-Rubio per aver fornito i plasmidi pL6eGFP e pUF1. L'agenzia di finanziamento non ha alcun ruolo nella preparazione e nella decisione di pubblicare l'opera. MS ha ricevuto una borsa di studio JRF-SRF dal Council for Scientific and Industrial Research.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

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