הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

Summary

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

Abstract

אחד המנגנונים לערעור השפעת התרופות על ידי טפיל המלריה הוא באמצעות חיווט מחדש של התעתיק שלו. ההשפעה בולטת יותר עבור גני מטרה השייכים למשפחת הרב-גנים. פלסמודיום פלציפרום חלבון קינאזות השייכות למשפחת CDPK חיוניות להתפתחות שלב הדם. ככאלה, CDPK נחשבים למטרות טובות לפיתוח תרכובות נגד מלריה. הגישה הגנטית הכימית שימשה בעבר להבהרת תפקודם של חלבונים קינאזים באיקריוטים גבוהים יותר. זה דורש החלפה של שאריות שומר הסף בחומצת אמינו אחרת עם שרשרת צדדית אחרת באמצעות מניפולציה גנטית. החלפת חומצות אמינו בעמדת שומר הסף מווסתת את הפעילות של חלבון קינאז ומשנה את רגישותו לסוג מסוים של תרכובות הידועות כמעכבי קינאז גבשושיות (BKIs) המסייעות בזיהוי פונקציונלי של גן המטרה. כאן, ניצלנו את הגישה הגנטית הכימית כדי להבין מנגנוני פיצוי שהתפתחו על ידי טפיל מוטנטי בעל אלל היפומורפי של cdpk1. בסך הכל, הגישה שלנו מסייעת בזיהוי מסלולי פיצוי שעשויים להיות ממוקדים בו זמנית כדי למנוע התפתחות עמידות לתרופות נגד קינאזות בודדות.

Introduction

מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות המובילות האחראית למיליוני מקרי מוות מדי שנה, במיוחד אצל ילדים מתחת לגיל⁵ שנים. אין חיסון זמין קלינית נגד מלריה. יתר על כן, פלסמודיום פלציפרום, טפיל המלריה האנושי הקטלני ביותר, ידוע כבעל עמידות נגד התרופה בקו החזית הנקראת ארטמיסינין 2,3,4,5. יש צורך דחוף לזהות מטרות חדשות לתרופות ואסטרטגיות חדשות שניתן לפרוס במהירות כדי למנוע את התפשטות עמידות ארטמיסינין ברחבי העולם. הבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של תרופות והבסיס המולקולרי של מסלולי פיצוי יכולה....

Protocol

ה-P. זן טפיל פלציפרום (NF54) התקבל מאלברו מולינה קרוז 21,32,33. O⁺ תאי דם אדומים אנושיים המשמשים לתרבית הטפילים התקבלו ממרכז הדם רוטרי, ניו דלהי, הודו. הפלסמידים, pL6eGFP ו-pUF1, התקבלו מחוסה-חואן לופז-רוביו. DSM267 התקבל מ מרגרט א 'פיליפס ו Pradipsinh ק Rathod. WR99210 סופק על ידי חברת התרופות ג'ייקובוס.

1. בניית פלסמיד לביטוי CDPK1 רקומביננטי ב- Escherichia coli

1. תכנן את זוג הפריימר אוליגונוקלאוטיד כדי להגביר את ה- CDS המלא של הגן

תוצאות

WT CDPK1 רקומביננטי מבוטא כחלבון היתוך עם תג N-terminal Glutathione S-transferase (GST) ומטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה GST. חלבון CDPK1 המטוהר זוהה באמצעות כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד CDPK1 ונוגדנים נגד GST (איור 1). שאריות שומר הסף של תראונין (T145) ב-WT CDPK1 הוחלפו ב-Met וב-Ser תוך שימוש במ?.......

Discussion

יצירת טפיל מהונדס מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 מבוססת על נתוני פעילות קינאז במבחנה עם אנזימים רקומביננטיים. עדיף לייצר כמה שיותר חלבונים רקומביננטיים מוטנטיים עם שאריות שוער שונות ככל האפשר. מכיוון שהגנום P. falciparum עשיר מאוד ב-AT, לכן, ביטוי של חלבונים ר?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570