植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解

要約

化学遺伝学では、標的遺伝子座においてゲートキーパー残基を異なる側鎖を含むアミノ酸に置き換えることが含まれます。ここでは、 cdpk1 の低型対立遺伝子を含む突然変異寄生虫を作製し、その突然変異体背景において寄生虫が採用する代償性経路を特定しました。

要約

マラリア原虫による薬物の影響を覆すメカニズムの1つは、トランスクリプトームの再配線によるものです。この効果は、多重遺伝子ファミリーに属する標的遺伝子に対してより顕著です。CDPKファミリーに属する 熱帯熱マラリア原虫 プロテインキナーゼは、血液病期の発達に不可欠です。そのため、CDPKは抗マラリア化合物の開発に適したターゲットと考えられています。化学遺伝学のアプローチは、高等真核生物におけるプロテインキナーゼの機能を解明するために歴史的に使用されてきました。これには、遺伝子操作を通じてゲートキーパー残基を異なる側鎖を持つ別のアミノ酸に置き換える必要があります。ゲートキーパー位でのアミノ酸置換は、プロテインキナーゼの活性を調節し、標的遺伝子の機能的同定に役立つバンプキナーゼ阻害剤(BKI)として知られる特定のクラスの化合物に対する感受性を変化させます。ここでは、化学遺伝学のアプローチを利用して、 cdpk1の低形対立遺伝子を持つ突然変異寄生虫によって進化する代償メカニズムを理解しました。全体として、私たちのアプローチは、個々のキナーゼに対する薬剤耐性の発症を防ぐために同時に標的とされる可能性のある代償性経路を特定するのに役立ちます。

概要

マラリアは、毎年何百万人もの死者を出している主要な感染症の1つであり、特に5歳未満の子供1人^です。マラリアに対する臨床的に利用可能なワクチンはありません。さらに、ヒトで最も致命的なマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫は、アルテミシニン^2,3,4,5と呼ばれる最前線の薬に対する耐性を獲得したことが知られています。アルテミシニン耐性の世界的な蔓延を避けるために、迅速に展開できる新しい薬剤標的と新しい戦略を特定することが急務です。薬物作用のメカニズムと代償経路の分子基盤をよりよく理解することは、薬剤耐性の発症を回避するためのより良い戦略を考案するのに役立ちます。

カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)ファミリーに属するプロテインキナーゼは、赤血球、性、および赤血球前期の寄生虫発生の多くの段階で重要です⁶。Pの無性複製中。falciparum、CDPK5は、成熟したシゾント⁷からのメロゾイトの出口に重要な役割を果たすことが知られています。CDPK5を条件付きで欠失させると、シゾントがメロゾイトを血流中に放出することができず、寄生虫の死につながります。CDPK5を介した寄生虫の排出の分子メカニズムは完全には理解されておらず、上流の調節因子としてプロテインキナーゼG(PKG)が関与していると考えられている^7,8。CDPK7は、環状寄生虫の栄養型⁹への成熟に不可欠です。CDPK4は、蚊の性期の発達に重要なCDPKファミリーの別のメンバーです。それは、鞭毛化過程中の複数のステップに関与しており、したがって、遊離運動性、雄性配偶子10,11,12,13の形成に重要である。CDPK1は、内膜複合体およびロプトリの成分をリン酸化します^14,15。さらに、CDPK1の条件付き欠失は、^RBC16の浸潤に関与するタンパク質の低リン酸化をもたらす。CDPK1は、浸潤過程における頂端オルガネラの排出を調節することが示されています¹⁷。CDPK1は、SERA5プロテアーゼ¹⁸をリン酸化することにより、感染したRBCからのメロゾイトの排出にも役立ちます。リン酸化CDPK1は、メロゾイトの頂端に優先的に局在し、そこで侵入プロセスに必要な他の寄生虫タンパク質と相互作用する可能性がある^19,20。CDPK1は、マラリアの伝播と蚊²¹内の寄生虫の性的発達にとって重要なステップである雄と雌の配偶子の形成にも関与しています。

化学遺伝学のアプローチは、歴史的に哺乳類のキナーゼの機能的役割の同定に使用されてきた^22,23。このアプローチでは、ゲートキーパー位置の残基を異なる側鎖のアミノ酸で置換します。ゲートキーパー残基の変化は、隣接するATPポケットのサイズを調節し、その結果、バンプキナーゼ阻害剤(BKI)と呼ばれる化合物の変異酵素へのアクセシビリティが野生型と比較して変化します。ゲートキーパー位置のかさばる残基を小さな残基に置き換えると、BKIへのアクセスが可能になり、逆置換によりキナーゼはBKIに耐性を持つようになります。場合によっては、ゲートキーパー残基の置換は、標的酵素のキナーゼ活性の低下と関連しており、修飾は機能研究に耐えられないものとなる^24,25。ゲートキーパー置換が酵素活性に及ぼす悪影響は、不耐性キナーゼ²⁵の第2部位にサプレッサー変異を生じさせることで逆転させることができる。化学遺伝学のアプローチは、アピコンプレックスタンパク質キナーゼの機能を研究するために利用されています。より小さなゲートキーパー残基を含む野生型CDPK4は、バンプキナーゼ阻害剤BKI-1および1294によって選択的に阻害され、雄性配偶子形成およびオーシスト発生のブロックにつながった^11,12。CDPK4の小さなゲートキーパー残基をかさばるメチオニン残基に置き換えると、鞭毛化におけるBKI媒介阻害が減少しました¹¹。マラリア原虫と近縁のアピコンプレックス寄生虫であるトキソプラズマ原虫のCDPK1は、タキゾイトによる宿主細胞の運動性と浸潤に関与していることが示された^26,27。野生型TgCDPK1の小さなゲートキーパーポケットを利用して、動物モデル^28,29の疾患病因を減少させる特異的阻害剤を設計した。P.の関与。熱帯熱マラリア分裂後期の発達および配偶子形成におけるプロテインキナーゼG(PKG)は、特異的な薬理学的阻害剤を用いて酵素の活性を阻害することによって実証された^30,31。ゲートキーパー位置のスレオニンをグルタミン(T618Q)に置き換えると、変異酵素の阻害剤に対する感受性が大幅に低下し、正常な配偶子形成およびシゾントからリングへの進行がもたらされた^30,31。

これまでの研究のほとんどは、標的キナーゼ11,12,22,23,26,30,31の機能特性評価に化学遺伝学のアプローチを利用してきましたが、プロテインキナーゼの低型対立遺伝子を保有する寄生虫における代償メカニズムの発達を理解するために、このアプローチを採用しました。我々は以前に、CDPK1の野生型ゲートキーパー残基をメチオニン(T145M)で置換すると、変異酵素³²のトランスリン酸化電位が~47%減少することを示した。cdpk1の低型対立遺伝子を含む変異寄生虫(cdpk1t145m)は、他のCDPKファミリーメンバーの転写再配線により、CDPK1の活性低下に予め適応されています。この戦略は、一般的に、必須プロテインキナーゼの低型対立遺伝子を含む変異寄生虫の代償メカニズムを解明するために利用できると考えています。標的キナーゼの機能を部分的に補償する他のキナーゼは、個々のキナーゼに対する薬剤耐性の発現を防ぐために、標的キナーゼと共に同時に阻害されてもよい。これは、マラリア対策のより良い戦略として役立つかもしれません。

プロトコル

Pです。熱帯熱マラリア原虫株(NF54)は、Alvaro Molina Cruz 21,32,33から入手した。寄生虫の培養に使用したO⁺ヒト赤血球は、インドのニューデリーにあるロータリー血液センターから入手しました。プラスミドであるpL6eGFPおよびpUF1は、Jose-Juan Lopez-Rubioから入手しました。DSM267は、Margaret A. PhillipsおよびPradipsinh K. Rathodから入手しました。WR99210はジェイコブス・ファーマシューティカル・カンパニーから提供されました。

1. 大腸菌における組換えCDPK1発現のためのプラスミドの構築

1. cdpk1遺伝子(PlasmoDBアクセッション番号)の完全なCDSを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーペアを設計します。PF3D7_0217500) プライマー解析ソフトウェアを使用する。
   1. Plasmodium falciparum から調製した cDNA をテンプレートとして 20 μL の反応容量で、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドペアである Pk1fpgex および Pk1rpgex (表 1 を参照) を含む DNA ポリメラーゼを使用して、完全な CDS を増幅します。PCR 増幅条件を次のように設定します: 98 °C で 2 分間の初期変性 (98 °C で 30 秒間の変性、52 °C で 20 秒間のアニーリング、 62°Cで20秒×36秒、最終62°Cで10分間延長。PCR産物は、さらに使用するまで4°Cで保存してください。
2. 増幅したPCR産物1 μgとpGEX4T1発現プラスミド1 μgをBamHI(20,000 U/mL)およびNotI(20,000 U/mL)制限エンドヌクレアーゼで3-4時間、総反応容量30 μLで37°Cで消化します。
3. ダブル消化されたPCR産物とプラスミドを精製するには、カラムベースのPCRクリーンアップキットを使用し、製造元の指示に従ってください。
4. 100 ngの二重消化精製pGEX4T1プラスミドをインサート付きでライゲーティングし、1 μLのT4 DNAリガーゼを10 μLの総反応量で使用して、1:5のベクター対インサートモル比でライゲーションします。ライゲーション反応を16°Cで一晩インキュベートします。
5. トランスフォーム E。 大腸菌 DH5αコンピテントセルとライゲーション混合物をメーカーのプロトコールに従って、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB寒天プレート上にプレート化。
6. 形質転換から得られた4つの細菌クローンを、メーカーの指示に従ってミニプラスミド精製キットを使用してプラスミドを精製することにより、組換えプラスミドの存在についてスクリーニングします。ステップ1.3で説明したように、BamHIとNotIを使用した二重制限消化により、組換えプラスミドを確認します。
7. さらに、Sanger DNAシーケンシングにより、制限酵素陽性クローンの正しい配列を確認します。トランスフォーム E。 大腸菌 BLR(DE3) pLysSコンピテントセルと、CDPK1タンパク質発現のための配列検証済みプラスミドコンストラクト。

2. 大腸菌における組換えCDPK1タンパク質の発現と精製

1. 組換えCDPK1の発現
   1. Eのクローンを1つ接種します。大腸菌配列検証済みプラスミドコンストラクトを含むBLR(DE3) pLysS株を、アンピシリン(100 μg/mL)を含む10 mLのLB培地に注入します。培養物を37°Cで一晩インキュベートし、200〜250rpmで振とうします。
   2. 一次培養液の1%を二次培養液に接種し、細菌細胞を37°Cの中対数期まで増殖させます。 二次培養物の光学密度(OD)が600 nmで0.7-0.9に達したら、1 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して完全長組換え CDPK1 の発現を誘導し、24°Cで10-12時間インキュベートします。
   3. インキュベーション後、 Eを収穫します。5,000 x gで10分間遠心分離することにより 、大腸菌 細胞を遠心分離します。上清をデカントし、細胞ペレットを保持します。
   4. 1 mM ジチオスレイトール(DTT)、0.1 mg/mL リゾチーム、1 mM EDTA、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の 1x プロテアーゼ阻害剤カクテルの組成で溶解バッファーを調製します。
   5. 細胞ペレットを溶解バッファーのペレット重量体積の10倍に再懸濁します。細胞懸濁液を9秒オン、15秒オフの間隔で15分間超音波処理して、タンパク質の変性につながる可能性のある局所的な加熱を防ぎます。
   6. ライセートを17,000 x g で1時間遠心分離し、透明な上清をグルタチオンビーズと4°Cで一晩インキュベートします。 以下のプロトコルに従って、精製された組換えCDPK1タンパク質を入手してください。
2. GSTタグ付きCDPK1の精製のためのグルタチオンビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィー
   1. 完全に再懸濁したグルタチオンビーズ500 μLを250 mLの細菌培養物に取り、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重にデカントします。
   2. ビーズを5 mLの結合バッファー(140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.3)で洗浄し、反転させて混合します。
   3. 500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去します。洗浄と遠心分離を3x-4x繰り返します。
   4. ビーズをバクテリア細胞ライセートに加え、4°Cで12時間インキュベートし、わずかに振とう(20-30 rpm)します。
   5. 500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去します。上清を保存して、結合していない組換えCDPK1の量を推定することができます。
   6. CDPK1結合ビーズを1 mM DTTを含むPBSで少なくとも5〜6回洗浄し、続いて50 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM DTT、pH 7.5で洗浄します。
   7. 結合したタンパク質を最初に250 μLの溶出バッファー1(EB1)で2回溶出し、次に2回250 μLの溶出バッファー2(EB2)で溶出します。EB1およびEB2の組成は、それぞれ50 mM Trisで10 mM還元グルタチオン、100 mM NaCl、pH 7.5および50 mM Trisで10 mM還元グルタチオン、100 mM NaCl、およびpH 7.5です。
   8. CDPK1結合ビーズを溶出バッファー1および2に室温(RT)で5〜10分間、穏やかに攪拌するか、エンドオーバーエンド回転させてインキュベートします。
   9. 500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、溶出したCDPK1組換えタンパク質を含む上清を別のチューブに慎重に移します。
   10. ステップ 2.2.8 と 2.2.9 を繰り返して、EB1 と EB2 の 2 つの溶出を得ます。

3. 組換えCDPK1ゲートキーパー変異タンパク質の作製に向けた部位特異的突然変異導入

1. 配列検証済み のcdpk1 遺伝子を含むpGEX4T1プラスミドを使用してください。私たちは、 大腸菌 BLR(DE3)pLysS株の形質転換に使用されたものと同じプラスミドを使用することを好みます。
2. 野生型cdpk1遺伝子配列にゲートキーパー変異を導入するためのプライマーを設計します。野生型ゲートキーパー残基(T145)は、 cdpk1 遺伝子のACCコドンによってコードされています。スレオニンゲートキーパーを、AGCコドンとATGコドンによってそれぞれコードされる小さな(セリン、T145S)およびかさばる(メチオニン、T145M)ゲートキーパー残基に置き換えます。
3. 以下のガイドラインに従って、部位特異的突然変異誘発のためのフォワードプライマーとリバースプライマーを設計してください。
   1. 両方のプライマーが互いに補完し合っていることを確認してください。突然変異の両側に未修飾配列の15-20ヌクレオチドを保持します。Tmが配列の50°Cから55°Cであることを確認してください(変異部位を除く)。
4. site-directed 突然変異誘発キットを使用して、 cdpk1 のゲートキーパー変異体コンストラクトを生成します。製造元の指示に従って、目的の突然変異を導入します。部位特異的突然変異誘発に用いるプライマーを 表1に示します。
5. 反応混合物を0.5 μL DpnI(20,000 U/mL)酵素で処理し、親のメチル化プラスミドを消化します。反応混合物を37°Cで3時間インキュベートし、 大腸菌 DH5αコンピテントセルをDpnI処理反応混合物で形質転換します。
6. T145MおよびT145Sプラスミドコンストラクトをそれぞれ4つのクローンでスクリーニングし、DNAシーケンシングを通じて cdpk1 遺伝子配列への所望の変異の導入を確認します。
7. ステップ1.5で説明したように、組換えCDPK1 T145M/Sタンパク質の発現のために 、大腸菌 BLR(DE3)pLysS株の配列検証済みプラスミドを形質転換します。
8. 野生型CDPK1タンパク質のセクション2に記載されている手順に従って、CDPK1ゲートキーパー変異タンパク質を発現および精製します。

4. CDPK1の in vitro キナーゼ活性アッセイ

注:組換え野生型CDPK1およびゲートキーパー変異タンパク質のキナーゼ活性は、Allenらによって記述されているように、半合成エピトープタグ付けアプローチによって評価されます.³⁴。

1. 50 mM Tris、50 mM MgCl₂、1x リン酸阻害剤カクテルと 2 μg のミエリン塩基性タンパク質 (MBP) を CDPK1 の外因性基質として含むバッファー中の 50 ng の組換えタンパク質を、50 μL の全反応混合物中でインキュベートします。
2. カルシウムの有無が必要な条件に応じて、CaCl₂ またはEGTAをそれぞれ添加し、キナーゼアッセイバッファーの最終濃度をそれぞれ2.5 mMにします。最終濃度100 μMのATPγSをバッファーに添加し、移動可能な末端リン酸基の供給源として使用します。
3. 反応混合物を30°Cの水浴で1時間インキュベートした後、5 mM EGTAを添加して反応を終了します。反応混合物に50 mM p-ニトロベンジルメシル酸塩(PNBM)5 μlを加え、トランスリン酸化MBPおよび自己リン酸化CDPK1のリン酸化セリン残基およびスレオニン残基のアルキル化のために、水浴中で20°Cで2時間インキュベートします。
4. 反応混合物の合計55 μLに、4x SDSサンプルバッファー19 μLを加え、95°Cで5分間加熱します。

5. in vitroキナーゼアッセイのチオリン酸化産物を検出するためのウェスタンブロット解析

1. 12% SDS-PAGEゲルを調製し、各サンプル15 μLをロードします。反応混合物を分離して、自己リン酸化CDPK1とトランスリン酸化MBPを可視化します。
2. 分離したタンパク質をSDS−PAGEゲルからPVDFメンブレンにウェットトランスファー法³²を用いて移す。
3. 0.05% Tween 20 を含む Tris-buffered saline(20 mM Tris-HCL、pH 7.5、150 mM NaCl)に 5% スキムミルクとインキュベートし、PVDF メンブレンの非特異的部位を RT で 1 時間インキュベートします。
4. PVDFメンブレンを、アルキル化チオリン酸化付加体に対するウサギ一次抗体と、ブロッキングバッファー中で1:2,500希釈、4°Cで一晩インキュベートします。
5. 一晩インキュベートした後、ブロットをトリス緩衝生理食塩水(0.05% Tween 20)で3回洗浄し、それぞれ10分間洗浄します。
6. ブロッキングバッファー中のヤギ抗ウサギ二次抗体とブロットをさらにインキュベートし、1:5,000希釈で室温で1時間、その後、0.05%Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄します。
7. 製造元の指示に従って、溶液Aと溶液Bを等の割合で混合することにより、ブロットを化学発光基質で重ね、暗室のX線フィルムに露光して、CDPK1の自己リン酸化とMBPトランスリン酸化のシグナルを取得します。

6.ゲートキーパー置換導入のためのcdpk1遺伝子座を標的とするガイド配列のクローニング  

注:20ヌクレオチドのガイド配列をマニュアルキュレーションで選択し、以下の手順を用いてBtgZIサイトのpL6eGFPプラスミドにクローニングしました。

1. BtgZI酵素を用いたpL6eGFPの消化
   1. pL6eGFP プラスミド³⁵ 1 μg と 1 μL の BtgZI 酵素 (5,000 units/mL) を 20 °C の反応混合物中で 4 時間消化します。これは、酵素メーカーの反応条件に関するプロトコールに従って行われます。
   2. 4時間のインキュベーション期間後、消化プラスミドを1%アガロースゲル上で実行し、消化プラスミドを含むゲル片(~9.8 kb)を取り出します。カラムベースのゲル抽出キットを使用して、メーカーの指示に従って消化したプラスミドを精製します。
2. オリゴのアニーリング
   1. オリゴヌクレオチド(Ck1GUIDEFWDおよびCk1GUIDEREV)をDNase/RNaseフリー水に再構成し、100 μMのストック溶液を調製します。
   2. 各オリゴヌクレオチド20 μMを、10 mM Tris(pH 8.0)、50 mM NaCl、および1 mM EDTAを含む溶液に組み合わせます。混合物を95°Cのドライバスで5分間インキュベートし、反応を室温まで冷まします。反応混合物の温度がRTに達するには、通常1時間かかります。
   3. アニーリングしたオリゴヌクレオチドをTris pH 8.0で0.5 μMに希釈すると、反応混合物の総容量が100 μLになります。
3. 融合内反応
   1. 希釈したオリゴヌクレオチド1.5 μLとBtgZI消化直鎖状プラスミド100 ngを5x In-Fusion酵素プレミックス中で、総反応容量10 μLで組み合わせ、pL6CK1Gプラスミドを含むCDPK1ガイドを作製します。
   2. 反応液を50°Cで15分間インキュベートします。 Eの形質転換が進行するまで、反応を4°Cで保存します。 大腸菌。
      注:長期保存の場合、反応混合物は-20°Cで保存できます。
4. Eの変身。大腸菌Stellarコンピテントセル
   1. 反応混合物2.5μLを Eに加えます。 大腸菌 Stellarコンピテントセルを使用し、メーカーのプロトコルに従って形質転換プロセスを進めます。
   2. 形質転換コンピテントセルをLBアンピシリン(100 μg/mL)プレートに播種し、形質転換細菌を37°Cで一晩増殖させます。
   3. 形質転換コロニーを選択し、市販のプラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドを抽出します。プラスミド精製については、製造元の指示に従ってください。プラスミドへのガイドの挿入をサンガーDNAシーケンシングにより検証します。

7. Cas9エンドヌクレアーゼ制限型cdpk1遺伝子座の修復のためのホモロジーアームのクローニング

注:標的遺伝子座に導入されるSNPを含む相同性アームは、商業的に合成される。通常、長さが400〜1000 bpの相同性アームを取ります。相同性アームには、ガイドRNA領域とPAMにサイレント変異が含まれており、目的のSNPを取り込んだ後の修飾遺伝子座の再切断を防ぎます。相同性アーム(CDPK1のヌクレオチド133〜553に対応)は、MetまたはSerゲートキーパー変異およびサイレント変異を組み込んでおり、AflIIおよびSpeI制限部位に隣接しています。

1. pL6CK1G1G1G1Gと相同性アームを含むプラスミドを、AflII(20,000 U/ml)およびSpeI(20,000 U/ml)制限酵素各0.5 μLを用いて、20 μLの反応混合物中で37°Cで4時間ダブルダイジェストします。
2. 1.5 % アガロースゲル上で二重消化プラスミドの全反応を実行し、製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用して pL6CK1 の相同性アームおよびプラスミド骨格に対応するバンドを精製します。
3. T4 DNAリガーゼを使用して、消化したホモロジーアームを100 ngのpL6CK1プラスミドとベクター対インサート比1:5でライゲーションします。ライゲーション反応を16°Cで一晩インキュベートします。 大腸菌 DH5αコンピテントセルを、製造元の指示に従って完全なライゲーション混合物で形質転換します。
4. 形質転換細胞をアンピシリン(100 μg/mL)を含むLB寒天プレートに播種し、陽性の形質転換体を選択します。LBアンピシリンプレートから単一コロニーを選択し、プラスミド抽出キットを使用してプラスミドを精製します。
5. ステップ7.3で説明したのと同じ消化条件を使用して、精製したプラスミドをAflIIおよびSpeI酵素で消化することにより、クローンの相同性アームの存在を確認します。サンガーDNAシーケンシングにより、二重消化陽性クローンをさらに確認し、相同性アームの完全な配列を検証します。

8. マラリア原虫トランスフェクションのためのpL6CK1Met、pL6CK1Ser、pUF1プラスミドの精製

1. pL6CK1Met、pL6CK1Ser、およびpUF1の配列検証済みクローンの一次培養物5 mLをアンピシリンを含むLB培地(100 μg/mL)にセットし、10時間インキュベートします。一次培養物を1:1000の比率で二次培養物に移し、さらに12時間インキュベートします。
2. 細菌培養物を5000 x g で遠心分離し、遠心分離ボトル内で10分間ペレット化します。
3. プラスミド精製キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってプラスミドを単離します。プラスミドDNAをDNase/RNaseフリー水に溶解して、寄生虫を直接トランスフェクションします。

9. 熱帯熱マラリア原虫とソルビトールのトランスフェクションのための同期化のin vitro培養

注:ヒト赤血球(RBC)における熱帯熱マラリア原虫のin vitro培養は、TragerおよびJensen36によって概説された方法に従って行われる。

1. PのNF54株を伝播します。L-グルタミン、25 mM HEPES、25 mM 重炭酸ナトリウム、および 50 μg/mL ヒポキサンチンを添加した RPMI 1640 を含む完全 RPMI (cRPMI) 培地で 2% のヘマトクリットで O⁺ ヒト RBC で培養することにより、熱帯熱マラリア。培地に0.5 % AlbuMAX IIと10 μg/mLのゲンタマイシンを添加し、5% O₂、5% CO₂、および90% N₂の雰囲気下で37°Cに保持します。
2. ソルビトールを同期させてリングステージ寄生虫を得るには、非同期寄生虫を50 mLコニカルチューブにペレット化し、2,300 x g でRTで3分間遠心分離します。 上清を捨てます。
3. 寄生した赤血球を9容量の5%ソルビトールと37°Cで10分間インキュベートします。 インキュベーション後、2,300 x g で3分間遠心分離することによりRBCをペレット化し、ソルビトールを廃棄します。
4. ソルビトール処理された寄生虫を不完全なRPMI、iRPMI(albumaxおよび重曹を含まないRPMI培地)で洗浄し、続いてcRPMIでインキュベートします。次のサイクルでプラスミドトランスフェクションにリングステージ寄生虫を使用してください。

10. pL6CK1Met、pL6CK1Ser、pUF1プラスミドによるリングステージ寄生虫のトランスフェクション

注:以下のステップは、プラスミドDNAによるリングステージ寄生虫の直接トランスフェクションに使用されます。

1. 30 mLの水、240 mM KCl、0.3 mM CaCl₂、4 mM EGTA、10 mM MgCl₂、20 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、および50 mM HEPESに溶解して、2x cytomix buffer³⁷を調製します。pHを7.6に調整します。最終容量を50mLに調整します。0.22 μmシリンジフィルターを使用してバッファーをフィルター滅菌します。次に、2x cytomixバッファーを滅菌水で希釈して、1x cytomixバッファーを得ます。
2. 滅菌済みの15 mLコニカルチューブに、100 μLの充填されたリングステージ寄生RBCを加え、5 mLの1x cytomixバッファーで2回洗浄します。994 x g で3分間RTで遠心分離することにより、洗浄を行います。
3. 洗浄後、バッファーを取り出し、各プラスミド(T145M変異を生成するためのpL6CK1Met/pUF1、T145S変異を生成するためのpL6CK1Ser/pUF1)を50μgをパックした寄生RBCに加えます。次に、プラスミドの容量に応じて2倍バッファーを添加し、1倍のバッファー濃度で容量を400μLに調整します。
4. トランスフェクションごとに、上記の溶液400 μLを0.2 cmキュベットに移します。次の条件を使用してエレクトロポレートします:0.31 kV、950 μF、および抵抗を無限に設定。
5. エレクトロポレーション後、トランスフェクションした寄生虫をキュベットから取り出し、cRPMIと混合し、総容量15 mLのT25フラスコに移します。ステップ9.1で述べた条件下で、寄生虫を2時間インキュベートします。
6. インキュベーション後、トランスフェクションした寄生虫を50 mLのコニカルチューブに移し、994 x g で3分間遠心分離します。上清を取り除き、寄生虫を10mLの不完全なRPMIで洗浄します。それらを新鮮なcRPMIで2日間培養し、24時間後に培地を補充します。
7. 48時間後、各フラスコからcRPMIを取り出し、2 nMのWR99210と150 nMのDSM267³⁸を含むcRPMIに培養物を再懸濁する。次に、400 μLの新鮮な赤血球を加えて、培養物をT75フラスコに移し、WR99210とDSM267を含むcRPMIを7日間毎日培地に補充します。その後、トランスフェクション後14日目まで、両方の薬物を含むcRPMIを隔日で追加します。.
8. 14日目に、トランスフェクションした培養物200 μLを1.5 mLの微量遠心チューブ(MCT)に分注してスライド調製します。RTで500 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化し、上清を吸引し、細胞をスライドに移します。別のスライドを45°の角度で配置して、塗り抹標本を作成します。
9. スライドをメタノールで固定し、超純水で1:10に希釈してギムザ染色を調製します。次に、スライドをギムザ染色に20分間完全に浸して染色します。スライドを流水で洗い、十分に乾かします。その後、100倍の倍率で光学顕微鏡でスライドを観察し、液浸油を塗布します。
10. 寄生虫が視覚化されたら、毎日培地を補充し、2〜3日間成長させます。次に、寄生虫を除去して、標的遺伝子座の標的遺伝子配列の目的の修飾を確認します。
    注:寄生虫が14日目に表示されない場合は、4日後に培地(両方の薬を含む)を補充します。寄生虫を30%削減し、新鮮な血液を追加して、寄生虫が再び現れるまで7日ごとに2%のヘマトクリットを維持します。

11. cdpk1遺伝子座の所望修飾を有するトランスジェニック寄生虫のPCR検証

1. 寄生虫の増殖を2〜3日後、500 μLの培養物を取り出し、1.5 mLのMCTに移します。
2. 細胞を2,400 x g で5分間遠心分離してペレット化します。次に、サポニン処理によりRBCを溶解します。
   1. サポニン処理では、再懸濁した寄生虫ペレット1 mLに10 μLの10%サポニン溶液を加え、4°Cで5分間保存します。細胞を2,400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。赤みが完全に消え、寄生虫の黒いペレットが得られるまで、この手順を繰り返します。
3. 寄生虫ペレットを1 mLの1x PBSで2,400 x g で5分間遠心分離して洗浄します。その後、ペレットを50 μLのDNase/RNaseフリー水に再懸濁します。再懸濁した寄生虫ペレットを95°Cで5分間加熱した後、16,200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 寄生虫DNAを含む上清を新しいチューブに移します。
4. 上記の遺伝物質を利用して、プライマーセット ck1f1 および ck1r3wt ( 表1を参照)を使用して完全長遺伝子をPCR増幅し、ステップ1.2で上述したように相同性アームの外側の領域を特異的に標的とする。 ck1f1 プライマーを用いて、T145M変異を含む相同領域のシーケンシングを行います。

12. クローン性トランスジェニック寄生虫を得るための限界希釈

1. 配列検証後、トランスフェクションした寄生虫培養物を希釈して、200 μLあたり1寄生虫の最終濃度を達成します。次に、希釈した培養物100 μLを96ウェル組織培養プレートのウェルに加えます。次の手順(12.2-12.4)を実行して、1寄生虫/ 200μLを達成します。
2. 10 mLの寄生RBCを2%ヘマトクリットで調製します。上記のGiemsa染色法を使用して、培養物の寄生虫症の割合を推定します。次に、血球計算盤を使用して、1:100に希釈した培養物中のRBCの総数をカウントします。
   RBCs/mLの総数=カウントされたRBCの平均数×希釈係数×10⁴
   寄生された RBC の数/mL = (寄生虫症の割合 x RBC の総数/mL)/100
3. 寄生した赤血球を1:10,000希釈で調製し、初期培養液を2倍(各1:100希釈)で段階希釈します。
4. 希釈した培養液から適切な量(マイクロリットル単位)を添加して、10 mLの培地中に合計50の寄生虫を添加し、2%のヘマトクリットを確保します。次に、50種類の寄生虫を含む培地100 μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。混合ガス(上記のステップ9.1で説明した組成)でフラッシュした気密セカドールにプレートを置き、37°Cでインキュベートします。 メディアは2日ごとに交換してください。
5. 寄生虫が現れるまで、7^日 ごとに2%ヘマトクリットを含むcRPMIと培地を交換してください。
   1. 96ウェルプレートを45°の角度に傾け、RBCが落ち着くまで待ちます。血清学的ピペットを使用して、各ウェルから培地を慎重に取り出し、寄生虫を含むウェルでは、寄生虫のないウェルの培地のピンク色とは対照的に、黄色への色の変化を観察します。この色の変化は、寄生虫が培地を酸性化するために発生します。
6. 色の変化を観察した後、色の変化を示すウェルから少量の培養物を取り出し、スライド上に塗抹標本を調製し、ウェルの位置に対応する番号でラベル付けします。スライドをギムザ染色で染色し、上記のように顕微鏡で観察します。
7. ウェルの内容物をT25フラスコに移し、寄生虫を顕微鏡で観察しました。寄生虫がT25フラスコで4〜5日間増殖するのを待ち、1日おきに培地を補充します。
8. 寄生虫症が2〜3%に達したら、寄生虫培養物500μLを抽出します。次に、RBCをサポニン溶解し、セクション11に記載の方法を用いて寄生虫遺伝物質の抽出に進む。
9. クローン性トランスジェニック寄生虫の作製を確認するには、ステップ1.1.1で説明したようにPCR反応を設定し、PCR産物をDNAシーケンシングに送って、目的のSNPが標的遺伝子座に導入されることを確認します。

13. リアルタイムPCRによる転写産物解析

1. 寄生虫のPercoll/Sorbitol精製と同期
   1. 15 mLのコニカルチューブに3 mLをそれぞれ70%ずつ、続いて40%のパーコール/ソルビトール溶液を順次重ねて、Percoll/Sorbitol Gradient^39,40を調製します。.
   2. 主にシゾント期のWTおよびCDPK1 T145Mの寄生虫を含む寄生虫培養物1〜2mLをグラジエントの上に穏やかに重ねます。
   3. スイングバケットローターで遠心分離機で4に設定された減加速を使用して、2,300 x g でグラジエントをRTで15分間遠心分離します。
   4. 寄生虫の栄養型およびシゾント期を含む中央のリングを、グラジエントの界面から新鮮な50 mLの円錐形チューブに集めます。
   5. 等量の9:1(cRPMI:10xPBS)を加えて寄生虫を洗浄し、994 x g で3分間遠心分離して寄生虫をペレット化します。
   6. ペレットを19:1(cRPMI:10xPBS)の溶液で再度洗浄し、994 x g で3分間遠心分離します。
   7. 各寄生虫ペレットを、2%ヘマトクリット値を含むcRPMIを含む別々のフラスコに加えます(37°Cでプレインキュベート)。ステップ9.1で上述した条件下でフラスコを4時間インキュベートし、濃縮されたシゾントから新鮮な赤血球へのメロゾイトの侵入を可能にします。
   8. 4時間後、ステップ9.2〜9.4で上述したようにソルビトールで寄生虫を処理し、高度に同期した0〜4時間のリングステージ寄生虫を得る。
   9. ソルビトール処理後44時間、同期寄生虫をインキュベートして、寄生虫の44〜48時間のシゾント段階を得る。
2. WTおよびCDPK1 T145M寄生虫のシゾントからのRNA単離
   1. WTおよびCDPK1 T145M寄生虫を浸潤後44〜48時間で収穫します。寄生虫ペレットを1x PBSで994 x g で4°Cで5分間洗浄します。
   2. 寄生虫ペレットを1x PBSの1 mLに再懸濁し、サポニンで処理して、ステップ11.2.1で説明したように周囲のRBCを溶解します。
   3. 寄生虫ペレットを1 mLのRNA抽出試薬に再懸濁し、さらなる処理まで-80°Cで保存します。
   4. 凍結したペレットを15〜30°Cで解凍し、核タンパク質複合体を完全に解離させます。
   5. RNA抽出試薬1 mLあたり200 μLのクロロホルムを添加し、チューブを手で15秒間激しく振とうします。室温で2〜3分間インキュベートします。
   6. 混合物を16,200 x g で4°Cで15分間遠心分離します。RNAは無色の上部水層にのみ残ります。製造元の指示に従って、キットを使用してRNAを単離します。
3. WTおよびCDPK1 T145M寄生虫のRNAからのcDNA合成
   1. 汚染されたDNAを除去するための製造元の指示に従って、RNA含有サンプルをDNA除去キットで処理します。
   2. 単離されたRNAサンプルから、メーカーのプロトコルに従ってcDNA合成キットを使用してcDNAを合成します。逆転写プロセスには、オリゴdTプライマーの代わりにランダムヘキサマープライマーを使用します。
   3. cDNA調製に使用する各RNAサンプルのNO-RT(逆転写酵素を添加せずにセットアップされた反応)コントロールを確保し、cDNA調製中に精製されたRNAからのゲノムDNA汚染のキャリーオーバーを排除します。
   4. 完全長 cdpk1 遺伝子など、介在するイントロン配列を含む任意の遺伝子セグメントを増幅してcDNAを試験し、ゲノムDNAコンタミネーションを除外します。ステップ1.1.1で説明されているPCR条件を使用します。
4. WTおよびCDPK1 T145M寄生虫の転写産物発現解析
   1. WTおよびCDPK1 T145M寄生虫から調製したcDNAを使用して、リアルタイムPCRによる11種類の遺伝子の転写産物発現解析を行います。11の標的遺伝子には、CDPKファミリーの7つのメンバーと、RBCの浸潤に関与する4つのキナーゼが含まれています(リアルタイムPCRに使用される遺伝子と対応するプライマーについては 表2 を参照)。
   2. プライマー合成ソフトウェアを使用してプライマーを設計します。選択した各遺伝子の約120 bpを、同様の融解温度の遺伝子特異的プライマーを使用して増幅します。
   3. プレミックスを使用して標的遺伝子を増幅し、次のサイクリングパラメーターを使用してリアルタイムPCRシステムでプレートを泳動します:最初の変性を95°Cで3分間、続いて95°Cで10秒間の変性を40サイクル、52°Cで20秒間のアニーリング、62°Cで30秒間の伸展を行います。
   4. グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)とスレオニンtRNAリガーゼ(ThrRS)³²の2つのハウスキーピング遺伝子を用いて、各遺伝子の発現レベルを正常化する。WTコントロールと比較したCDPK1 T145M寄生虫の各標的キナーゼの相対発現を計算します。
   5. R 統計解析パッケージを使用して統計解析を実行します。または、他の解析ソフトウェアを使用します。
      注:RNA-Seqやマイクロアレイなどのグローバルトランスクリプトミクス法は、WTと比較して、変異型寄生虫のトランスクリプトーム再配線のより広い視野を得るための優れたアプローチです。

結果

組換えWT CDPK1は、N末端グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグを持つ融合タンパク質として発現し、GSTアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製します。精製したCDPK1タンパク質は、抗CDPK1抗体および抗GST抗体を用いたウェスタンブロットにより検出しました(図1)。WT CDPK1のスレオニンゲートキーパー残基(T145)をMetおよびSerに置換し、?...

ディスカッション

cdpk1の低型対立遺伝子を含む変異型トランスジェニック寄生虫の作製は、組換え酵素を用いたin vitroキナーゼ活性データに基づいています。できるだけ多くの異なるゲートキーパー残基を持つ変異組換えタンパク質を生成する方が良いです。熱帯熱マラリア原虫のゲノムは非常にATに富んでいるため、E.大腸菌はコドンの最適化が必要?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570