植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解

要約

化学遺伝学では、標的遺伝子座においてゲートキーパー残基を異なる側鎖を含むアミノ酸に置き換えることが含まれます。ここでは、 cdpk1 の低型対立遺伝子を含む突然変異寄生虫を作製し、その突然変異体背景において寄生虫が採用する代償性経路を特定しました。

要約

マラリア原虫による薬物の影響を覆すメカニズムの1つは、トランスクリプトームの再配線によるものです。この効果は、多重遺伝子ファミリーに属する標的遺伝子に対してより顕著です。CDPKファミリーに属する 熱帯熱マラリア原虫 プロテインキナーゼは、血液病期の発達に不可欠です。そのため、CDPKは抗マラリア化合物の開発に適したターゲットと考えられています。化学遺伝学のアプローチは、高等真核生物におけるプロテインキナーゼの機能を解明するために歴史的に使用されてきました。これには、遺伝子操作を通じてゲートキーパー残基を異なる側鎖を持つ別のアミノ酸に置き換える必要があります。ゲートキーパー位でのアミノ酸置換は、プロテインキナーゼの活性を調節し、標的遺伝子の機能的同定に役立つバンプキナーゼ阻害剤(BKI)として知られる特定のクラスの化合物に対する感受性を変化させます。ここでは、化学遺伝学のアプローチを利用して、 cdpk1の低形対立遺伝子を持つ突然変異寄生虫によって進化する代償メカニズムを理解しました。全体として、私たちのアプローチは、個々のキナーゼに対する薬剤耐性の発症を防ぐために同時に標的とされる可能性のある代償性経路を特定するのに役立ちます。

概要

マラリアは、毎年何百万人もの死者を出している主要な感染症の1つであり、特に5歳未満の子供1人^です。マラリアに対する臨床的に利用可能なワクチンはありません。さらに、ヒトで最も致命的なマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫は、アルテミシニン^2,3,4,5と呼ばれる最前線の薬に対する耐性を獲得したことが知られています。アルテミシニン耐性の世界的な蔓延を避けるために、迅速に展開できる新しい薬剤標的と新しい戦略を特定することが急務です。薬物作用のメカニズムと代償経路の分子基盤をよりよく理解することは、薬剤耐性の発症を回避するためのより良い戦略を考案するのに役立ちます。

カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)ファミリーに属するプロテインキナーゼは、赤血球、性、および赤血球前期の寄生虫発生の多くの段階で重要です⁶。Pの無性複製中。falciparum、CDPK5は、成熟したシゾント^....

プロトコル

Pです。熱帯熱マラリア原虫株(NF54)は、Alvaro Molina Cruz 21,32,33から入手した。寄生虫の培養に使用したO⁺ヒト赤血球は、インドのニューデリーにあるロータリー血液センターから入手しました。プラスミドであるpL6eGFPおよびpUF1は、Jose-Juan Lopez-Rubioから入手しました。DSM267は、Margaret A. PhillipsおよびPradipsinh K. Rathodから入手しました。WR99210はジェイコブス・ファーマシューティカル・カンパニーから提供されました。

1. 大腸菌における組換えCDPK1発現のためのプラスミドの構築

1. cdpk1遺伝子(PlasmoDBアクセッション番号)の完全なCDSを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーペアを設計します。PF3D7_0217500) プライマー解析ソフトウェアを使用する。
   1. Plasmodium falcipa....

ディスカッション

cdpk1の低型対立遺伝子を含む変異型トランスジェニック寄生虫の作製は、組換え酵素を用いたin vitroキナーゼ活性データに基づいています。できるだけ多くの異なるゲートキーパー残基を持つ変異組換えタンパク質を生成する方が良いです。熱帯熱マラリア原虫のゲノムは非常にATに富んでいるため、E.大腸菌はコドンの最適化が必要?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570