Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل عزل الخلايا الغضروفية ، وغضروف التصاق الفيبرونيكتين المشتق من فحص التصاق (FAA-CPs) ، والغضروفات المهاجرة (MCPs) من الغضروف المفصلي البشري. وهو يغطي الهضم الأنزيمي ، والتصاق الفيبرونيكتين ، والمقايسات القائمة على الهجرة لعزل وتوصيف هذه الخلايا.

Abstract

تظهر خلايا الغضروف والغرون (CPCs) ، التي تم تحديدها مؤخرا على أنها مجموعة سكانية فرعية مميزة ، واعدة بسبب خصائصها الوسيطة ، وزيادة تكوين الغضروف ، والسمات الضخامية المحدودة. يتم تحقيق إثراء الأسلاف من خلال التصاق الفيبرونيكتين التفاضلي وفحوصات الزرع القائمة على الهجرة ، مع غضروف الغضروف المشتق من فحص التصاق الفبرونيكتين (FAA-CPs) وغضروفات الغضروف المهاجرة (MCPs) التي تظهر إمكانات فائقة مقارنة بالخلايا الغضروفية. تتعمق هذه المقالة في تفاصيل عزل الخلايا المشتقة من الغضاريف المقيمة ، وهي الخلايا الغضروفية والخلايا الغضروفية. بينما تساهم رؤى قيمة من أبحاث الخلايا الغضروفية في فهمنا لإصلاح الغضروف ، يتم توجيه الجهود المستمرة نحو استخدام الغضروف واستكشاف إمكاناتها كنهج علاجي بديل. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مقالة المنهجية هذه بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لعزل ثلاثة أنواع محددة من الخلايا عن الغضاريف: الخلايا الغضروفية ، و FAA-CPs ، و MCPs. باتباع الإجراءات الموحدة ، يسهل هذا البروتوكول الاستخراج الناجح لهذه الأنواع الفرعية للخلايا. ترتكز المقالة على البحث المكثف ، وتركز على التقنيات المعقدة المستخدمة في عزل المجموعات الفرعية المختلفة وظروف الثقافة المثلى المطلوبة لتوسيع ثقافاتهم والحفاظ عليها. تشمل المنهجية العزل الأنزيمي للخلايا الغضروفية المشتقة من الغضروف المفصلي البشري ، والتصاق الفيبرونيكتين التفاضلي بعد الهضم الأنزيمي المتسلسل ، وفحوصات الزرع القائمة على الهجرة للحصول على الخلايا المقيمة في الغضاريف.

Introduction

يمثل ظهور العلاج التجديدي القائم على الخلايا نهجا مهما لعلاج الأمراض المرتبطة بالغضروف ، مثل هشاشة العظام (OA) والعيوب الغضروفي1. تمثل هذه الاضطرابات ، التي تتميز بانهيار أو إصابة الغضروف داخل المفاصل ، تحديات كبيرة أثناء العلاج. تم الإبلاغ عن أن الإصلاح الذاتي للغضروف المفصلي محدود بسبب بنيتها العصبية ، والأوعية الدموية ، والنشاط الانقسامي المنخفض2.

الخلايا الأكثر استخداما لتجديد أنسجة الغضروف هي الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) والخلايا الغضروفية3. ومع ذلك ، فقد أبلغت العديد من الدراسات عن قيود في استخدام هذه الخلايا للتجديد4. تشمل هذه القيود التمايز النهائي للخلايا الغضروفية أثناء التوسع الممتد في المختبر لتحقيق عدد الخلايا المطلوب والميل الضخامي للخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الجذعية يمكن أن تؤدي هذه العوامل إلى تكوين أنسجة إصلاح بمزيج دون المستوى الأمثل من الغضروف الليفي والهيالين5،6،7،8.

نشأ اكتشاف الخلايا الغضروفية (CPCs) من البحث عن خلايا بديلة في الغضروفالمفصلي 9. لقد ولدت اهتماما هائلا بسبب تشابهها مع الخلايا الجذعية الجذعية وإمكاناتها الغضروفية الفائقة ، كل ذلك مع إظهار تضخم منخفض - وهو مزيج لا غنى عنه مطلوب بعد10،11. على عكس الخلايا الغضروفية ، تم الإبلاغ عن أن مجموعات السلف هذه تظهر نشاطا مكررا ومترابطا محسنا ، بالإضافة إلى زيادة التعبير عن بروتين متماثل الموضع العصبي 1 (NOTCH-1) وعامل النسخ SRY-box 9 (SOX-9) 12،13،14،15. هناك طريقتان قياسيتان لعزل CPCs التي تم الإبلاغ عنها من كل من الغضروف والغضروف المفصلي ، بما في ذلك طريقة تعتمد على تعبير مستقبلات الإنتجرين (CD49e / CD29) ، معزولة من خلال مقايسة التصاق الفيبرونيكتين - الغضروفات اللاصقة المشتقة من فحص التصاق الفبرونيكتين (FAA-CPs) ، والأخرى بناء على إمكاناتها المتزايدة للهجرة من مستخلصات الغضروف - غضروفات الغضروف المهاجرة (MCPs) 11،13،16،17 ،18،19. تظهر العديد من الدراسات في المختبر التفوق الغضروفي وانخفاض تضخم كل من FAA-CPCs و MCPs مقارنة بالخلايا الغضروفية ونخاع العظام (BM) -MSCs20،21،22،23.

أظهرت التحقيقات المختبرية الحديثة التي تقارن FAA-CPCs ب MCPs القدرة المعززة على تجديد الغضروف لمجموعة السلف الأخيرة في ظل ظروف الأكسجين العادية24. تظهر هذه النتائج المتفائلة في المختبر تجديدا يشبه الهيالين ، مما يشجع على المزيد من التجارب في الجسم الحي . ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن كلا المجموعتين من CPCs تقوم بإصلاح وتجديد الغضروف بكفاءة في الزراعة العضوية والاضطرابات العظمية الغضروفي الأخرى في النماذج الحيوانية25،26،27،28،29.

ساهم مختبرنا بنشاط في توحيد تقنيات عزل CPC ومقارنة خصائصها المظهرية مع الخلايا الغضروفية والخلايا الجذعية الجذعية الجذعية ستوفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا يشرح الخطوات المتبعة في عزل وزراعة الخلايا المقيمة في الغضروف ، وهي الخلايا الغضروفية و FAA-CPCs و MCPs.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول ويتوافق مع اللوائح والمبادئ التوجيهية المناسبة لمجلس المراجعة المؤسسية (لجنة البحث والأخلاقيات). بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة ، يتم شراء مفاصل الظنبوب الفخذي البشرية من مرضى هشاشة العظام (OA) (درجة كيلغرين لورانس الإشعاعية 4) 30 الذين يحتاجون إلى استبدال الركبة بالكامل كجزء من علاجهم. تم استبعاد مفاصل المرضى الذين يعانون من أي علامات للأورام أو الالتهابات أو التهاب المفاصل (مثل التهاب المفاصل الروماتويدي أو النقرس) من الدراسة. يتم التأكد من أن جميع الإجراءات تتم في ظل ظروف معقمة ، مع الالتزام بالبروتوكولات المختبرية القياسية طوال العملية التجريبية.

1. الحصول على مفاصل الظنبوب الفخذي

  1. الحصول على مفاصل الركبة (مفاصل الفخذ الظنبوبي) من متبرعين بشريين يحتاجون إلى بتر فوق الركبة كجزء من العلاج أو من المصابين بهشاشة العظاممن الدرجة الرابعة 30 (الأدلة الإشعاعية التي تظهر انخفاضا ملحوظا في مساحة المفصل مع التصلب الغضروفي) الذين يخضعون لاستبدال الركبة بالكامل.
    ملاحظة: تأكد من الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى الذين يتبعون مبادئ إعلان هلسنكي. ضمان الالتزام بقواعد لجنة الأخلاقيات ومجلس المراجعة المؤسسية.
  2. استبعد أي مفاصل تظهر عليها أعراض العدوى أو الالتهاب.

2. معالجة المفاصل المحصودة

  1. ضع المفاصل الظنبوبية الفخذية المحصودة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x في ظروف معقمة.
  2. قم بإعداد منطقة معقمة تحت الغطاء عن طريق وضع وسادة سفلية معقمة. انقل المفاصل المحصودة إلى الوسادة السفلية.
  3. قم بتثبيت مفاصل الفخذ الظنبوب المقطعة عن طريق إمساك العظم تحت الغضروف مع توجيه الغضروف في الاتجاه الصعودي.
  4. باستخدام شفرة مشرط (رقم 22) ، قم بحصاد نشارة الغضروف المستطيلة الشكل من المناطق غير الحاملة للوزن لمرضى الزراعة العضوية في غضون 1-2 ساعة من الحصول على المفصل.
  5. احصد أقسام الغضروف 8 مم × 10 مم من الطبقة السطحية إلى الطبقة العميقة.
  6. اغسل شرائح الغضروف بمحلول 1x PBS وضعها في طبق بتري يحتوي على 1-2 مل من وسط DMEM العادي.
  7. افرم شرائح الغضروف بشكل جيد إلى حجم أقل من 1 مم × 1 مم × 1 مم بشفرة مشرط (رقم 22).
    ملاحظة: تأكد من أن شرائح الغضروف أو الغضروف المفروم لا تجف ؛ ضعها في وسط ثقافة أو PBS خال من المصل.

3. عزل الخلايا الغضروفية

  1. ضع الغضروف المفروم في قارورة T-25 منتصبة تحتوي على 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) مع 0.15٪ كولاجيناز من النوع الثاني للهضم الأنزيمي. اترك القارورة دون إزعاج لمدة 12-14 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ، مع ضمان ظروف الاستزراع القياسية31.
    ملاحظة: يجب استخدام وسط DMEM-F12 عادي بدون آثار للمصل ، حيث يعطل المصل العمل الأنزيمي.
  2. بعد الهضم طوال الليل ، انقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا المنبعثة إلى أنبوب طرد مركزي جديد ومعقم يحتوي على كمية متساوية من DMEM-F12 + 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، باستخدام مصفاة خلوية لفصل الخلايا عن الحطام. الخلايا التي تم إطلاقها هي "الخلايا الغضروفية".
  3. الطرد المركزي للخلايا المفلترة بسرعة 1200 × جم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أعد تكوين الحبيبات التي تم الحصول عليها في 1 مل من الوسط وعد الخلايا القابلة للحياة التي تم إطلاقها باستخدام مقايسة استبعاد التربان الأزرق.
  5. قم بتحميل الخلايا الغضروفية في قارورة T-25 بتركيز 10,000 خلية / سم² وقم بتوسيعها إلى رقم المرور المطلوب باستخدام DMEM-F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS. تشمل المكونات الإضافية في الوسط حمض الأسكوربيك (62 ميكروغرام / مل) ، و L-glutamine (2.5 ملي مولار / لتر) ، والبنسلين - الستربتومايسين (100 وحدة دولية / مل) ، والأمفوتريسين ب (2 ميكروغرام / مل).
  6. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام وحصاد الخلايا عند التقاء فرعي باستخدام 0.125٪ تريبسين يحتوي على حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA).

4. عزل الغضروف المبدع المشتق من فحص التصاق الفيبرونيكتين (FAA-CPs)

  1. قبل 12 ساعة من إطلاق الخلايا الغضروفية ، قم بإعداد 10 مل من 1x PBS يحتوي على 1 ملي مولار من MgCl2 (10 ميكرولتر) و 1 ملي من CaCl2 (10 ميكرولتر) ، و 100 ميكرولتر من Fibronectin (10 ميكرولتر / مل) 32.
  2. قم بتغطية العدد المطلوب من الآبار من صفيحة 6 آبار (1.5 مل / 9.3 سم2) باستخدام المحلول المحضر.
  3. أغلق الطبق بإحكام وضعه في الثلاجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. بالإضافة إلى ذلك ، احصل على نشارة الغضروف بطريقة مشابهة لتلك الموضحة لعزل الخلايا الغضروفية (الخطوات 2.1-2.5).
  5. إخضاع نشارة الغضروف للهضم الأنزيمي المتسلسل بين عشية وضحاها (0.2٪ بروناز لمدة 3 ساعات ؛ متبوعا بنسبة 0.04٪ من النوع الثاني من الكولاجيناز لمدة 12 ساعة) في حمام مائي يهتز يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية للحصول على الخلايا الغضروفية الفردية.
  6. في اليوم التالي ، قم بإزالة اللوحة المكونة من 6 آبار المغطاة ب Fibronectin من الثلاجة وقم بإزالة Fibronectin الزائد.
    ملاحظة: يجب إزالة الفيبرونيكتين الزائد ببطء ولطف دون إزعاج الطلاء الموجود في قاع البئر. يعد وجود MgCl2 (10 ميكرولتر) و 1 ملي مولار من CaCl2 أمرا بالغ الأهمية لضمان ارتباط الخلايا.
  7. أضف 2-3 مل من وسط DMEM-F12 العادي في الآبار المطلية.
  8. قم بزرع الخلايا الغضروفية التي تم إطلاقها في الآبار المطلية بكثافة تحميل تبلغ 4000 خلية / بئر واترك الصفيحة دون إزعاج لمدة 20 دقيقة.
  9. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط الزائدة والخلايا غير الملتصقة. أضف 2-3 مل من وسائط النمو القياسية المستخدمة للخلايا الغضروفية (DMEM-F12 + 10٪ FBS).
  10. الحفاظ على الخلايا الملتصقة في ظل ظروف الاستزراع القياسية لمدة 10-12 يوما للحصول على استنساخ CPC (مستعمرات من >32 خلية).
  11. عزل باستخدام 0.125٪ trypsin-EDTA لمدة 180 ثانية ، وأعد صفيحة المستنسخة بنسبة 1 استنساخ / 5 سم² ، وقم بتوسيع CPs متعددة النسيلة المخصبة إلى التقاء المطلوب. يشار إلى هذه الخلايا التي تم الحصول عليها باسم "FAA-CPCs".
  12. زراعة الخلايا بشكل أكبر في وسط DMEM-F12 + 10٪ FBS + عامل النمو المحول بيتا 2 (TGFβ2: 1 نانوغرام / مل) + عامل نمو الخلايا الليفية (FGF2: 5 نانوغرام / مل).
    ملاحظة: يجب ألا تتجاوز حضانة الخلايا على الصفائح المغلفة بالفيبرونكتين 20 دقيقة ، حيث قد تبدأ الخلايا الغضروفية أيضا في الالتصاق. خلال فترة الالتصاق التي تبلغ 20 دقيقة ، يجب أن يكون الوسط خاليا من المصل. بعد ذلك ، يجب زراعة الخلايا التي تلتصق بتكوين المستنسخة في وسط يحتوي أيضا على FBS. يجب عزل المستنسخة فقط بعد التأكد من أن كل استنساخ يحتوي على أكثر من 32 خلية. هذا لتجنب مكبرات الصوت العبورية. يجب أن يشمل التوسع الإضافي للنسخ بعد التربسين عوامل النمو الإضافية المذكورة. تؤدي كثافة التحميل البالغة 4000 خلية غضروفية / 9.3 سم2 من صفيحة مطلية بالفبرونكتين ، بعد حضانة لمدة 20 دقيقة متبوعة بغسيل ، إلى التصاق 80-100 خلية في المجموع. من بين هؤلاء ، سيتقدم حوالي 20 نسخة مستنسخة للنمو وتحقيق مضاعفة عدد السكان من 5 في غضون 10-12 يوما.

5. عزل الغضروف المهاجر

  1. حلق الخرطوفات الخرطوفية (10 مم × 5 مم × 1 مم) من المفصل المفصلي المحصود وضعها في صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار تحتوي على وسائط DMEM-F12 مع 10٪ FBS و 10 ملي مولار جلوتاماكس (2-3 نباتات / بئر) 33.
  2. اترك اللوحة مع المصانع الخارجية دون إزعاج لمدة 48 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 يتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد يومين ، انقل المخططات إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 10 مل من محلول الكولاجيناز 0.1٪ للهضم الأنزيمي. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    ملاحظة: تتطلب النباتات التحويلية شطفها باستخدام 1x PBS قبل الهضم الأنزيمي ، حيث يمكن أن تؤدي آثار المصل إلى تعطيل عمل الإنزيم. للغسيل ، اغمس النباتات الخارجية في طبق بتري مملوء ب 2-3 مل من 1x PBS ؛ هذا أيضا لضمان عدم التلوث بأي خلايا غضروفية تم إطلاقها. يجب تقليل التعامل مع المصانع إلى الحد الأدنى ، وذلك لتجنب إجهاد الأسلاف التي بدأت في الهجرة.
  4. بعد الهضم ، اشطف النباتات الخارجية باستخدام 1x PBS وضعها مرة أخرى في نفس آبار اللوحة التي تحتوي على وسائط DMEM-F12 جديدة مع 10٪ FBS و 10 ملي مولار من وسط Glutamax.
  5. حافظ على اللوحة في ظروف الاستزراع القياسية في الحاضنة. راقب هجرة الغضروف في الأيام اللاحقة.
  6. عند الوصول إلى التقاء فرعي ، قم بحصاد MCPs باستخدام 0.125٪ من التربسين المحتوي على EDTA.
  7. قم بتوسيع MCPs باستخدام وسيط التمدد القياسي ، والذي يتضمن DMEM-F12 ، الذي يحتوي على 10٪ FBS و 10 ملي مولار من Glutamax.

6. التوصيف الظاهري للخلايا الغضروفية و FAA-CPs و MCPs

  1. تحليل قياس التدفق الخلوي (FACS)
    ملاحظة: يتم اتباع الخطوات التالية لتحليل FACS لمجموعات الخلايا المحصودة.
    1. قم بتربسين الخلايا وفقا للبروتوكول القياسي باستخدام 0.125٪ من التربسين وأجهزة الطرد المركزي عند 1200 × جم ، 5 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات الخلية.
    2. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها وأعد تعليقها باستخدام 1x PBS.
    3. انقل التعليق إلى الأنابيب ذات العلامات الخاصة ب FACS.
    4. قسم المعلق بالتساوي إلى أنبوبين: أنبوب "غير ملطخ" يعمل كعنصر تحكم (تعليق الخلية بدون جسم مضاد) وأنابيب "ملطخة" تعمل كاختبارات (تعليق الخلية مع الجسم المضاد).
    5. اتبع ورقة البيانات الفنية للأجسام المضادة الفردية / علامات مجموعة التمايز (CD) للتلطيخ. تشمل الأجسام المضادة للمقارنة CD105-FITC و CD73-PE و CD90-PE و CD106-APC (علامات التعبير الإيجابية). CD34-PE و CD45-FITC و CD14-FITC (علامات التعبير السلبية)34،35 ؛ CD166-BB515 و CD146-PE (علامات غضروفية محتملة)36،37.
      ملاحظة: علامات القرص المضغوط حساسة للضوء. لضمان تنفيذ الخطوات في الظلام.
    6. احتضان معلق الخلية بجسم مضاد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    7. بعد التلوين ، أضف 1 مل من 1x PBS إلى الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي عند 1200 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات الخلية.
    8. تخلص من ثلاثة أرباع المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في المحتوى الطافي المتبقي عن طريق التريتوري اللطيف.
    9. تابع لتحليل FACS.

7. qRT-PCR

ملاحظة: يتضمن تحليل qRT-PCR للتعبير الجيني تقييم الكولاجين من النوع الأول (COL1A1) ، ونوع الكولاجين X (COL10A1) ، وعامل النسخ المرتبط ب Runt (RUNX2) للتعبير الضخامي ، و SOX-9 و Aggrecan (ACAN) و Collagen من النوع الثاني (COL2A1) لتكوين الغضروف.

  1. استخرج الحمض النووي الريبي من مجموعات الخلايا باستخدام المجموعات المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. بعد الاستخراج ، قم بتقييم نسبةA 260 / A280 وتركيز الحمض النووي الريبي.
  3. استخدم 280 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج لبناء الحمض النووي التكميلي (cDNA).
  4. ابدأ qRT-PCR باستخدام Sybr Green ، كل تفاعل يحتوي على تركيز نهائي قدره 7 نانوغرام من (كدنا) على جهاز التدوير الحراري.
  5. تطبيع تعبير mRNA النسبي لكل جين إلى جين التدبير المنزلي المرجعي GAPDH (ΔCt).
  6. احسب التعبير النسبي لكل جين باستخدام تقنية 2-ΔΔCt من خلال مقارنة قيمة ΔCt لكل جين على حدة بقيمة FAA-CPs (ΔΔCt) 37.

8. التمايز متعدد السلالات

ملاحظة: تحفز الوسائط التفاضلية المتاحة تجاريا تمايز ثلاثي السلالات إلى سلالات شحمية المنشأ وعظمية وغضروفية.

  1. للتمايز الدهني ، خلايا البذور بكثافة تحميل 1000 خلية / سم2 في صفيحة زراعة الخلايا والزراعة باستخدام وسط التمايز الدهني (تغيير متوسط - مرة واحدة في 3 أيام) حتى التقاء فرعي بنسبة 80٪ لمدة 3 أسابيع.
  2. للتمايز العظمي والغضروفي ، اتبع نظام زراعة الحبيبات لمدة 28 يوما38.
  3. أجهزة الطرد المركزي 0.5 × 106 خلايا عند 400 × جم لمدة 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتشكيل الكريات وبدء التمايز باستخدام وسط التمايز العظمي والغضروفي.
  4. قم بإصلاح الكريات وتضمينها وتقسيمها للتلوين التأكيدي (الخطوة 9).

9. تلطيخ تأكيدي

  1. في حالة خلايا النسب الشحمية ، قم بإصلاح الخلايا بالفورمالين المخزن ، واغسلها وصمة عارها بالزيت الأحمر O (0.5٪). قم بتلطيخ أدوات التحكم (المزروعة على وسيط DMEM قياسي مع 10٪ FBS) أيضا.
  2. راقب تحت المجهر واحصل على الصور.
  3. بالنسبة لخلايا النسب العظمية المتمايزة ، قم بتلطيخ أليزارين الأحمر (2٪).
    ملاحظة: تنطبق بروتوكولات تلوين تأكيدية متعددة على الخلايا المتمايزة الغضروفية.
  4. تلطيخ ألسيان بلو: تلطيخ الخلايا الثابتة باللون الأزرق ألسي لمدة 5 دقائق وصبغ البقع باللون الأحمر المحايد.
  5. لتقييم محتوى الجليكوزامينوجليكان (GAG) ، قم بإجراء تلطيخ Safranin O: تلطيخ الشرائح باستخدام Hematoxylin الحديد من Wiegert متبوعا بالحضانة اللاحقة بالكحول الحمضي (1٪) ، والمحلول الأخضر السريع (0.05٪) ، وحمض الأسيتيك (1٪) ، ومحلول Safranin O (1٪).
  6. تلطيخ تولويدين الأزرق: تلطيخ الشرائح باللون الأزرق تولويدين (0.1٪) لمدة 5 دقائق.
  7. تلطيخ PicroSirius Red: قم بتلطيخ الشرائح ب Picrosirius Red (0.1٪) وقم بصبغة مضادة باستخدام صبغة Hematoxylin.
    ملاحظة: بعد التلوين ، قم بتجفيف الشرائح باستخدام الكحول المتدرج وقم بإزالتها باستخدام الزيلين. قم بتركيب الشرائح باستخدام حامل ثنائي بوتيل فثاليت بوليسترين زيلين (DPX) ، وراقبها تحت المجهر ، واحصل على الصور.
  8. بالنسبة للكيمياء النسيجية المناعية (النوع الثاني من الكولاجين) تلطيخ الحبيبات المتمايزة الغضرورية ، قم بإخضاع أقسام الحبيبات لاسترجاع المستضد الأنزيمي باستخدام إنزيمات بروناز (1 مجم / مل) والهيالورونيداز (2.5 مجم / مل).
  9. احتضان الأقسام بجسم مضاد أحادي النسيلة الأولي للفأر من النوع الثاني ، متبوعا بجسم مضاد مضاد للماعز المضاد للفأر 1: 250 HRP ثانوي.
  10. قم بتلطيخ الشرائح بكروموجين 3،3 ′-Diaminobenzidine (DAB) وقم بمضاد تلطيخها باستخدام الهيماتوكسيلين.
  11. راقب تحت المجهر والتقط الصور.

10. تحديد محتوى GAG / DNA

  1. هضم الكريات المتمايزة الغضروانية باستخدام محلول غراء سيستين عند 65 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  2. تقدير تركيز الحمض النووي باستخدام كاشف Picrogreen38 والحصول على شدة التألق عند الأطوال الموجية - الإثارة: 480 نانومتر ، الانبعاث: 520 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA.
  3. قم بتقييم إجمالي محتوى GAG باستخدام طريقة صبغة ثنائي ميثيل الميثيلين الزرقاء38.
  4. قم بقياس الكثافة البصرية عند 525 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA.
  5. تطبيع قيم GAG إلى قيم الحمض النووي وحساب نسبة GAG / DNA الإجمالية.

النتائج

من 86.9 مجم من شرائح الغضروف ، لوحظ إنتاج خلايا غضروفية يبلغ 1.72 × 105 خلايا. عند التحميل ، تلتصق الخلايا الغضروفية على الفور ، وتقدم مظهرا أوليا مستديرا مرصوفا بالحصى وتتحول إلى حالة ليفية عند مزيد من التوسع (الشكل 1 أ ، ب). عادة ما يؤدي زرع هذه ا?...

Discussion

يمكن تحقيق التجديد المحتمل للغضاريف المفصلية ، التي تحتوي على أنسجة زجاجية ، من خلال تحسين نوعي الخلايا الأصلية: الخلايا الغضروفية والغضروفية. في حين أن الأبحاث المكثفة حول الخلايا الغضروفية قد قدمت رؤى قيمة حول دورها في إصلاح الغضروف ، فقد دفعت الأسئلة حول طبيعة الأنس?...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

نود أن نتوجه بخالص الشكر للسيدة بهافيني كريشنان والسيدة ميرين ماري زكريا على مساهمتهما الفكرية ومركز أبحاث الخلايا الجذعية (وحدة من inStem Bengaluru) ، قسم علم وظائف الأعضاء ، كلية الطب المسيحية ، فيلور ، لدعم البنية التحتية. يتم دعم المشاريع الجارية من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية (BT / PR32777 / MED / 31/415/2019) ، وحكومة الهند ، ومجلس أبحاث العلوم والهندسة (CRG / 2022 / 004277) ، وحكومة الهند ، ومنح أبحاث السوائل ، كلية الطب المسيحية ، فيلور.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

References

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163 (2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3, (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203 (2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39 (2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246 (2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421 (2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462 (2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614 (2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966 (2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11 (2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685 (2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104 (2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052 (2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93 (2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536 (2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588 (2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66 (2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685 (2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106 (2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119 (2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713 (2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved