Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei condrociti, dei condroprogenitori derivati dal dosaggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e dei condroprogenitori migratori (MCP) dalla cartilagine articolare umana. Copre la digestione enzimatica, l'adesione della fibronectina e i saggi basati sulla migrazione per isolare e caratterizzare queste cellule.

Abstract

Le cellule condroprogenitrici (CPC), recentemente identificate come una sottopopolazione distinta, mostrano risultati promettenti grazie alle loro proprietà mesenchimali, all'aumento della condrogenesi e ai limitati tratti ipertrofici. L'arricchimento dei progenitori si ottiene attraverso l'adesione differenziale della fibronectina e i saggi di espiantazione basati sulla migrazione, con i condroprogenitori derivati dal saggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e i condroprogenitori migratori (MCP) che dimostrano un potenziale superiore rispetto ai condrociti. Questo articolo approfondisce i dettagli dell'isolamento delle cellule derivate dalla cartilagine residenti, vale a dire condrociti e condroprogenitori. Mentre le preziose intuizioni della ricerca sui condrociti contribuiscono alla nostra comprensione della riparazione della cartilagine, gli sforzi in corso sono diretti verso l'uso dei condroprogenitori e l'esplorazione del loro potenziale come approccio terapeutico alternativo. Inoltre, questo articolo sulla metodologia fornisce un protocollo dettagliato passo dopo passo per isolare tre tipi di cellule specifiche dalla cartilagine: condrociti, FAA-CP e MCP. Seguendo procedure standardizzate, questo protocollo facilita l'estrazione di successo di questi sottotipi di cellule. Basato su un'ampia ricerca, l'articolo si concentra sulle intricate tecniche utilizzate per isolare i diversi sottoinsiemi e sulle condizioni di coltura ottimizzate necessarie per espandere e mantenere le loro colture. La metodologia comprende l'isolamento enzimatico di condrociti umani derivati dalla cartilagine articolare, l'adesione differenziale della fibronectina dopo digestione enzimatica sequenziale e saggi di espianti basati sulla migrazione per ottenere cellule residenti nella cartilagine.

Introduzione

L'emergere della terapia rigenerativa cellulare rappresenta un approccio significativo al trattamento dei disturbi legati alla cartilagine, come l'osteoartrite (OA)^{e i difetti} condrali. Questi disturbi, caratterizzati dalla rottura o dalla lesione della cartilagine all'interno delle articolazioni, presentano sfide sostanziali durante il trattamento. L'autoriparazione della cartilagine articolare è limitata a causa della sua architettura aneurale, dell'avascolarità e della bassa attività mitotica².

Le cellule più utilizzate per la rigenerazione del tessuto cartilagineo sono le cellule staminali mesenchimali (MSC) e i condrociti³. Tuttavia, diversi studi hanno riportato limitazioni nell'uso di queste cellule per la rigenerazione⁴. Queste limitazioni includono la differenziazione terminale dei condrociti durante l'espansione estesa in vitro per ottenere la conta cellulare richiesta e la tendenza ipertrofica delle MSC. Questi fattori possono portare alla formazione di tessuto di riparazione con una combinazione non ottimale di fibrocartilagine e ^ialina 5,6,7,8.

La scoperta delle cellule condroprogenitrici (CPC) è nata dalla ricerca di cellule alternative nella cartilagine articolare⁹. Hanno suscitato un immenso interesse a causa della loro somiglianza con le MSC e del loro potenziale condrogenico superiore, il tutto mentre esibivano una ridotta ipertrofia, una combinazione indispensabile ricercata^10,11. A differenza dei condrociti, è stato riportato che queste popolazioni progenitrici mostrano un'aumentata attività replicativa e telomerasi, nonché un'aumentata espressione della proteina 1 dell'omologo del locus notch neurogenico (NOTCH-1) e del fattore di trascrizione SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Esistono due metodi standard per isolare le CPC riportate sia dalla cartilagine che dal menisco, tra cui uno basato sulla loro espressione del recettore delle integrine (CD49e/CD29), isolato attraverso un saggio di adesione della fibronectina - Fibronectin Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors (FAA-CPs), e l'altro basato sul loro accresciuto potenziale migratorio da espianti di cartilagine - Migratory Chondroprogenitors (MCPs)11,13,16,17,^18,19. Numerosi studi in vitro dimostrano la superiorità condrogenica e la ridotta ipertrofia sia di FAA-CPCs che di MCPs rispetto ai condrociti e alle MSC del midollo osseo (BM)-20,21,22,23.

Recenti indagini in vitro che hanno confrontato FAA-CPC con MCP hanno dimostrato l'aumentata capacità di rigenerazione della cartilagine di quest'ultima popolazione progenitrice in condizioni normali di ossigeno²⁴. Questi risultati ottimistici in vitro mostrano una rigenerazione di tipo ialino, incoraggiando ulteriori esperimenti in vivo. Tuttavia, è stato riportato che entrambe le popolazioni di CPC riparano e rigenerano efficacemente la cartilagine nell'OA e in altri disturbi osteocondrali in modelli animali 25,26,27,28,29.

Il nostro laboratorio ha contribuito attivamente alla standardizzazione delle tecniche di isolamento delle CPC e al confronto delle loro caratteristiche fenotipiche con i condrociti e le MSC. Questo articolo fornirà un protocollo dettagliato che spiega i passaggi necessari per isolare e coltivare le cellule residenti della cartilagine, vale a dire condrociti, FAA-CPC e MCP.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato ed è conforme alle norme e alle linee guida in materia dell'Institutional Review Board (Comitato per la Ricerca e l'Etica). Dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, le articolazioni tibio-femorali umane vengono prelevate da pazienti affetti da osteoartrite (OA) (punteggio radiologico Kellgren-Lawrence 4)³⁰ che richiedono la sostituzione totale del ginocchio come parte del loro trattamento. Le articolazioni dei pazienti con segni di tumori, infezioni o artrite infiammatoria (come l'artrite reumatoide o la gotta) sono state escluse dallo studio. Si garantisce che tutte le procedure siano condotte in condizioni sterili, aderendo ai protocolli di laboratorio standard durante tutto il processo sperimentale.

1. Ottenere articolazioni tibio-femorali

1. Ottenere articolazioni del ginocchio (articolazioni tibiofemorali) da donatori umani che richiedono l'amputazione sopra il ginocchio come parte del trattamento o da quelli con osteoartrite di grado^{IV 30} (evidenza radiologica che mostra una marcata riduzione dello spazio articolare con sclerosi condrale) sottoposti a sostituzione totale del ginocchio.
   NOTA: Assicurarsi che il consenso informato sia ottenuto dai pazienti seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Garantire il rispetto delle regole del Comitato Etico e dell'Institutional Review Board.
2. Escludere le articolazioni che mostrano sintomi di infezione o infiammazione.

2. Lavorazione delle articolazioni raccolte

1. Posizionare le articolazioni tibiofemorali prelevate in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in condizioni sterili.
2. Preparare un'area sterile sotto il cofano posizionando un sottopiede sterile. Trasferire le canne raccolte sul sottopad.
3. Stabilizzare le articolazioni tibiofemorali sezionate tenendo l'osso subcondrale con la cartilagine rivolta verso l'alto.
4. Utilizzando una lama di bisturi (n. 22), prelevare trucioli di cartilagine di forma rettangolare dalle aree non portanti per i pazienti con OA entro 1-2 ore dall'ottenimento dell'articolazione.
5. Raccogliere le sezioni di cartilagine di 8 mm x 10 mm dallo strato superficiale allo strato più profondo.
6. Lavare le fette di cartilagine con 1 soluzione di PBS e metterle in una capsula di Petri contenente 1-2 ml di terreno DMEM semplice.
7. Tritare bene le fette di cartilagine fino a una dimensione inferiore a 1 mm x 1 mm x 1 mm con una lama di bisturi (n. 22).
   NOTA: Assicurarsi che le fette di cartilagine o la cartilagine tritata non si secchino; metterli in un terreno di coltura o PBS privo di siero.

3. Isolamento dei condrociti

1. Porre la cartilagine tritata in un pallone verticale T-25 contenente 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) con lo 0,15% di collagenasi di tipo II per la digestione enzimatica. Lasciare il matraccio indisturbato per 12-14 ore in un incubatore a CO₂ , garantendo le condizioni di coltura standard³¹.
   NOTA: Deve essere utilizzato un terreno DMEM-F12 semplice senza tracce di siero, poiché il siero inattiva l'azione enzimatica.
2. Dopo la digestione notturna, trasferire il terreno contenente le cellule rilasciate in una provetta da centrifuga fresca e sterile contenente un volume uguale di DMEM-F12 + 10% di siero fetale bovino (FBS), utilizzando un colino cellulare per separare le cellule dai detriti. Le cellule rilasciate sono i "condrociti".
3. Centrifugare le celle filtrate alla velocità di 1200 x g per 5 minuti a 37 °C.
4. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Ricostituire il pellet ottenuto in 1 mL di terreno e contare le cellule vitali rilasciate utilizzando un saggio di esclusione del blu di tripano.
5. Caricare i condrociti in un pallone T-25 a una concentrazione di 10.000 cellule/cm² ed espanderli fino al numero di passaggio richiesto utilizzando DMEM-F12 contenente il 10% di FBS. Ulteriori componenti del terreno includono acido ascorbico (62 μg/mL), L-glutammina (2,5 mM/L), penicillina-streptomicina (100 UI/mL) e amfotericina-B (2 μg/mL).
6. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni e raccogliere le cellule alla sub-confluenza utilizzando lo 0,125% di tripsina contenente acido etilendiammine tetraacetico (EDTA).

4. Isolamento di condroprogenitori derivati dal saggio di adesione della fibronectina (FAA-CP)

1. 12 ore prima del rilascio dei condrociti, preparare 10 mL di 1x PBS contenente 1 mM di MgCl₂ (10 μL) e 1 mM di CaCl₂ (10 μL) e 100 μL di Fibronectina (10 μL/mL)³².
2. Rivestire il numero richiesto di pozzetti di una piastra a 6 pozzetti (1,5 mL/9,3 cm²) utilizzando la soluzione preparata.
3. Sigillare bene la piastra e conservare in frigorifero per una notte a 4 °C.
4. Inoltre, ottenere trucioli di cartilagine in modo simile a quello spiegato per l'isolamento dei condrociti (passaggi 2.1-2.5).
5. Sottoporre i trucioli di cartilagine a digestione enzimatica sequenziale notturna (pronasi 0,2% per 3 ore; seguita da collagenasi 0,04% tipo II per 12 ore) in un bagno d'acqua agitante mantenuto a 37 °C per ottenere singoli condrociti.
6. Il giorno seguente, rimuovere la piastra a 6 pozzetti rivestita di fibronectina dal frigorifero e rimuovere la fibronectina in eccesso.
   NOTA: L'eccesso di fibronectina deve essere rimosso lentamente e delicatamente senza disturbare il rivestimento sul fondo del pozzetto. La presenza di MgCl₂ (10 μL) e 1 mM di CaCl₂ è fondamentale per garantire l'adesione delle cellule.
7. Aggiungere 2-3 mL di terreno DMEM-F12 semplice nei pozzetti rivestiti.
8. Seminare i condrociti rilasciati sui pozzetti rivestiti ad una densità di carico di 4000 cellule/pozzetto e lasciare la piastra indisturbata per un periodo di 20 minuti.
9. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno in eccesso e le cellule non aderenti. Aggiungere 2-3 mL di terreno di coltura standard come quello utilizzato per i condrociti (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. Mantenere le cellule aderenti in condizioni di coltura standard per 10-12 giorni per ottenere cloni CPC (colonie di >32 cellule).
11. Isolare utilizzando tripsina-EDTA allo 0,125% per 180 s, ri-placcare i cloni con un rapporto di 1 clone/5 cm² ed espandere i CP policlonali arricchiti fino alla confluenza richiesta. Queste cellule ottenute sono denominate "FAA-CPC".
12. Coltura ulteriore delle cellule in terreno DMEM-F12 + 10% FBS + fattore di crescita trasformante beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + fattore di crescita dei fibroblasti (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: L'incubazione delle cellule su piastre rivestite di fibronectina non deve superare i 20 minuti, poiché anche i condrociti possono iniziare ad aderire. Durante il periodo di adesione di 20 minuti, il terreno deve essere privo di siero. Successivamente, le cellule che aderiscono per formare i cloni devono essere coltivate in un terreno contenente anche FBS. I cloni devono essere isolati solo dopo essersi assicurati che ogni clone abbia più di 32 cellule; Questo per evitare amplificatori di transito. Un'ulteriore espansione dei cloni dopo la tripsinizzazione dovrebbe includere i fattori di crescita aggiuntivi menzionati. Una densità di carico di 4000 condrociti/9,3^cm2 di una piastra rivestita di fibronectina, dopo un'incubazione di 20 minuti seguita da un lavaggio, determina l'adesione di 80-100 cellule in totale. Di questi, circa 20 cloni progrediranno per crescere e raggiungere un raddoppio della popolazione di 5 entro 10-12 giorni.

5. Isolamento dei condroprogenitori migratori

1. Rasare gli espianti di cartilagine (10 mm x 5 mm x 1 mm) dall'articolazione prelevata e posizionarli in una piastra sterile a 6 pozzetti contenente terreno DMEM-F12 con il 10% di FBS e 10 mM di Glutamax (2-3 espianti/pozzetto)³³.
2. Lasciare la piastra con gli espianti indisturbata per 48 ore in un'incubatrice a CO₂ mantenuta a 37 °C.
3. Dopo 2 giorni, trasferire gli espianti in una provetta da centrifuga contenente 10 mL di soluzione di collagenasi allo 0,1% per la digestione enzimatica. Incubare la provetta a 37 °C per 2 ore.
   NOTA: Gli espianti devono essere risciacquati con 1x PBS prima della digestione enzimatica, poiché tracce di siero possono inattivare l'azione enzimatica. Per il lavaggio, immergere gli espianti in una capsula di Petri riempita con 2-3 mL di 1x PBS; Questo anche per garantire la non contaminazione con i condrociti rilasciati. La manipolazione degli espianti deve essere ridotta al minimo, e questo per evitare di stressare i progenitori che hanno iniziato a migrare.
4. Dopo la digestione, sciacquare gli espianti con 1x PBS e rimetterli negli stessi pozzetti della piastra contenente terreno DMEM-F12 fresco con il 10% di FBS e 10 mM di terreno Glutamax.
5. Mantenere la piastra in condizioni di coltura standard nell'incubatore. Osservare la migrazione dei condroprogenitori nei giorni successivi.
6. Al raggiungimento della subconfluenza, raccogliere gli MCP utilizzando lo 0,125% di tripsina contenente EDTA.
7. Espandere gli MCP utilizzando il mezzo di espansione standard, che include DMEM-F12, che contiene il 10% di FBS e 10 mM di Glutamax.

6. Caratterizzazione fenotipica di condrociti, FAA-CPs e MCPs

1. Analisi citofluorimetrica (FACS)
   NOTA: Per l'analisi FACS dei gruppi cellulari raccolti, vengono seguiti i seguenti passaggi.
   1. Tripsinizzare le celle come da protocollo standard utilizzando tripsina allo 0,125% e centrifugare a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente per ottenere il pellet della cella.
   2. Scartare il surnatante, lavare e risospendere il pellet con 1x PBS.
   3. Trasferire la sospensione in tubi etichettati per FACS.
   4. Dividere equamente la sospensione in due tubi: un tubo "non colorato" che funge da controllo (sospensione cellulare senza anticorpi) e tubi "colorati" che fungono da test (sospensione cellulare con anticorpi).
   5. Seguire la scheda tecnica dei singoli anticorpi/marcatori Cluster of differentiation (CD) per la colorazione. Gli anticorpi per il confronto includono CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcatori di espressione positivi); CD34-PE, CD45-FITC e CD14-FITC (marcatori di espressione negativa)^34,35; CD166-BB515 e CD146-PE (potenziali marcatori condrogenici)^36,37.
      NOTA: I marcatori CD sono sensibili alla luce. Per garantire che i passaggi vengano eseguiti al buio.
   6. Incubare la sospensione cellulare con anticorpo per 30 minuti al buio.
   7. Dopo la colorazione, aggiungere 1 mL di 1x PBS alle provette e centrifugare a 1200 x g, 5 min, a temperatura ambiente per ottenere il pellet cellulare.
   8. Scartare tre quarti del surnatante. Risospendere il pellet nel contenuto di surnatante rimanente mediante triturazione delicata.
   9. Procedere con l'analisi FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: l'analisi qRT-PCR dell'espressione genica comporta la valutazione del collagene di tipo I (COL1A1), del collagene di tipo X (COL10A1) e del fattore di trascrizione correlato a Runt (RUNX2) per l'espressione ipertrofica e di SOX-9, Aggrecan (ACAN) e collagene di tipo II (COL2A1) per la condrogenesi.

1. Estrarre l'RNA dai gruppi cellulari utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
2. Dopo l'estrazione, valutare il rapporto A₂₆₀/A₂₈₀ e la concentrazione di RNA.
3. Utilizzare 280 ng dell'RNA estratto per costruire il DNA complementare (cDNA).
4. Avviare la qRT-PCR utilizzando Sybr Green, ogni reazione contiene una concentrazione finale di 7 ng di cDNA su un termociclatore.
5. Normalizzare l'espressione relativa dell'mRNA di ciascun gene al gene di riferimento GAPDH (ΔCt).
6. Calcola l'espressione relativa di ciascun gene utilizzando la tecnica ^2-ΔΔCt confrontando il valore di ΔCt di ogni singolo gene con quello dei FAA-CP (ΔΔCt)³⁷.

8. Differenziazione multilineage

NOTA: I mezzi differenziali disponibili in commercio inducono la differenziazione trilineare in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche.

1. Per la differenziazione adipogenica, seminare cellule con una densità di carico di 1000 cellule/cm² in una piastra di coltura cellulare e coltivare utilizzando un terreno di differenziazione adipogenico (cambio del mezzo - una volta ogni 3 giorni) fino a una subconfluenza dell'80% per 3 settimane.
2. Per la differenziazione osteogenica e condrogenica, seguire il sistema di coltura a pellet di 28 giorni³⁸.
3. Centrifugare 0,5 x 10⁶ celle a 400 x g per 12 minuti a 37 °C per formare pellet e avviare la differenziazione utilizzando un mezzo di differenziazione osteogenico e condrogenico.
4. Fissare, incorporare e sezionare i pellet per la colorazione di conferma (passaggio 9).

9. Colorazione di conferma

1. Nel caso di cellule di linea adipogenica, fissare le cellule con formalina tamponata, lavare e colorare con Oil Red O (0,5%). Macchiare anche i controlli (coltivati su un terreno DMEM standard con il 10% di FBS).
2. Osservare al microscopio e acquisire le immagini.
3. Per le cellule di lignaggio osteogenico differenziato, colorare con Rosso Alizarina (2%).
   NOTA: Per le cellule differenziate condrogeniche sono applicabili più protocolli di colorazione di conferma.
4. Colorazione Alcian Blue: Colorare le celle fissate con Alcian blue per 5 minuti e controcolorare con Rosso Neutro.
5. Per valutare il contenuto di glicosaminoglicani (GAG), eseguire la colorazione con Safranin O: colorare i vetrini con Iron Hematoxylin di Wiegert, seguita da una successiva incubazione con alcol acido (1%), soluzione fast green (0,05%), acido acetico (1%) e soluzione di Safranin O (1%).
6. Colorazione blu di toluidina: colorare i vetrini con blu di toluidina (0,1%) per 5 minuti.
7. Colorazione PicroSirius Red: Colorare i vetrini con Picrosirius Red (0,1%) e controcolorare con il colorante Hematoxylin.
   NOTA: Dopo la colorazione, disidratare i vetrini con alcol graduato e chiarirli con xilene. Montare i vetrini utilizzando il montante in polistirene xilene dibutilftalato (DPX), osservarli al microscopio e acquisire immagini.
8. Per la colorazione immunoistochimica (collagene di tipo II) del pellet differenziato condrogenico, sottoporre le sezioni del pellet al recupero enzimatico dell'antigene utilizzando gli enzimi pronasi (1 mg/mL) e ialuronidasi (2,5 mg/mL).
9. Incubare le sezioni con un anticorpo monoclonale primario di topo anti-collagene di tipo II, seguito da un anticorpo secondario di capra marcato con HRP 1:250.
10. Colorare i vetrini con il cromogeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e contrastarli con ematossilina.
11. Osserva al microscopio e cattura le immagini.

10. Determinazione del contenuto di GAG/DNA

1. Digerire i pellet differenziati condrogenici utilizzando una soluzione di papaina-cisteina a 65 °C per 16 h.
2. Stimare la concentrazione di DNA utilizzando il reagente Picrogreen³⁸ e acquisire l'intensità della fluorescenza a lunghezze d'onda - eccitazione: 480 nm, emissione: 520 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA.
3. Valutare il contenuto totale di GAG utilizzando il metodo del colorante dimetilmetilene blu³⁸.
4. Misura la densità ottica a 525 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA.
5. Normalizzare i valori GAG con i valori del DNA e calcolare il rapporto GAG/DNA totale.

Risultati

Da 86,9 mg di fette di cartilagine, è stata notata una resa di cellule condrocitarie di 1,72 x 10⁵ cellule. Al momento del caricamento, i condrociti aderiscono prontamente, presentando un aspetto iniziale arrotondato di ciottoli e trasformandosi in uno stato fibroblastico dopo un'ulteriore espansione (Figura 1 A, B). La semina di questi condrociti su piastre di fibronectina si traduce tipicamente in un'adesione del 2%, con ogni c...

Discussione

La potenziale rigenerazione della cartilagine articolare, contenente tessuto ialino, può essere ottenuta attraverso l'ottimizzazione dei suoi due tipi cellulari nativi: condrociti e condroprogenitori. Mentre un'ampia ricerca sui condrociti ha fornito preziose informazioni sul loro ruolo nella riparazione della cartilagine, le domande sulla natura del tessuto rigenerato hanno spinto gli sforzi per migliorare il loro fenotipo ed esplorare terapie alternative³. I co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072