Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan eklem kıkırdağından kondrositlerin, Fibronektin Adezyon Testinden türetilmiş Kondroprojenitörlerin (FAA-CP'ler) ve Göçmen Kondroprojenitörlerin (MCP'ler) izolasyonunu detaylandırır. Bu hücreleri izole etmek ve karakterize etmek için enzimatik sindirim, fibronektin yapışması ve migrasyon bazlı testleri kapsar.

Özet

Son zamanlarda ayrı bir alt popülasyon olarak tanımlanan kondroprogenitör hücreler (CPC'ler), mezenkimal özellikleri, artmış kondrogenez ve sınırlı hipertrofik özellikleri nedeniyle umut vaat etmektedir. Progenitörlerin zenginleştirilmesi, kondrositlere kıyasla üstün potansiyel gösteren Fibronektin Adezyon Testi türetilmiş Kondroprojenitörler (FAA-CP'ler) ve Göçmen Kondroprojenitörler (MCP'ler) ile diferansiyel fibronektin adezyonu ve migrasyon bazlı eksplant testleri ile elde edilir. Bu makale, yerleşik kıkırdak türevi hücrelerin, yani kondrositlerin ve kondroprojenitörlerin izole edilmesinin ayrıntılarını incelemektedir. Kondrosit araştırmalarından elde edilen değerli bilgiler kıkırdak onarımını anlamamıza katkıda bulunurken, devam eden çabalar kondroprogenitörlerin kullanımına ve alternatif bir terapötik yaklaşım olarak potansiyellerinin araştırılmasına yöneliktir. Ek olarak, bu metodoloji makalesi, kıkırdaktan üç spesifik hücre tipini izole etmek için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlar: kondrositler, FAA-CP'ler ve MCP'ler. Standartlaştırılmış prosedürleri takip ederek, bu protokol bu hücre alt tiplerinin başarılı bir şekilde ekstraksiyonunu kolaylaştırır. Kapsamlı araştırmalara dayanan makale, farklı alt kümeleri izole etmek için kullanılan karmaşık tekniklere ve kültürlerini genişletmek ve sürdürmek için gereken optimize edilmiş kültür koşullarına odaklanmaktadır. Metodoloji, insan eklem kıkırdağından türetilmiş kondrositlerin enzimatik izolasyonunu, sıralı enzimatik sindirimi takiben diferansiyel fibronektin adezyonunu ve kıkırdakta yerleşik hücreler elde etmek için migrasyona dayalı eksplant testlerini kapsar.

Giriş

Hücre bazlı rejeneratif tedavinin ortaya çıkışı, osteoartrit (OA) ve kondral kusurlar gibi kıkırdak ile ilgili rahatsızlıkların tedavisinde önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir1. Eklemlerdeki kıkırdağın parçalanması veya yaralanması ile karakterize edilen bu bozukluklar, tedavi sırasında önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Eklem kıkırdağının kendi kendine onarımının, anöral mimarisi, avasküler yapısı ve düşük mitotik aktivitesi nedeniyle sınırlı olduğu bildirilmektedir2.

Kıkırdak dokusunun rejenerasyonu için en çok kullanılan hücreler Mezenkimal Kök Hücreler (MSC'ler) ve kondrositlerdir3. Bununla birlikte, birkaç çalışma, bu hücrelerin rejenerasyon için kullanılmasında sınırlamalar bildirmiştir4. Bu sınırlamalar, gerekli hücre sayısını ve MSC'lerin hipertrofik eğilimini elde etmek için genişletilmiş in vitro genişleme sırasında kondrositlerin terminal farklılaşmasını içerir. Bu faktörler, fibrokartilaj ve hiyalin 5,6,7,8'in optimal olmayan bir kombinasyonu ile onarım dokusunun oluşumuna neden olabilir.

Kondroprogenitör hücrelerin (CPC'ler) keşfi, eklem kıkırdağı9'da alternatif hücreler arayışından kaynaklandı. MSC'lere benzerlikleri ve üstün kondrojenik potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi uyandırdılar ve tüm bunlar10,11'den sonra aranan vazgeçilmez bir kombinasyon olan azaltılmış hipertrofi sergilerken. Kondrositlerin aksine, bu progenitör popülasyonların artmış replikatif ve telomeraz aktivitesinin yanı sıra Nörojenik lokus çentik homolog proteini 1 (NOTCH-1) ve SRY-box transkripsiyon faktörü 9'un (SOX-9) artan ekspresyonunu sergilediği bildirilmiştir12,13,14,15. Hem kıkırdaktan hem de menisküsten bildirilen TBM'leri izole etmek için, biri integrin reseptörü (CD49e/CD29) ekspresyonuna dayanan, bir fibronektin adezyon testi ile izole edilen iki standart yöntem vardır - Fibronektin Adezyon Testi türetilmiş Kondroprojenitörler (FAA-CP'ler) ve diğeri kıkırdak eksplantlarından - Göçmen Kondroprojenitörlerden (MCP'ler) artan göç potansiyellerine dayanmaktadır11,13,16,17,18,19. Çok sayıda in vitro çalışma, kondrositler ve kemik iliği (BM)-MSC'lere kıyasla hem FAA-CPC'lerin hem de MCP'lerin kondrojenik üstünlüğünü ve azalmış hipertrofisini göstermektedir 20,21,22,23.

FAA-CPC'leri MCP'lerle karşılaştıran son in vitro araştırmalar, normal oksijen koşulları altında ikinci progenitör popülasyonun gelişmiş kıkırdak rejenerasyon kapasitesini göstermiştir24. Bu iyimser in vitro sonuçlar, in vivo deneyleri daha da teşvik eden hiyalin benzeri bir rejenerasyonu göstermektedir. Bununla birlikte, her iki CPC popülasyonunun da OA'da kıkırdağı ve hayvan modellerinde diğer osteokondral bozuklukları etkili bir şekilde onardığı ve rejenere ettiği bildirilmiştir 25,26,27,28,29.

Laboratuvarımız, KKG izolasyon tekniklerinin standardize edilmesine ve fenotipik özelliklerinin kondrositler ve MKH'ler ile karşılaştırılmasına aktif olarak katkıda bulunmuştur. Bu makale, kıkırdakta yerleşik hücrelerin, yani kondrositlerin, FAA-CPC'lerin ve MCP'lerin izole edilmesi ve kültürlenmesinde yer alan adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.

Protokol

Protokol onaylanmıştır ve Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (Araştırma ve Etik Kurul) uygun yönetmelik ve yönergelerine uygundur. Yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, insan tibiofemoral eklemleri, tedavilerinin bir parçası olarak total diz protezi gerektiren osteoartrit (OA) hastalarından (Kellgren-Lawrence radyolojik skoru 4)30 temin edilir. Herhangi bir tümör, enfeksiyon veya inflamatuar artrit (romatoid artrit veya gut gibi) belirtisi olan hastaların eklemleri çalışmadan çıkarıldı. Deney süreci boyunca tüm işlemlerin steril koşullar altında, standart laboratuvar protokollerine bağlı kalınarak yürütülmesi sağlanır.

1. Tibiofemoral eklemlerin elde edilmesi

  1. Tedavinin bir parçası olarak diz üstü amputasyon gerektiren insan donörlerden veya total diz protezi geçiren Grade IV osteoartrit30 (kondral skleroz ile eklem boşluğunun belirgin şekilde azaldığını gösteren radyolojik kanıtlar) olanlardan diz eklemleri (tibiofemoral eklemler) alın.
    NOT: Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygun olarak hastalardan bilgilendirilmiş onam alındığından emin olun. Etik Kurul ve Kurumsal İnceleme Kurulu kurallarına uyulmasını sağlamak.
  2. Enfeksiyon veya iltihap belirtileri gösteren eklemleri dışlayın.

2. Hasat edilen eklemlerin işlenmesi

  1. Hasat edilen tibiofemoral eklemleri steril koşullar altında 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine yerleştirin.
  2. Steril bir alt ped yerleştirerek kaputun altına steril bir alan hazırlayın. Hasat edilen eklemleri alt pedin üzerine aktarın.
  3. Kıkırdak yukarı bakacak şekilde subkondral kemiği tutarak kesitli tibiofemoral eklemleri stabilize edin.
  4. Bir neşter bıçağı (no. 22) kullanarak, eklemi elde ettikten sonraki 1-2 saat içinde OA hastaları için ağırlık taşımayan bölgelerden dikdörtgen şekilli kıkırdak talaşı toplayın.
  5. 8 mm x 10 mm'lik kıkırdak bölümlerini yüzeysel tabakadan daha derin tabakaya doğru hasat edin.
  6. Kıkırdak dilimlerini 1x PBS solüsyonu ile yıkayın ve 1-2 mL düz DMEM ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin.
  7. Kıkırdak dilimlerini bir neşter bıçağı (no.22) ile 1 mm x 1 mm x 1 mm'den daha küçük bir boyuta kadar güzelce kıyın.
    NOT: Kıkırdak dilimlerinin veya kıyılmış kıkırdağın kurumamasına dikkat edin; bunları serum içermeyen bir kültür ortamına veya PBS'ye yerleştirin.

3. Kondrositlerin izolasyonu

  1. Kıyılmış kıkırdağı, enzimatik sindirim için% 0.15 kollajenaz tip II içeren 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium F12 (DMEM-F12) içeren dik bir T-25 şişesine yerleştirin. Şişeyi bir CO2 inkübatörde 12-14 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın, standart kültür koşullarını sağlayın31.
    NOT: Serum enzimatik etkiyi etkisiz hale getirdiği için serum kalıntısı olmayan düz DMEM-F12 ortamı kullanılmalıdır.
  2. Gece boyunca sindirimi takiben, salınan hücreleri içeren ortamı, hücreleri döküntülerden ayırmak için bir hücre süzgeci kullanarak eşit hacimde DMEM-F12 +% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren taze, steril bir santrifüj tüpüne aktarın. Serbest bırakılan hücreler "kondrositler" dir.
  3. Filtrelenmiş hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1200 x g hızında santrifüjleyin.
  4. Peleti bozmadan süpernatanı atın. Elde edilen peleti 1 mL ortamda sulandırın ve bir tripan mavisi dışlama testi kullanılarak salınan canlı hücreleri sayın.
  5. Kondrositleri 10.000 hücre / cm² konsantrasyonda bir T-25 şişesine yükleyin ve% 10 FBS içeren DMEM-F12 kullanarak gerekli geçiş numarasına genişletin. Ortamdaki ek bileşenler arasında askorbik asit (62 μg/mL), L-glutamin (2.5 mM/L), penisilin-streptomisin (100 IU/mL) ve amfoterisin-B (2 μg/mL) bulunur.
  6. Ortamı her 3 günde bir yenileyin ve Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içeren %0.125 Tripsin kullanarak hücreleri alt birleşimde hasat edin.

4. Fibronektin Yapışma Testinden Türetilmiş Kondroprojenitörlerin (FAA-CP'ler) İzolasyonu

  1. Kondrositlerin serbest bırakılmasından 12 saat önce, 1 mM MgCl2 (10 μL) ve 1 mM CaCl2 (10 μL) ve 100 μL Fibronektin (10 μL / mL) içeren 10 mL 1x PBS hazırlayın32.
  2. Hazırlanan çözeltiyi kullanarak 6 oyuklu bir plakanın (1,5 mL / 9,3cm2) gerekli sayıda kuyusunu kaplayın.
  3. Plakayı sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 °C'de soğutun.
  4. Ek olarak, kondrositlerin izolasyonu için açıklanana benzer bir şekilde kıkırdak talaşı elde edin (adım 2.1-2.5).
  5. Tek tek kondrositler elde etmek için 37 ° C'de tutulan çalkalama su banyosunda kıkırdak talaşlarını gece boyunca sıralı enzimatik sindirime (3 saat boyunca% 0.2 Pronaz; ardından 12 saat boyunca% 0.04 Kollajenaz tip II) tabi tutun.
  6. Ertesi gün, Fibronektin kaplı 6 oyuklu plakayı buzdolabından çıkarın ve fazla Fibronektin'i çıkarın.
    NOT: Fazla Fibronektin, kuyu dibindeki kaplamayı bozmadan yavaş ve nazikçe çıkarılmalıdır. Hücrelerin bağlanmasını sağlamak için MgCl2 (10 μL) ve 1 mM CaCl2 varlığı çok önemlidir.
  7. Kaplanmış kuyucuklara 2-3 mL düz DMEM-F12 ortamı ekleyin.
  8. Serbest bırakılan kondrositleri 4000 hücre / kuyu yükleme yoğunluğunda kaplanmış kuyucuklara tohumlayın ve plakayı 20 dakikalık bir süre boyunca rahatsız etmeden bırakın.
  9. İnkübasyon sonrası, fazla ortamı ve yapışmayan hücreleri çıkarın. Kondrositler için kullanılan 2-3 mL standart büyüme ortamı ekleyin (DMEM-F12 +% 10 FBS).
  10. CPC klonları (>32 hücreli koloniler) elde etmek için yapışık hücreleri standart kültür koşulları altında 10-12 gün koruyun.
  11. 180 saniye boyunca% 0.125 tripsin-EDTA kullanarak izole edin, klonları 1 klon / 5 cm² oranında yeniden plakalayın ve zenginleştirilmiş poliklonal CP'leri gerekli birleşim noktasına kadar genişletin. Elde edilen bu hücreler "FAA-CPC'ler" olarak adlandırılır.
  12. Hücreleri DMEM-F12 ortamında +% 10 FBS + dönüştürücü büyüme faktörü beta 2 (TGFβ2: 1 ng / mL) + fibroblast büyüme faktörü (FGF2: 5 ng / mL) içinde daha fazla kültürleyin.
    NOT: Hücrelerin fibronektin kaplı plakalar üzerindeki inkübasyonu 20 dakikayı geçmemelidir, çünkü kondrositler de yapışmaya başlayabilir. 20 dakikalık yapışma süresi boyunca, ortam serumdan yoksun olmalıdır. Daha sonra, klonlar oluşturmak için yapışan hücreler, ek olarak FBS içeren bir ortamda kültürlenmelidir. Klonlar, ancak her klonun 32'den fazla hücreye sahip olduğundan emin olduktan sonra izole edilmelidir; Bu, transit amplifikatörlerden kaçınmak içindir. Tripsinizasyondan sonra klonların daha fazla genişlemesi, belirtilen ek büyüme faktörlerini içermelidir. Fibronektin kaplı bir plakanın 4000 kondrosit/9.3cm2'lik bir yükleme yoğunluğu, 20 dakikalık bir inkübasyon ve ardından bir yıkamanın ardından, toplamda 80-100 hücrenin yapışması ile sonuçlanır. Bunlardan yaklaşık 20 klon büyümek için ilerleyecek ve 10-12 gün içinde 5'i ikiye katlayan bir popülasyona ulaşacak.

5. Göçmen kondroprojenitörlerin izolasyonu

  1. Hasat edilen eklem ekleminden kıkırdak eksplantlarını (10 mm x 5 mm x 1 mm) tıraş edin ve bunları %10 FBS ve 10 mM Glutamax (2-3 eksplant/kuyucuk) içeren DMEM-F12 ortamı içeren steril 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin33.
  2. 37 ° C'de tutulan bir CO2 inkübatörde 48 saat boyunca eksplantlarla birlikte plakayı rahatsız edilmeden bırakın.
  3. 2 gün sonra, eksplantları enzimatik sindirim için 10 mL% 0.1 kollajenaz çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
    NOT: Eksplantların enzimatik sindirimden önce 1x PBS ile durulanması gerekir, çünkü serum izleri enzim etkisini etkisiz hale getirebilir. Yıkamak için, eksplantları 2-3 mL 1x PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına batırın; Bu aynı zamanda salınan herhangi bir kondrosit ile kontaminasyon olmamasını sağlamak içindir. Eksplantların işlenmesi minimumda tutulmalıdır ve bu, göç etmeye başlayan ataları strese sokmaktan kaçınmak içindir.
  4. Sindirimden sonra, eksplantları 1x PBS ile durulayın ve %10 FBS ve 10 mM Glutamax ortamı içeren taze DMEM-F12 ortamı içeren plakanın aynı kuyucuklarına geri yerleştirin.
  5. Plakayı inkübatörde standart kültür koşullarında tutun. Sonraki günlerde kondroprojenitörlerin göçünü gözlemleyin.
  6. Alt birleşmeye ulaşıldığında, EDTA'nın %0.125'ini Tripsin kullanarak MCP'leri hasat edin.
  7. %10 FBS ve 10 mM Glutamax içeren DMEM-F12'yi içeren standart genişletme ortamını kullanarak MCP'leri genişletin.

6. Kondrositlerin, FAA-CP'lerin ve MCP'lerin fenotipik karakterizasyonu

  1. Flow Sitometrik Analiz (FACS)
    NOT: Hasat edilen hücre gruplarının FACS analizi için aşağıdaki adımlar izlenir.
    1. Hücre peletini elde etmek için% 0.125 Tripsin kullanarak hücreleri standart protokole göre tripsinize edin ve 1200 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında santrifüjleyin.
    2. Süpernatanı atın, yıkayın ve peleti 1x PBS ile yeniden askıya alın.
    3. Süspansiyonu FACS için etiketli tüplere aktarın.
    4. Süspansiyonu eşit olarak iki tüpe bölün: kontrol görevi gören 'boyanmamış' bir tüp (antikorsuz hücre süspansiyonu) ve test görevi gören 'lekeli' tüpler (antikorlu hücre süspansiyonu).
    5. Boyama için bireysel antikorların/Farklılaşma kümesi (CD) belirteçlerinin teknik veri sayfasını takip edin. Karşılaştırma için antikorlar arasında CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (pozitif ekspresyon belirteçleri); CD34-PE, CD45-FITC ve CD14-FITC (negatif ekspresyon belirteçleri)34,35; CD166-BB515 ve CD146-PE (potansiyel kondrojenik belirteçler)36,37.
      NOT: CD işaretleyicileri ışığa duyarlıdır. Adımların karanlıkta yapıldığından emin olmak için.
    6. Hücre süspansiyonunu karanlıkta 30 dakika boyunca antikorla inkübe edin.
    7. Boyama sonrası, tüplere 1 mL 1x PBS ekleyin ve hücre peletini elde etmek için 1200 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında santrifüjleyin.
    8. Süpernatantın dörtte üçünü atın. Kalan süpernatan içerikteki peleti hafif öğütme ile yeniden süspanse edin.
    9. FACS analizi için devam edin.

7. qRT-PCR

NOT: Gen ekspresyonunun qRT-PCR analizi, hipertrofik ekspresyon için Kollajen tip I (COL1A1), Kollajen tip X (COL10A1) ve Runt ile ilişkili transkripsiyon faktörünün (RUNX2) ve kondrogenez için SOX-9, Aggrekan (ACAN) ve Kollajen tip II'nin (COL2A1) değerlendirilmesini içerir.

  1. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak hücre gruplarından RNA'yı çıkarın.
  2. Ekstraksiyon sonrası, A260 / A280 oranını ve RNA konsantrasyonunu değerlendirin.
  3. Tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturmak için ekstrakte edilen RNA'nın 280 ng'sini kullanın.
  4. Sybr Green kullanarak qRT-PCR'yi başlatın, her reaksiyon bir termosiklatör üzerinde 7 ng cDNA'lık bir nihai konsantrasyon içerir.
  5. Her genin bağıl mRNA ekspresyonunu GAPDH referans temizlik genine (ΔCt) normalleştirin.
  6. Her bir genin ΔCt değerini FAA-CP'lerinkiyle (ΔΔCt) karşılaştırarak 2-ΔΔCt tekniğini kullanarak her bir genin göreceli ifadesini hesaplayın37.

8. Çok soylu farklılaşma

NOT: Ticari olarak temin edilebilen diferansiyel ortam, adipfojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara üç soylu farklılaşmaya neden olur.

  1. Adipojenik farklılaşma için, bir hücre kültürü plakasında 1000 hücre /cm2 yükleme yoğunluğunda tohum hücreleri ve 3 hafta boyunca% 80'lik bir alt birleşmeye kadar adipojenik farklılaşma ortamı (orta değişim - 3 günde bir) kullanarak kültür.
  2. Osteojenik ve kondrojenik farklılaşma için 28 günlük pelet kültürü sisteminitakip edin 38.
  3. Peletler oluşturmak ve osteojenik ve kondrojenik farklılaşma ortamı kullanarak farklılaşmayı başlatmak için 37 ° C'de 12 dakika boyunca 400 x g'da 0.5 x10 6 hücreyi santrifüjleyin.
  4. Doğrulayıcı boyama için peletleri sabitleyin, gömün ve bölümlere ayırın (9. adım).

9. Doğrulayıcı boyama

  1. Adipojenik soy hücreleri söz konusu olduğunda, hücreleri tamponlu formalin ile sabitleyin, yıkayın ve Yağ Kırmızısı O (% 0.5) ile boyayın. Kontrolleri de boyayın (% 10 FBS ile standart bir DMEM ortamında kültürlenmiş).
  2. Mikroskop altında gözlemleyin ve görüntüleri elde edin.
  3. Farklılaşmış osteojenik soy hücreleri için Alizarin Kırmızısı (% 2) ile boyayın.
    NOT: Kondrojenik farklılaşmış hücreler için çoklu doğrulayıcı boyama protokolleri uygulanabilir.
  4. Alcian Blue boyama: Sabit hücreleri 5 dakika boyunca Alcian mavisi ile boyayın ve Nötr Kırmızı ile karşı boyayın.
  5. Glikozaminoglikan (GAG) içeriğini değerlendirmek için Safranin O boyaması yapın: Slaytları Wiegert'in Demir Hematoksilen ile boyayın ve ardından asit alkol (% 1), hızlı yeşil çözelti (% 0.05), asetik asit (% 1) ve Safranin O çözeltisi (% 1) ile inkübasyon yapın.
  6. Toluidin Mavisi boyama: Slaytları 5 dakika boyunca Toluidin Mavisi (% 0.1) ile boyayın.
  7. PicroSirius Kırmızı boyama: Slaytları Picrosirius Red (% 0.1) ile boyayın ve Hematoksilen boyası kullanarak boyayın.
    NOT: Boyamanın ardından, slaytları dereceli alkol kullanarak kurutun ve ksilen kullanarak temizleyin. Dibutilftalat Polistiren Ksilen (DPX) montaj aparatı kullanarak slaytları monte edin, mikroskop altında gözlemleyin ve görüntü elde edin.
  8. Kondrojenik diferansiye peletin immünohistokimyası (tip II kollajen) boyaması için, pelet bölümlerini pronaz (1 mg / mL) ve hyaluronidaz (2.5 mg / mL) enzimleri kullanılarak enzimatik antijen alımına tabi tutun.
  9. Bölümleri birincil fare monoklonal anti-kollajen tip II antikoru ile inkübe edin, ardından 1: 250 ikincil HRP etiketli keçi anti-fare antikoru ile inkübe edin.
  10. Slaytları 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) kromojen ile boyayın ve Hematoksilen kullanarak boyayın.
  11. Mikroskop altında gözlemleyin ve görüntü yakalayın.

10. GAG/DNA içeriğinin belirlenmesi

  1. Kondrojenik farklılaşmış peletleri papain-sistein solüsyonu kullanarak 65 ° C'de 16 saat boyunca sindirin.
  2. Picrogreen reaktifi38 kullanarak DNA konsantrasyonunu tahmin edin ve dalga boylarında floresan yoğunluğunu elde edin - uyarma: 480 nm, emisyon: 520 nm bir ELISA plaka okuyucu kullanarak.
  3. Dimetil metilen mavisi boya yöntemini38 kullanarak toplam GAG içeriğini değerlendirin.
  4. Bir ELISA plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 525 nm'de ölçün.
  5. GAG değerlerini DNA değerlerine normalleştirin ve toplam GAG/DNA oranını hesaplayın.

Sonuçlar

86.9 mg kıkırdak diliminden, 1.72 x 105 hücreli bir kondrosit hücre verimi kaydedildi. Yükleme üzerine, kondrositler hemen yapışır, başlangıçta yuvarlak bir parke taşı görünümü sunar ve daha fazla genişleme üzerine fibroblastik bir duruma dönüşür (Şekil 1 A,B). Bu kondrositlerin fibronektin plakalarına ekilmesi tipik olarak% 2 yapışma ile sonuçlanır, her hücre klonal büyümeye uğrar (

Tartışmalar

Hiyalin dokusu içeren eklem kıkırdağının potansiyel rejenerasyonu, iki doğal hücre tipinin optimizasyonu yoluyla elde edilebilir: kondrositler ve kondroprojenitörler. Kondrositler üzerine yapılan kapsamlı araştırmalar, kıkırdak onarımındaki rolleri hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, rejenere dokunun doğası hakkındaki sorular, fenotiplerini geliştirme ve alternatif tedavileri keşfetme çabalarına yol açmıştır3. Nispeten yen...

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Entelektüel katkıları için Bayan Bhavini Krishnan ve Bayan Merin Mary Zachariah'a ve altyapı desteği için Kök Hücre Araştırma Merkezi'ne (inStem Bengaluru'nun bir birimi), Fizyoloji Bölümü, Christian Medical College, Vellore'ye teşekkür ederiz. Devam eden projeler Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Hindistan Hükümeti, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (CRG/2022/004277), Hindistan Hükümeti ve Akışkan Araştırma Hibeleri, Christian Medical College, Vellore tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

Referanslar

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163 (2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3, (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203 (2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39 (2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246 (2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421 (2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462 (2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614 (2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966 (2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11 (2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685 (2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104 (2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052 (2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93 (2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536 (2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588 (2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66 (2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685 (2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106 (2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119 (2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713 (2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KondrositlerKondroprojenit rlerFibronektin Adezyon DeneyiG men Kondroprojenit rlerMezenkimal zelliklerKondrojenezHipertrofik zelliklerK k rdak TamiriH cre zolasyon ProtokolEnzimatik SindirimK lt r Ko ullarK k rdakta Yerle ik H crelerFarkl la ma Deneyleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır