Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Zusammenfassung

Chondroprogenitorzellen (CPCs), die kürzlich als eigenständige Subpopulation identifiziert wurden, sind aufgrund ihrer mesenchymalen Eigenschaften, ihrer erhöhten Chondrogenese und ihrer begrenzten hypertrophen Merkmale vielversprechend. Die Anreicherung der Vorläuferzellen wird durch differentielle Fibronektin-Adhäsions- und migrationsbasierte Explantat-Assays erreicht, wobei Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorische Chondroprogenitoren (MCPs) im Vergleich zu Chondrozyten ein überlegenes Potenzial aufweisen. Dieser Artikel befasst sich mit den Details der Isolierung von residenten Knorpelzellen, nämlich Chondrozyten und Chondroprogenitoren. Während wertvolle Erkenntnisse aus der Chondrozytenforschung zu unserem Verständnis der Knorpelreparatur beitragen, konzentrieren sich die laufenden Bemühungen auf den Einsatz von Chondroprogenitoren und die Erforschung ihres Potenzials als alternativer Therapieansatz. Darüber hinaus bietet dieser Methodenartikel ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von drei spezifischen Zelltypen aus Knorpel: Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs. Durch die Befolgung standardisierter Verfahren erleichtert dieses Protokoll die erfolgreiche Extraktion dieser Zellsubtypen. Basierend auf umfangreicher Forschung konzentriert sich der Artikel auf die komplizierten Techniken, die zur Isolierung der verschiedenen Untergruppen verwendet werden, und auf die optimierten Kulturbedingungen, die für die Erweiterung und Aufrechterhaltung ihrer Kulturen erforderlich sind. Die Methodik umfasst die enzymatische Isolierung von Chondrozyten aus dem menschlichen Gelenkknorpel, die differentielle Fibronektinadhäsion nach sequenziellem enzymatischem Verdau und migrationsbasierte Explantat-Assays zur Gewinnung knorpelresidenter Zellen.

Einleitung

Das Aufkommen der zellbasierten regenerativen Therapie stellt einen bedeutenden Ansatz zur Behandlung von Knorpelbeschwerden wie Osteoarthritis (OA) und chondralen Defekten^{dar 1}. Diese Erkrankungen, die durch den Abbau oder die Verletzung des Knorpels in den Gelenken gekennzeichnet sind, stellen während der Behandlung erhebliche Herausforderungen dar. Es wird berichtet, dass die Selbstreparatur des Gelenkknorpels aufgrund seiner aneuralen Architektur, der Avaskularität und der geringen mitotischen Aktivität eingeschränkt ist².

Die am häufigsten verwendeten Zellen für die Regeneration des Knorpelgewebes sind mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Chondrozyten³. Mehrere Studien haben jedoch über Einschränkungen bei der Verwendung dieser Zellen zur Regeneration berichtet⁴. Zu diesen Einschränkungen gehören die terminale Differenzierung von Chondrozyten während einer verlängerten in vitro-Expansion, um die erforderliche Zellzahl zu erreichen, und die hypertrophe Tendenz von MSCs. Diese Faktoren können zur Bildung von Reparaturgewebe mit einer suboptimalen Kombination von Faserknorpel und Hyalin führen 5,6,7,8.

Die Entdeckung der Chondroprogenitorzellen (CPCs) entstand aus der Suche nach alternativen Zellen im Gelenkknorpel⁹. Sie haben aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit MSCs und ihres überlegenen chondrogenen Potenzials immenses Interesse geweckt, während sie gleichzeitig eine reduzierte Hypertrophie aufweisen - eine unverzichtbare Kombination, die gesucht wird^10,11. Im Gegensatz zu Chondrozyten wurde berichtet, dass diese Vorläuferpopulationen eine erhöhte Replikations- und Telomeraseaktivität sowie eine erhöhte Expression des neurogenen Locus-Notch-Homolog-Proteins 1 (NOTCH-1) und des SRY-Box-Transkriptionsfaktors 9 (SOX-9) aufweisen12,13,14,15. Es gibt zwei Standardmethoden zur Isolierung von CPCs, die sowohl aus Knorpel als auch aus Meniskus berichtet wurden, einschließlich einer auf der Expression ihres Integrinrezeptors (CD49e/CD29), die durch einen Fibronektin-Adhäsionsassay isoliert wurde - Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleitete Chondroprogenitoren (FAA-CPs), und die andere basierend auf ihrem erhöhten Migrationspotenzial aus Knorpelexplantaten - Migratorische Chondroprogenitoren (MCPs)11,13,16,17^,18,19. Zahlreiche in vitro Studien belegen die chondrogene Überlegenheit und reduzierte Hypertrophie sowohl von FAA-CPCs als auch von MCPs im Vergleich zu Chondrozyten und Knochenmark (BM)-MSCs 20,21,22,23.

Jüngste In-vitro-Untersuchungen, bei denen FAA-CPCs mit MCPs verglichen wurden, haben die verbesserte Knorpelregenerationsfähigkeit der letztgenannten Vorläuferpopulation unter normalen Sauerstoffbedingungen gezeigt²⁴. Diese optimistischen In-vitro-Ergebnisse zeigen eine hyalinartige Regeneration und ermutigen zu weiteren In-vivo-Experimenten. Nichtsdestotrotz wurde berichtet, dass beide Populationen von CPCs Knorpel bei OA und anderen osteochondralen Erkrankungen in Tiermodellen effizient reparieren und regenerieren 25,26,27,28,29.

Unser Labor hat aktiv dazu beigetragen, CPC-Isolationstechniken zu standardisieren und ihre phänotypischen Eigenschaften mit Chondrozyten und MSCs zu vergleichen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, in dem die Schritte zur Isolierung und Kultivierung von knorpelresidenten Zellen, namentlich Chondrozyten, FAA-CPCs und MCPs, erläutert werden.

Protokoll

Das Protokoll wurde genehmigt und entspricht den entsprechenden Vorschriften und Richtlinien des Institutional Review Board (Forschungs- und Ethikkommission). Nach Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung werden humane tibiofemorale Gelenke von Osteoarthritis (OA)-Patienten (radiologischer Kellgren-Lawrence-Score 4)³⁰ beschafft, die im Rahmen ihrer Behandlung einen totalen Kniegelenkersatz benötigen. Die Gelenke von Patienten mit Anzeichen von Tumoren, Infektionen oder entzündlicher Arthritis (wie rheumatoide Arthritis oder Gicht) wurden von der Studie ausgeschlossen. Es wird sichergestellt, dass alle Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, wobei während des gesamten Versuchsprozesses die Standardlaborprotokolle eingehalten werden.

1. Erlangung tibiofemoraler Gelenke

1. Entnahme von Kniegelenken (tibiofemorale Gelenke) von menschlichen Spendern, die im Rahmen der Behandlung eine Amputation oberhalb des Knies benötigen, oder von Patienten mit Osteoarthritis Grad^{IV 30} (radiologische Evidenz zeigt eine deutliche Verkleinerung des Gelenkspalts bei chondraler Sklerose), die sich einem totalen Kniegelenkersatz unterziehen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Einwilligungserklärung der Patienten gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki eingeholt wird. Stellen Sie sicher, dass die Regeln der Ethikkommission und des institutionellen Überprüfungsgremiums eingehalten werden.
2. Schließen Sie alle Gelenke aus, die Symptome einer Infektion oder Entzündung zeigen.

2. Verarbeitung von geernteten Fugen

1. Legen Sie die entnommenen tibiofemoralen Gelenke unter sterilen Bedingungen in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
2. Bereiten Sie einen sterilen Bereich unter der Motorhaube vor, indem Sie eine sterile Unterlage platzieren. Übertragen Sie die geernteten Fugen auf den Untergrund.
3. Stabilisieren Sie die durchtrennten tibiofemoralen Gelenke, indem Sie den subchondralen Knochen mit dem Knorpel nach oben halten.
4. Entnehmen Sie mit einer Skalpellklinge (Nr. 22) innerhalb von 1-2 h nach der Entnahme des Gelenks rechteckige Knorpelspäne aus den nicht belastenden Bereichen für OA-Patienten.
5. Ernten Sie die Knorpelabschnitte von 8 mm x 10 mm von der oberflächlichen Schicht in die tiefere Schicht.
6. Waschen Sie die Knorpelscheiben mit 1x PBS-Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale, die 1-2 mL reines DMEM-Medium enthält.
7. Die Knorpelscheiben mit einer Skalpellklinge (Nr. 22) auf eine Größe von weniger als 1 mm x 1 mm x 1 mm fein hacken.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Knorpelscheiben oder der gehackte Knorpel nicht austrocknen; Legen Sie sie in ein Kulturmedium oder PBS ohne Serum.

3. Isolierung von Chondrozyten

1. Legen Sie den gehackten Knorpel in einen aufrechten T-25-Kolben, der 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) mit 0,15 % Kollagenase Typ II für den enzymatischen Verdau enthält. Der Kolben wird 12-14 Stunden lang ungestört in einem CO_{2 -} Inkubator gelagert, wobei die normalen Kulturbedingungen^{zu gewährleisten sind 31}.
   HINWEIS: Es sollte normales DMEM-F12-Medium ohne Spuren von Serum verwendet werden, da das Serum die enzymatische Wirkung inaktiviert.
2. Nach der Verdauung über Nacht wird das Medium mit den freigesetzten Zellen in ein frisches, steriles Zentrifugenröhrchen mit dem gleichen Volumen an DMEM-F12 + 10 % fötalem Rinderserum (FBS) überführt, wobei ein Zellsieb verwendet wird, um die Zellen von den Trümmern zu trennen. Die freigesetzten Zellen sind die "Chondrozyten".
3. Die filtrierten Zellen werden bei einer Geschwindigkeit von 1200 x g 5 Minuten lang bei 37 °C zentrifugiert.
4. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Rekonstituieren Sie das erhaltene Pellet in 1 ml Medium und zählen Sie die freigesetzten lebensfähigen Zellen mit einem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
5. Laden Sie die Chondrozyten in einen T-25-Kolben in einer Konzentration von 10.000 Zellen/cm² und expandieren Sie mit DMEM-F12 mit 10 % FBS auf die erforderliche Durchgangszahl. Weitere Bestandteile des Mediums sind Ascorbinsäure (62 μg/ml), L-Glutamin (2,5 mM/l), Penicillin-Streptomycin (100 IE/ml) und Amphotericin-B (2 μg/ml).
6. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf und ernten Sie Zellen an der Subkonfluenz mit 0,125 % Trypsin, das Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

4. Isolierung von Chondroprogenitoren, die aus dem Fibronektin-Adhäsionsassay abgeleitet sind (FAA-CPs)

1. 12 h vor der Freisetzung der Chondrozyten 10 ml 1x PBS mit 1 mM MgCl₂ (10 μl) und 1 mM CaCl₂ (10 μl) sowie 100 μl Fibronektin (10 μl/ml) ^herstellen32.
2. Beschichten Sie die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 6-Well-Platte (1,5 mL/9,3 cm²) mit der vorbereiteten Lösung.
3. Die Platte fest verschließen und über Nacht bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
4. Entnehmen Sie zusätzlich Knorpelspäne auf eine ähnliche Weise wie für die Isolierung von Chondrozyten (Schritte 2.1-2.5).
5. Die Knorpelspäne werden über Nacht sequentiell enzymatisch verdaut (0,2 % Pronase für 3 h; gefolgt von 0,04 % Kollagenase Typ II für 12 h) in einem bei 37 °C gehaltenen Schüttelwasserbad zur Gewinnung einzelner Chondrozyten durchgeführt.
6. Nehmen Sie am nächsten Tag die mit Fibronectin beschichtete 6-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie überschüssiges Fibronektin.
   HINWEIS: Überschüssiges Fibronektin sollte langsam und sanft entfernt werden, ohne die Beschichtung auf dem Boden der Vertiefung zu stören. Das Vorhandensein von MgCl₂ (10 μL) und 1 mM CaCl₂ ist entscheidend, um die Anheftung der Zellen zu gewährleisten.
7. Geben Sie 2-3 ml reines DMEM-F12-Medium in die beschichteten Vertiefungen.
8. Die freigesetzten Chondrozyten werden mit einer Beladungsdichte von 4000 Zellen/Vertiefung auf die beschichteten Vertiefungen ausgesät und die Platte für einen Zeitraum von 20 Minuten ungestört gelassen.
9. Entfernen Sie nach der Inkubation das überschüssige Medium und die nicht adhärenten Zellen. Fügen Sie 2-3 ml Standard-Wachstumsmedien hinzu, wie sie für Chondrozyten verwendet werden (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. Halten Sie die adhärenten Zellen 10-12 Tage lang unter Standardkulturbedingungen, um CPC-Klone (Kolonien von >32 Zellen) zu erhalten.
11. Isolieren Sie mit 0,125 % Trypsin-EDTA für 180 s, plattieren Sie die Klone in einem Verhältnis von 1 Klon/5 cm² neu und expandieren Sie die angereicherten polyklonalen CPs auf die erforderliche Konfluenz. Diese gewonnenen Zellen werden als "FAA-CPCs" bezeichnet.
12. Kultivieren Sie die Zellen weiter in DMEM-F12-Medium + 10% FBS + transformierendem Wachstumsfaktor Beta 2 (TGFβ2: 1 ng/ml) + Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF2: 5 ng/ml).
    HINWEIS: Die Inkubation von Zellen auf mit Fibronektin beschichteten Platten sollte 20 Minuten nicht überschreiten, da auch Chondrozyten zu haften beginnen können. Während der 20-minütigen Adhäsionszeit muss das Medium frei von Serum sein. Als nächstes müssen die Zellen, die an Klonen haften, in einem Medium kultiviert werden, das zusätzlich FBS enthält. Die Klone dürfen erst isoliert werden, nachdem sichergestellt wurde, dass jeder Klon mehr als 32 Zellen hat. Dies dient dazu, Transitverstärker zu vermeiden. Eine weitere Expansion der Klone nach der Trypsinisierung sollte die zusätzlich genannten Wachstumsfaktoren einbeziehen. Eine Beladungsdichte von 4000 Chondrozyten/9,3^cm2 einer mit Fibronektin beschichteten Platte nach einer 20-minütigen Inkubation mit anschließender Wäsche führt zu einer Adhäsion von insgesamt 80-100 Zellen. Von diesen werden etwa 20 Klone wachsen und innerhalb von 10-12 Tagen eine Verdoppelung der Population um 5 erreichen.

5. Isolierung von migratorischen Chondroprogenitoren

1. Rasieren Sie Knorpelexplantate (10 mm x 5 mm x 1 mm) aus dem entnommenen Gelenkgelenk und legen Sie sie in eine sterile 6-Well-Platte, die DMEM-F12-Medien mit 10 % FBS und 10 mM Glutamax (2-3 Explantate/Well) ^enthält33.
2. Die Platte mit den Explantaten wird 48 Stunden lang in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C ungestört gelassen.
3. Nach 2 Tagen werden die Explantate in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 0,1%iger Kollagenaselösung für den enzymatischen Aufschluss überführt. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 2 h.
   HINWEIS: Die Explantate müssen vor dem enzymatischen Aufschluss mit 1x PBS gespült werden, da Spuren von Serum die Enzymwirkung inaktivieren können. Tauchen Sie die Explantate zum Waschen in eine Petrischale, die mit 2-3 mL 1x PBS gefüllt ist; Dies dient auch dazu, eine Nichtkontamination mit freigesetzten Chondrozyten zu gewährleisten. Der Umgang mit den Explantaten muss auf ein Minimum beschränkt werden, um eine Belastung der Vorläufer zu vermeiden, die mit der Migration begonnen haben.
4. Spülen Sie die Explantate nach dem Aufschluss mit 1x PBS und legen Sie sie zurück in die gleichen Vertiefungen der Platte mit frischem DMEM-F12-Medium mit 10 % FBS und 10 mM Glutamax-Medium.
5. Bewahren Sie die Platte unter Standardkulturbedingungen im Inkubator auf. Achten Sie in den folgenden Tagen auf die Migration von Chondroprogenitoren.
6. Bei Erreichen der Subkonfluenz werden die MCPs mit 0,125 % Trypsin-haltigem EDTA geerntet.
7. Erweitern Sie die MCPs mit dem Standard-Expansionsmedium, das DMEM-F12 enthält, das 10 % FBS und 10 mM Glutamax enthält.

6. Phänotypische Charakterisierung von Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs

1. Durchflusszytometrische Analyse (FACS)
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die FACS-Analyse der geernteten Zellgruppen befolgt.
   1. Trypsinisieren Sie die Zellen gemäß dem Standardprotokoll mit 0,125 % Trypsin und zentrifugieren Sie sie bei 1200 x g, 5 min, Raumtemperatur, um das Zellpellet zu erhalten.
   2. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet und suspendieren Sie es wieder mit 1x PBS.
   3. Übertragen Sie die Suspension in markierte Röhrchen für FACS.
   4. Teilen Sie die Suspension zu gleichen Teilen in zwei Röhrchen auf: ein "ungefärbtes" Röhrchen, das als Kontrolle dient (Zellsuspension ohne Antikörper) und "gefärbte" Röhrchen, die als Tests dienen (Zellsuspension mit Antikörper).
   5. Befolgen Sie das technische Datenblatt der einzelnen Antikörper/Cluster of Differentiation (CD)-Marker für die Färbung. Zu den Antikörpern zum Vergleich gehören CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (positive Expressionsmarker); CD34-PE, CD45-FITC und CD14-FITC (negative Expressionsmarker)^34,35; CD166-BB515 und CD146-PE (potentielle chondrogene Marker)^36,37.
      HINWEIS: CD-Marker sind lichtempfindlich. Um sicherzustellen, dass die Schritte im Dunkeln ausgeführt werden.
   6. Inkubieren Sie die Zellsuspension mit Antikörper für 30 min im Dunkeln.
   7. Nach der Färbung 1 ml 1x PBS in die Röhrchen geben und bei 1200 x g, 5 min, Raumtemperatur zentrifugieren, um das Zellpellet zu erhalten.
   8. Drei Viertel des Überstands werden verworfen. Das Pellet im restlichen Überstandsinhalt durch sanfte Verreibung wieder suspendieren.
   9. Fahren Sie mit der FACS-Analyse fort.

7. qRT-PCR

HINWEIS: Die qRT-PCR-Analyse der Genexpression umfasst die Bewertung von Kollagen Typ I (COL1A1), Kollagen Typ X (COL10A1) und Runt-related Transcription Factor (RUNX2) für die hypertrophe Expression sowie von SOX-9, Aggrecan (ACAN) und Kollagen Typ II (COL2A1) für die Chondrogenese.

1. Extrahieren Sie RNA aus den Zellgruppen mit kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Bewerten Sie nach der Extraktion das Verhältnis A₂₆₀/A₂₈₀ und die RNA-Konzentration.
3. Verwenden Sie 280 ng der extrahierten RNA, um komplementäre DNA (cDNA) zu konstruieren.
4. Initiieren Sie die qRT-PCR mit Sybr Green, wobei jede Reaktion eine Endkonzentration von 7 ng cDNA auf einem Thermocycler enthält.
5. Normalisieren Sie die relative mRNA-Expression jedes Gens zum GAPDH-Referenz-Housekeeping-Gen (ΔCt).
6. Berechnen Sie die relative Expression jedes Gens mit der ^{2-ΔΔCt-Technik} , indem Sie den ΔCt-Wert jedes einzelnen Gens mit dem der FAA-CPs (ΔΔCt) ^{vergleichen37}.

8. Differenzierung mehrerer Abstammungslinien

HINWEIS: Im Handel erhältliche differentielle Medien induzieren die Differenzierung der Trilinien in adiogene, osteogene und chondrogene Linien.

1. Für die adipogene Differenzierung werden Zellen mit einer Beladungsdichte von 1000 Zellen/^cm2 in eine Zellkulturplatte gesät und unter Verwendung eines adipogenen Differenzierungsmediums (Mediumwechsel - einmal in 3 Tagen) bis zu einer Subkonfluenz von 80% für 3 Wochen kultiviert.
2. Für die osteogene und chondrogene Differenzierung ist das 28-Tage-Pelletkultursystem³⁸ anzuwenden.
3. 0,5 x 10⁶ Zellen bei 400 x g für 12 min bei 37 °C zentrifugieren, um Pellets zu bilden und die Differenzierung mit osteogenem und chondrogenem Differenzierungsmedium einzuleiten.
4. Fixieren, betten und teilen Sie die Pellets für die bestätigende Färbung (Schritt 9).

9. Konfirmatorische Färbung

1. Im Falle von Zellen der adipogenen Linie fixieren Sie die Zellen mit gepuffertem Formalin, waschen Sie sie und färben Sie sie mit Oil Red O (0,5%). Färben Sie auch die Kontrollen (kultiviert auf einem Standard-DMEM-Medium mit 10 % FBS).
2. Beobachten Sie unter dem Mikroskop und nehmen Sie die Bilder auf.
3. Für die differenzierten osteogenen Zellen färben Sie sich mit Alizarinrot (2%).
   HINWEIS: Für die chondrogenen differenzierten Zellen sind mehrere konfirmatorische Färbeprotokolle anwendbar.
4. Alcian Blue Färbung: Die fixierten Zellen 5 min lang mit Alcian Blue färben und mit Neutral Red gegenfärben.
5. Zur Beurteilung des Gehalts an Glykosaminoglykan (GAG) führen Sie eine Safranin O-Färbung durch: Färben Sie die Objektträger mit Wiegerts Eisen-Hämatoxylin, gefolgt von einer anschließenden Inkubation mit saurem Alkohol (1%), schneller grüner Lösung (0,05%), Essigsäure (1%) und Safranin O-Lösung (1%).
6. Toluidinblau-Färbung: Färben Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit Toluidinblau (0,1 %).
7. PicroSirius Red Färbung: Die Objektträger mit Picrosirius Red (0,1 %) färben und mit Hämatoxylin-Farbstoff gegenfärben.
   HINWEIS: Nach dem Färben die Objektträger mit abgestuftem Alkohol dehydrieren und mit Xylol klären. Montieren Sie Objektträger mit Dibutylphthalat-Polystyrol-Xylol (DPX)-Eindeckmittel, betrachten Sie sie unter einem Mikroskop und nehmen Sie Bilder auf.
8. Für die immunhistochemische (Typ II Kollagen)-Färbung des chondrogenen differenzierten Pellets werden die Pelletschnitte einer enzymatischen Antigengewinnung mit den Enzymen Pronase (1 mg/ml) und Hyaluronidase (2,5 mg/ml) unterzogen.
9. Inkubieren Sie die Schnitte mit einem primären monoklonalen Anti-Kollagen-Antikörper der Maus vom Typ II, gefolgt von einem sekundären HRP-markierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper im Maßstab 1:250.
10. Die Objektträger mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Chromogen einfärben und mit Hämatoxylin gegenfärben.
11. Beobachten Sie unter dem Mikroskop und nehmen Sie Bilder auf.

10. Bestimmung des GAG/DNA-Gehalts

1. Die chondrogenen differenzierten Pellets werden 16 h lang mit Papain-Cystein-Lösung bei 65 °C verdaut.
2. Schätzung der DNA-Konzentration mit dem Picrogreen-Reagenz³⁸ und Erfassung der Fluoreszenzintensität bei Wellenlängen - Anregung: 480 nm, Emission: 520 nm mit einem ELISA-Platten-Reader.
3. Der Gesamt-GAG-Gehalt ist mit der Dimethylmethylenblau-Farbstoffmethode³⁸ zu bewerten.
4. Messen Sie die optische Dichte bei 525 nm mit einem ELISA-Platten-Reader.
5. Normalisieren Sie die GAG-Werte auf die DNA-Werte und berechnen Sie das Gesamt-GAG/DNA-Verhältnis.

Ergebnisse

Von 86,9 mg Knorpelscheiben wurde eine Chondrozytenzellausbeute von 1,72 x 10⁵ Zellen festgestellt. Nach dem Laden haften die Chondrozyten sofort an, zeigen ein anfänglich abgerundetes Kopfsteinpflaster-Aussehen und gehen bei weiterer Expansion in einen fibroblastischen Zustand über (Abbildung 1 A, B). Die Aussaat dieser Chondrozyten auf Fibronektinplatten führt in der Regel zu einer Adhäsion von 2 %, wobei jede Zelle ein klon...

Diskussion

Die potentielle Regeneration des Gelenkknorpels, der hyalines Gewebe enthält, kann durch die Optimierung seiner beiden nativen Zelltypen Chondrozyten und Chondroprogenitoren erreicht werden. Während umfangreiche Forschungen an Chondrozyten wertvolle Einblicke in ihre Rolle bei der Knorpelreparatur geliefert haben, haben Fragen über die Art des regenerierten Gewebes zu Bemühungen geführt, ihren Phänotyp zu verbessern und alternative Therapien zu erforschen³. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072