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Resumo

Este protocolo detalha o isolamento de condrócitos, condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) da cartilagem articular humana. Abrange digestão enzimática, adesão de fibronectina e ensaios baseados em migração para isolar e caracterizar essas células.

Resumo

As células condroprogenitoras (CPCs), recentemente identificadas como uma subpopulação distinta, exibem promessa devido às suas propriedades mesenquimais, condrogênese aumentada e características hipertróficas limitadas. O enriquecimento de progenitores é obtido por meio de ensaios diferenciais de adesão à fibronectina e explante baseados em migração, com condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) demonstrando potencial superior em comparação com os condrócitos. Este artigo investiga os detalhes do isolamento de células derivadas da cartilagem residentes, ou seja, condrócitos e condroprogenitores. Embora informações valiosas da pesquisa de condrócitos contribuam para nossa compreensão do reparo da cartilagem, os esforços contínuos são direcionados para o uso de condroprogenitores e para a exploração de seu potencial como uma abordagem terapêutica alternativa. Além disso, este artigo de metodologia fornece um protocolo passo a passo detalhado para isolar três tipos específicos de células da cartilagem: condrócitos, FAA-CPs e MCPs. Seguindo procedimentos padronizados, este protocolo facilita a extração bem-sucedida desses subtipos de células. Com base em extensa pesquisa, o artigo enfoca as intrincadas técnicas utilizadas no isolamento dos diferentes subconjuntos e as condições de cultura otimizadas necessárias para expandir e manter suas culturas. A metodologia engloba o isolamento enzimático de condrócitos derivados da cartilagem articular humana, adesão diferencial de fibronectina após digestão enzimática sequencial e ensaios de explante baseados em migração para obter células residentes na cartilagem.

Introdução

O surgimento da terapia regenerativa baseada em células representa uma abordagem significativa para o tratamento de doenças relacionadas à cartilagem, como osteoartrite (OA) e defeitos condrais1. Esses distúrbios, caracterizados pela quebra ou lesão da cartilagem dentro das articulações, apresentam desafios substanciais durante o tratamento. O auto-reparo da cartilagem articular é relatado como limitado devido à sua arquitetura aneural, avascularidade e baixa atividade mitótica2.

As células mais utilizadas para a regeneração do tecido cartilaginoso são as células-tronco mesenquimais (CTMs) e os condrócitos3. No entanto, vários estudos relataram limitações no uso dessas células para regeneração4. Essas limitações incluem a diferenciação terminal de condrócitos durante a expansão in vitro estendida para atingir a contagem de células necessária e a tendência hipertrófica das MSCs. Esses fatores podem resultar na formação de tecido de reparo com uma combinação subótima de fibrocartilagem e hialina 5,6,7,8.

A descoberta das células condroprogenitoras (CPCs) surgiu da busca por células alternativas na cartilagem articular9. Eles geraram imenso interesse devido à sua semelhança com as CTMs e seu potencial condrogênico superior, ao mesmo tempo em que exibem hipertrofia reduzida - uma combinação indispensável procurada10,11. Em contraste com os condrócitos, foi relatado que essas populações progenitoras exibem atividade replicativa e telomerase aumentada, bem como aumento da expressão da proteína homóloga 1 do locus notch neurogênico (NOTCH-1) e do fator de transcrição SRY-box 9 (SOX-9) 12 , 13 , 14 , 15 . Existem dois métodos padrão para isolar CPCs relatados tanto da cartilagem quanto do menisco, incluindo um baseado na expressão de seu receptor de integrina (CD49e / CD29), isolado por meio de um ensaio de adesão de fibronectina - Condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs), e o outro baseado em seu potencial migratório aumentado de explantes de cartilagem - Condroprogenitores migratórios (MCPs) 11 , 13 , 16 , 17 ,18,19. Numerosos estudos in vitro demonstram a superioridade condrogênica e a redução da hipertrofia de FAA-CPCs e MCPs em comparação com condrócitos e medula óssea (MO)-MSCs 20,21,22,23.

Investigações in vitro recentes comparando FAA-CPCs com MCPs demonstraram a capacidade aumentada de regeneração da cartilagem da última população progenitora em condições normais de oxigênio24. Esses resultados otimistas in vitro mostram uma regeneração semelhante à hialina, incentivando mais experimentos in vivo. No entanto, ambas as populações de CPCs foram relatadas para reparar e regenerar eficientemente a cartilagem na OA e outros distúrbios osteocondrais em modelos animais25 , 26 , 27 , 28 , 29 .

Nosso laboratório tem contribuído ativamente para padronizar as técnicas de isolamento de CPC e comparar suas características fenotípicas com condrócitos e MSCs. Este artigo fornecerá um protocolo detalhado explicando as etapas envolvidas no isolamento e cultura de células residentes na cartilagem, ou seja, condrócitos, FAA-CPCs e MCPs.

Protocolo

O protocolo foi aprovado e está em conformidade com os regulamentos e diretrizes apropriados do Comitê de Ética em Pesquisa (Comitê de Pesquisa e Ética). Após a obtenção do consentimento informado por escrito, as articulações tibiofemorais humanas são obtidas de pacientes com osteoartrite (OA) (escore radiológico de Kellgren-Lawrence 4)30 que necessitam de artroplastia total do joelho como parte de seu tratamento. As articulações de pacientes com quaisquer sinais de tumores, infecções ou artrite inflamatória (como artrite reumatóide ou gota) foram excluídas do estudo. É garantido que todos os procedimentos sejam conduzidos em condições estéreis, aderindo aos protocolos laboratoriais padrão durante todo o processo experimental.

1. Obtenção de articulações tibiofemorais

  1. Obter articulações do joelho (articulações tibiofemorais) de doadores humanos que necessitem de amputação acima do joelho como parte do tratamento ou daqueles com osteoartrite de grau IV30 (evidência radiológica mostrando redução acentuada do espaço articular com esclerose condral) submetidos à substituição total do joelho.
    NOTA: Certifique-se de que o consentimento informado seja obtido dos pacientes seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Garantir a adesão às regras do Comitê de Ética e do Conselho de Revisão Institucional.
  2. Exclua quaisquer articulações que apresentem sintomas de infecção ou inflamação.

2. Processamento de juntas colhidas

  1. Coloque as articulações tibiofemorais colhidas em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em condições estéreis.
  2. Prepare uma área estéril sob o capô, colocando uma almofada estéril. Transfira as juntas colhidas para a almofada.
  3. Estabilize as articulações tibiofemorais seccionadas segurando o osso subcondral com a cartilagem voltada para cima.
  4. Usando uma lâmina de bisturi (nº 22), colha aparas de cartilagem retangular das áreas sem suporte de peso para pacientes com OA dentro de 1-2 h após a obtenção da articulação.
  5. Colha as seções de cartilagem de 8 mm x 10 mm da camada superficial para a camada mais profunda.
  6. Lave as fatias de cartilagem com 1x solução de PBS e coloque-as em uma placa de Petri contendo 1-2 mL de meio DMEM simples.
  7. Pique bem as fatias de cartilagem até um tamanho inferior a 1 mm x 1 mm x 1 mm com uma lâmina de bisturi (nº 22).
    NOTA: Certifique-se de que as fatias de cartilagem ou cartilagem picada não sequem; coloque-os em um meio de cultura ou PBS desprovido de soro.

3. Isolamento de condrócitos

  1. Coloque a cartilagem picada em um frasco vertical T-25 contendo 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) com 0,15% de colagenase tipo II para digestão enzimática. Deixar o balão em repouso durante 12-14 h numa incubadora de CO2 , garantindo condições de cultura normalizadas31.
    NOTA: Deve-se usar meio DMEM-F12 simples sem vestígios de soro, pois o soro inativa a ação enzimática.
  2. Após a digestão durante a noite, transfira o meio contendo as células liberadas para um tubo de centrífuga fresco e estéril contendo um volume igual de DMEM-F12 + 10% de soro fetal bovino (FBS), usando um filtro de células para separar as células dos detritos. As células liberadas são os "condrócitos".
  3. Centrifugue as células filtradas a uma velocidade de 1200 x g durante 5 minutos a 37 °C.
  4. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Reconstitua o pellet obtido em 1 mL de meio e conte as células viáveis liberadas usando um ensaio de exclusão de azul de tripano.
  5. Carregue os condrócitos em um frasco T-25 a uma concentração de 10.000 células/cm² e expanda até o número de passagem necessário usando DMEM-F12 contendo 10% de FBS. Componentes adicionais no meio incluem ácido ascórbico (62 μg/mL), L-glutamina (2,5 mM/L), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL) e anfotericina-B (2 μg/mL).
  6. Atualize o meio a cada 3 dias e colha as células em subconfluência usando 0,125% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

4. Isolamento de condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs)

  1. 12 h antes da liberação dos condrócitos, prepare 10 mL de 1x PBS contendo 1 mM de MgCl2 (10 μL) e 1 mM de CaCl2 (10 μL) e 100 μL de Fibronectina (10 μL/mL)32.
  2. Cubra o número necessário de poços de uma placa de 6 poços (1,5 mL / 9,3 cm2) usando a solução preparada.
  3. Feche bem a placa e leve à geladeira durante a noite a 4 °C.
  4. Além disso, obtenha aparas de cartilagem de maneira semelhante à explicada para o isolamento de condrócitos (etapas 2.1-2.5).
  5. Submeter as aparas de cartilagem a digestão enzimática sequencial durante a noite (0,2% de Pronase por 3 h; seguida de 0,04% de colagenase tipo II por 12 h) em banho-maria agitado mantido a 37 ° C para obtenção de condrócitos individuais.
  6. No dia seguinte, remova a placa de 6 poços revestida com fibronectina da geladeira e remova o excesso de fibronectina.
    NOTA: O excesso de fibronectina deve ser removido lenta e suavemente, sem perturbar o revestimento no fundo do poço. A presença de MgCl2 (10 μL) e 1 mM de CaCl2 é crucial para garantir a fixação das células.
  7. Adicione 2-3 mL de meio DMEM-F12 simples nos poços revestidos.
  8. Semeie os condrócitos liberados nos poços revestidos a uma densidade de carga de 4000 células/poço e deixe a placa intacta por um período de 20 min.
  9. Após a incubação, remova o excesso de meio e as células não aderentes. Adicione 2-3 mL de meio de crescimento padrão usado para condrócitos (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Manter as células aderentes em condições de cultura padrão por 10-12 dias para obter clones de CPC (colônias de >32 células).
  11. Isolar usando 0,125% de tripsina-EDTA por 180 s, recolocar os clones em uma proporção de 1 clone / 5 cm² e expandir os CPs policlonais enriquecidos para a confluência necessária. Essas células obtidas são chamadas de "FAA-CPCs".
  12. Cultive as células em meio DMEM-F12 + 10% FBS + fator de crescimento transformador beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + fator de crescimento de fibroblastos (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: A incubação das células em placas revestidas com fibronectina não deve exceder 20 min, pois os condrócitos também podem começar a aderir. Durante o período de adesão de 20 minutos, o meio deve ser desprovido de soro. Em seguida, as células que aderem aos clones de forma devem ser cultivadas em um meio contendo adicionalmente FBS. Os clones devem ser isolados somente depois de garantir que cada clone tenha mais de 32 células; Isso é para evitar amplificadores de trânsito. A expansão adicional dos clones após a tripsinização deve incluir os fatores de crescimento adicionais mencionados. Uma densidade de carga de 4000 condrócitos/9,3cm2 de uma placa revestida com fibronectina, após uma incubação de 20 minutos seguida de uma lavagem, resulta na adesão de 80-100 células no total. Destes, cerca de 20 clones progredirão para crescer e atingir uma duplicação da população de 5 em 10-12 dias.

5. Isolamento de condroprogenitores migratórios

  1. Raspe os explantes de cartilagem (10 mm x 5 mm x 1 mm) da articulação articular colhida e coloque-os em uma placa estéril de 6 poços contendo meio DMEM-F12 com 10% de FBS e 10 mM de Glutamax (2-3 explantes/poço)33.
  2. Deixar a placa com os explantes intacta durante 48 h numa incubadora de CO2 mantida a 37 °C.
  3. Após 2 dias, transfira os explantes para um tubo de centrífuga contendo 10 mL de solução de colagenase a 0,1% para digestão enzimática. Incubar o tubo a 37 °C durante 2 h.
    NOTA: Os explantes precisam ser enxaguados com 1x PBS antes da digestão enzimática, pois vestígios de soro podem inativar a ação enzimática. Para lavar, mergulhe os explantes em uma placa de Petri preenchida com 2-3 mL de 1x PBS; Isso também é para garantir a não contaminação com quaisquer condrócitos liberados. O manuseio dos explantes deve ser reduzido ao mínimo, e isso é para evitar estressar os progenitores que começaram a migrar.
  4. Após a digestão, enxágue os explantes com 1x PBS e coloque-os de volta nos mesmos poços da placa contendo meio DMEM-F12 fresco com 10% de FBS e 10 mM de meio Glutamax.
  5. Mantenha a placa em condições de cultura padrão na incubadora. Observe a migração de condroprogenitores nos dias subsequentes.
  6. Ao atingir a subconfluência, colher os MCPs usando 0,125% de tripsina contendo EDTA.
  7. Expanda os MCPs usando o meio de expansão padrão, que inclui DMEM-F12, que contém 10% de FBS e 10 mM de Glutamax.

6. Caracterização fenotípica de condrócitos, FAA-CPs e MCPs

  1. Análise por citometria de fluxo (FACS)
    NOTA: As etapas a seguir são seguidas para a análise FACS dos grupos de células coletados.
    1. Tripsinize as células de acordo com o protocolo padrão usando 0,125% de tripsina e centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obter o pellet celular.
    2. Descarte o sobrenadante, lave e suspenda novamente o pellet com 1x PBS.
    3. Transfira a suspensão para tubos rotulados para FACS.
    4. Divida a suspensão igualmente em dois tubos: um tubo 'não corado' que atua como controle (suspensão celular sem anticorpo) e tubos 'corados' que atuam como testes (suspensão celular com anticorpo).
    5. Siga a ficha técnica de anticorpos individuais/marcadores de cluster de diferenciação (CD) para coloração. Os anticorpos para comparação incluem CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcadores de expressão positiva); CD34-PE, CD45-FITC e CD14-FITC (marcadores de expressão negativa)34,35; CD166-BB515 e CD146-PE (potenciais marcadores condrogênicos)36,37.
      NOTA: Os marcadores de CD são sensíveis à luz. Para garantir que as etapas sejam feitas no escuro.
    6. Incubar a suspensão celular com anticorpo durante 30 min no escuro.
    7. Após a coloração, adicione 1 mL de 1x PBS aos tubos e centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obter o pellet celular.
    8. Descarte três quartos do sobrenadante. Ressuspender o pellet no conteúdo sobrenadante restante por trituração suave.
    9. Prossiga para a análise FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: a análise qRT-PCR da expressão gênica envolve a avaliação do colágeno tipo I (COL1A1), colágeno tipo X (COL10A1) e fator de transcrição relacionado a Runt (RUNX2) para expressão hipertrófica e SOX-9, Aggrecan (ACAN) e colágeno tipo II (COL2A1) para condrogênese.

  1. Extraia o RNA dos grupos de células usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Após a extração, avaliar a relação A260/A280 e a concentração de RNA.
  3. Utilize 280 ng do RNA extraído para construir DNA complementar (cDNA).
  4. Inicie qRT-PCR usando Sybr Green, cada reação contendo uma concentração final de 7 ng de cDNA em um termociclador.
  5. Normalize a expressão relativa de mRNA de cada gene para o gene de manutenção de referência GAPDH (ΔCt).
  6. Calcule a expressão relativa de cada gene usando a técnica 2-ΔΔCt , comparando o valor de ΔCt de cada gene individual com o dos FAA-CPs (ΔΔCt) 37 .

8. Diferenciação de múltiplas linhagens

NOTA: Os meios diferenciais disponíveis comercialmente induzem a diferenciação da trilinhagem em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas.

  1. Para diferenciação adipogênica, sementes de células com densidade de carga de 1000 células/cm2 em placa de cultura celular e cultivo em meio de diferenciação adipogênica (alteração do meio - uma vez em 3 dias) até uma subconfluência de 80% por 3 semanas.
  2. Para diferenciação osteogênica e condrogênica, siga o sistema de cultura de pellets de 28 dias38.
  3. Centrifugue 0,5 x 106 células a 400 x g por 12 min a 37 ° C para formar pellets e iniciar a diferenciação usando meio de diferenciação osteogênica e condrogênica.
  4. Fixe, incorpore e corte os pellets para coloração confirmatória (etapa 9).

9. Coloração confirmatória

  1. No caso de células de linhagem adipogênica, fixe as células com formalina tamponada, lave e core com Oil Red O (0,5%). Pinte os controles (cultivados em um meio DMEM padrão com 10% de FBS) também.
  2. Observe ao microscópio e adquira as imagens.
  3. Para as células de linhagem osteogênica diferenciada, corar com Vermelho de Alizarina (2%).
    NOTA: Vários protocolos de coloração confirmatória são aplicáveis para as células condrogênicas diferenciadas.
  4. Coloração Alcian Blue: Manchar as células fixas com azul Alcian por 5 min e contra-corar com Vermelho Neutro.
  5. Para avaliar o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG), faça a coloração com Safranina O: Pinte as lâminas com Hematoxilina de Ferro de Wiegert seguida de incubação subsequente com álcool ácido (1%), solução verde rápida (0,05%), ácido acético (1%) e solução de Safranina O (1%).
  6. Coloração com azul de toluidina: Manchar as lâminas com azul de toluidina (0,1%) por 5 min.
  7. Coloração PicroSirius Red: Manchar as lâminas com Picrosirius Red (0,1%) e contra-corar com corante Hematoxilina.
    NOTA: Após a coloração, desidrate as lâminas com álcool graduado e limpe com xileno. Monte as lâminas usando o montante Dibutilftalato Poliestireno Xileno (DPX), observe-as ao microscópio e adquira imagens.
  8. Para a coloração imuno-histoquímica (colágeno tipo II) do pellet diferenciado condrogênico, submeta as seções do pellet à recuperação enzimática do antígeno usando as enzimas pronase (1 mg/mL) e hialuronidase (2,5 mg/mL).
  9. Incube as seções com anticorpo monoclonal primário anticolágeno tipo II de camundongo, seguido por anticorpo anti-camundongo de cabra marcado com HRP secundário 1:250.
  10. Pinte as lâminas com cromogênio de 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) e contra-core com hematoxilina.
  11. Observe ao microscópio e capture imagens.

10. Determinação do conteúdo de GAG / DNA

  1. Digerir os pellets diferenciados condrogénicos utilizando uma solução de papaína-cisteína a 65 °C durante 16 h.
  2. Estimar a concentração de ADN utilizando o reagente Picrogreen38 e adquirir a intensidade de fluorescência nos comprimentos de onda - excitação: 480 nm, emissão: 520 nm utilizando um leitor de placas ELISA.
  3. Avaliar o teor total de GAG utilizando o método do corante azul de dimetilmetileno38.
  4. Meça a densidade óptica a 525 nm usando um leitor de placas ELISA.
  5. Normalize os valores GAG para os valores de DNA e calcule a proporção total de GAG/DNA.

Resultados

A partir de 86,9 mg de fatias de cartilagem, observou-se um rendimento de células de condrócitos de 1,72 x 105 células. Após o carregamento, os condrócitos aderem prontamente, apresentando uma aparência inicial de paralelepípedos arredondados e transformando-se em um estado fibroblástico após a expansão adicional (Figura 1 A,B). A semeadura desses condrócitos em placas de fibronectina normalmente resulta em 2% de adesã...

Discussão

O potencial de regeneração da cartilagem articular, contendo tecido hialino, pode ser alcançado através da otimização de seus dois tipos de células nativas: condrócitos e condroprogenitores. Embora uma extensa pesquisa sobre condrócitos tenha fornecido informações valiosas sobre seu papel no reparo da cartilagem, questões sobre a natureza do tecido regenerado levaram a esforços para melhorar seu fenótipo e explorar terapias alternativas3. Os condropr...

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Sra. Bhavini Krishnan e à Sra. Merin Mary Zachariah por sua contribuição intelectual e ao Centro de Pesquisa de Células-Tronco (uma unidade do inStem Bengaluru), Departamento de Fisiologia, Christian Medical College, Vellore, pelo apoio à infraestrutura. Os projetos em andamento são apoiados pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Governo da Índia, Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (CRG/2022/004277), Governo da Índia e Bolsas de Pesquisa de Fluidos, Christian Medical College, Vellore.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

Referências

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