Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

요약

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

초록

최근에 별개의 하위 집단으로 확인된 연골 형성 세포(CPC)는 중간엽 특성, 연골 형성 증가 및 제한된 비대 특성으로 인해 유망한 모습을 보입니다. 전구세포의 풍부화는 차등 피브로넥틴 접착 및 이동 기반 외식 분석을 통해 이루어지며, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골형성기(FAA-CP) 및 이주 연골형성기(MCP)는 연골세포에 비해 우수한 잠재력을 보여줍니다. 이 기사에서는 상주 연골 유래 세포, 즉 연골세포와 연골형성체를 분리하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 연골세포 연구에서 얻은 귀중한 통찰력이 연골 복구에 대한 이해에 기여하고 있지만, 연골세포의 사용과 대체 치료 방법으로서의 잠재력을 탐구하기 위한 지속적인 노력이 이루어지고 있습니다. 또한 이 방법론 논문은 연골에서 연골세포, FAA-CP 및 MCP의 세 가지 특정 세포 유형을 분리하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 표준화된 절차를 따름으로써, 이 프로토콜은 이러한 세포 아형의 성공적인 추출을 용이하게 합니다. 광범위한 연구를 바탕으로 한 이 기사는 서로 다른 하위 집합을 분리하는 데 사용되는 복잡한 기술과 배양을 확장하고 유지하는 데 필요한 최적화된 배양 조건에 중점을 둡니다. 이 방법론에는 인간 관절 연골 유래 연골 세포의 효소 분리, 순차적 효소 분해 후 차등 피브로넥틴 부착 및 연골 상주 세포를 얻기 위한 이동 기반 외식 분석이 포함됩니다.

서문

세포 기반 재생 요법의 출현은 골관절염(OA) 및 연골 결손과 같은 연골 관련 질환을 치료하기 위한 중요한 접근 방식을 나타냅니다¹. 관절 내 연골의 파괴 또는 손상을 특징으로 하는 이러한 질환은 치료 중에 상당한 어려움을 겪습니다. 관절 연골의 자가 복구는 무신경 구조, 무혈성 및 낮은 유사분열 활성으로 인해 제한적인 것으로 보고되었습니다².

연골 조직 재생에 가장 많이 활용되는 세포는 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)와 연골 세포(chondrocyte)입니다³. 그러나 여러 연구에서 재생을 위해 이러한 세포를 사용하는 데 한계가 있다고 보고했습니다⁴. 이러한 한계에는 필요한 세포 수를 달성하기 위해 확장된 체외 확장 중 연골 세포의 말단 분화와 MSC의 비대 경향이 포함됩니다. 이러한 요인은 섬유연골과 유리질 ^5,6,7,8의 최적이 아닌 조합으로 복구 조직을 형성할 수 있습니다.

연골형성세포(Chondroprogenitor cell, CPC)의 발견은 관절 연골에서 대체 세포를 찾는 과정에서 비롯되었다⁹. 그들은 MSCs와의 유사성과 우수한 연골 형성 잠재력으로 인해 엄청난 관심을 불러 일으켰으며,^10,11 이후에 추구되는 필수 불가결 한 조합 인 감소 된 비대를 나타냅니다. 연골세포와 대조적으로, 이러한 전구 세포 집단은 향상된 복제 및 텔로머라제 활성을 나타낼 뿐만 아니라 신경인성 유전자좌 노치 상동체 단백질 1(NOTCH-1) 및 SRY-box 전사 인자 9(SOX-9)의 발현이 증가한 것으로 보고되었습니다12,13,14,15. 연골과 반월상 연골 모두에서 보고된 CPC를 분리하는 두 가지 표준 방법이 있는데, 하나는 피브로넥틴 접착 분석을 통해 분리된 인테그린 수용체(CD49e/CD29) 발현에 기반한 것인 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성인자(FAA-CP)이고, 다른 하나는 연골 외식인 철새 연골 형성기(MCP)에서 증가된 이동 잠재력에 기반합니다.11,13,16,17,^18,19. 수많은 체외 연구에서 연골 세포 및 골수(BM)-MSC에 비해 FAA-CPC 및 MCP의 연골 형성 우월성과 비대 감소를 입증했습니다 20,21,22,23.

FAA-CPC와 MCP를 비교한 최근의 체외 조사에서는 정상적인 산소 조건에서 후자의 전구 개체군의 향상된 연골 재생 능력이 입증되었습니다²⁴. 이러한 낙관적인 in vitro 결과는 hyaline과 같은 재생을 보여주며 in vivo 실험을 더욱 장려합니다. 그럼에도 불구하고, 동물 모델에서 골관절염 및 기타 골연골 질환의 연골을 효율적으로 복구하고 재생하는 것으로 보고되었습니다 25,26,27,28,29.

본 연구실은 CPC 분리 기술을 표준화하고 연골세포 및 MSC와 표현형 특성을 비교하는 데 적극적으로 기여해 왔습니다. 이 기사에서는 연골 상주 세포, 즉 연골 세포, FAA-CPC 및 MCP를 분리하고 배양하는 데 관련된 단계를 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 승인되었으며 기관 검토 위원회(Research and Ethics Committee)의 적절한 규정 및 지침을 준수합니다. 서면 동의서를 얻은 후, 치료의 일환으로 무릎 전치환술이 필요한 골관절염(OA) 환자(Kellgren-Lawrence 방사선 점수 4)³⁰ 명으로부터 인간 경골 대퇴 관절을 조달합니다. 종양, 감염 또는 염증성 관절염(예: 류마티스 관절염 또는 통풍)의 징후가 있는 환자의 관절은 연구에서 제외되었습니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행되며 실험 프로세스 전반에 걸쳐 표준 실험실 프로토콜을 준수합니다.

1. 경골 대퇴 관절 얻기

1. 치료의 일환으로 무릎 위 절단이 필요한 인간 기증자 또는 무릎 전치환술을 받고 있는³⁰ 등급 골관절염(연골 경화증으로 관절 공간의 현저한 감소를 보여주는 방사선학적 증거) 환자로부터 무릎 관절(경골 대퇴 관절)을 얻습니다.
   참고: 헬싱키 선언의 원칙에 따라 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었는지 확인합니다. 윤리 위원회 및 기관 검토 위원회 규칙을 준수하도록 합니다.
2. 감염이나 염증의 증상을 보이는 관절은 제외합니다.

2. 수확된 조인트 가공

1. 적출된 경골 대퇴 관절을 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 무균 상태로 놓습니다.
2. 멸균 언더패드를 배치하여 후드 아래에 멸균 영역을 준비합니다. 수확된 조인트를 언더패드로 옮깁니다.
3. 연골이 위쪽 방향을 향하도록 연골하골을 유지하여 절편화된 경골 대퇴골을 안정화합니다.
4. 메스 날(22번)을 사용하여 관절을 채취한 후 1-2시간 이내에 골관절염 환자의 체중 부하가 없는 부위에서 직사각형 모양의 연골 부스러기를 채취합니다.
5. 8mm x 10mm의 연골 부분을 표층에서 깊은 층으로 수확합니다.
6. 연골 절편을 1x PBS 용액으로 세척하고 1-2mL의 일반 DMEM 배지가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
7. 메스 날(no.22)로 연골 조각을 1mm x 1mm x 1mm 미만의 크기로 잘 다집니다.
   알림: 연골 절편이나 다진 연골이 마르지 않도록 하십시오. 혈청이 없는 배양 배지 또는 PBS에 넣습니다.

3. 연골 세포의 분리

1. 효소 분해를 위해 0.15% 콜라겐분해효소 II형이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM-F12) 10mL가 들어 있는 직립 T-25 플라스크에 다진 연골을 놓습니다. CO₂ 인큐베이터에서 12-14시간 동안 플라스크를 방해하지 않고 그대로 두어 표준 배양 조건을 확인합니다³¹.
   참고: 혈청이 효소 작용을 비활성화하므로 혈청의 흔적이 없는 일반 DMEM-F12 배지를 사용해야 합니다.
2. 하룻밤 동안 분해한 후, 세포 여과기를 사용하여 세포 여과기를 사용하여 파편에서 세포를 분리하고, 방출된 세포가 포함된 배지를 동일한 부피의 DMEM-F12 + 10% 소 태아 혈청(FBS)이 들어 있는 신선한 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 방출된 세포는 "연골세포"입니다.
3. 여과된 세포를 37°C에서 5분 동안 1200 x g 의 속도로 원심분리합니다.
4. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오. 얻어진 펠릿을 1mL의 배지에서 재구성하고 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 방출된 생존 세포를 계수합니다.
5. T-25 플라스크에 10,000 cells/cm² 농도로 연골 세포를 로드하고 10% FBS를 함유한 DMEM-F12를 사용하여 필요한 계대 수까지 확장합니다. 배지의 추가 성분으로는 아스코르브산(62μg/mL), L-글루타민(2.5mM/L), 페니실린-스트렙토마이신(100IU/mL) 및 암포테리신-B(2μg/mL)가 있습니다.
6. 3일마다 배지를 새로 고치고 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 함유한 0.125% 트립신을 사용하여 하위 합류점에서 세포를 수확합니다.

4. 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 인자(FAA-CP)의 분리

1. 연골 세포가 방출되기 12 시간 전에 1mM의 MgCl₂ (10 μL) 및 1mM의 CaCl₂ (10 μL) 및 100 μL의 피브로넥틴 (10 μL / mL) ³²을 포함하는 1x PBS 10 mL를 준비합니다.
2. 준비된 용액을 사용하여 6웰 플레이트(1.5mL/9.3cm²)의 필요한 수의 웰을 코팅합니다.
3. 접시를 단단히 밀봉하고 4°C에서 밤새 냉장 보관합니다.
4. 또한 연골 세포를 분리하기 위해 설명한 것과 유사한 방식으로 연골 부스러기를 얻습니다(단계 2.1-2.5).
5. 개별 연골 세포를 얻기 위해 37°C로 유지되는 진탕 수조에서 연골 부스러기를 하룻밤 동안 순차적으로 효소 분해(0.2% 프로나제, 12시간 동안 0.04% 콜라겐 분해 효소 II 유형)합니다.
6. 다음 날, 냉장고에서 피브로넥틴으로 코팅된 6웰 플레이트를 꺼내 여분의 피브로넥틴을 제거합니다.
   참고: 과도한 피브로넥틴은 웰 바닥의 코팅을 방해하지 않고 천천히 부드럽게 제거해야 합니다. MgCl₂ (10 μL) 및 1 mM의 CaCl₂ 의 존재는 세포의 부착을 보장하는 데 중요합니다.
7. 코팅된 웰에 2-3mL의 플레인 DMEM-F12 배지를 추가합니다.
8. 방출된 연골 세포를 4000 cells/well의 로딩 밀도로 코팅된 웰에 파종하고 플레이트를 20분 동안 방해받지 않고 그대로 둡니다.
9. 배양 후 과도한 배지와 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 연골세포(DMEM-F12 + 10% FBS)에 사용되는 표준 성장 배지 2-3mL를 추가합니다.
10. CPC 클론(>32 세포 콜로니)을 얻기 위해 표준 배양 조건에서 부착 세포를 10-12일 동안 유지합니다.
11. 0.125% 트립신-EDTA를 사용하여 180초 동안 분리하고, 1 clone/5 cm²의 비율로 클론을 재플레이팅하고, 농축된 polyclonal CP를 필요한 confluence까지 확장합니다. 이렇게 얻어진 세포를 "FAA-CPC"라고 합니다.
12. DMEM-F12 배지 + 10% FBS + 형질전환 성장 인자 베타 2(TGFβ2: 1ng/mL) + 섬유아세포 성장 인자(FGF2: 5ng/mL)에서 세포를 추가로 배양합니다.
    참고: 피브로넥틴으로 코팅된 플레이트에서 세포를 배양하는 시간은 연골세포도 부착하기 시작할 수 있으므로 20분을 초과해서는 안 됩니다. 20분의 접착 기간 동안 배지에 혈청이 없어야 합니다. 다음으로, 형태 클론에 부착하는 세포는 FBS를 추가로 함유하는 배지에서 배양해야 합니다. 클론은 각 클론에 32개 이상의 셀이 있는지 확인한 후에만 격리해야 합니다. 이것은 대중 교통 증폭기를 피하기 위한 것입니다. 트립신화 후 클론의 추가 확장에는 언급된 추가 성장 인자가 포함되어야 합니다. 피브로넥틴으로 코팅된 플레이트의 4000 연골 세포/9.3 cm² 의 로딩 밀도를 20분 배양 후 세척한 후 총 80-100개의 세포가 접착됩니다. 이 중 약 20개의 클론이 성장하여 10-12일 이내에 개체수가 5배로 증가합니다.

5. 이주 연골 형성 동물의 격리

1. 적출된 관절 관절에서 연골 외식식물(10mm x 5mm x 1mm)을 면도하고 10% FBS 및 10mM 글루타맥스(2-3 외식/웰)³³가 포함된 DMEM-F12 배지가 포함된 멸균 6웰 플레이트에 넣습니다.
2. 37 ° C로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 48 시간 동안 외식이있는 플레이트를 그대로 두십시오.
3. 2일 후, 효소 분해를 위해 0.1% 콜라겐분해효소 용액 10mL가 들어 있는 원심분리 튜브에 외식제를 옮깁니다. 튜브를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 외식은 효소 분해 전에 1x PBS로 헹궈야 하는데, 미량의 혈청이 효소 작용을 비활성화할 수 있기 때문입니다. 세척을 위해 2-3mL의 1x PBS로 채워진 페트리 접시에 외식식물을 담그십시오. 이것은 또한 방출된 연골 세포의 오염을 방지하기 위한 것입니다. 외식식물의 취급은 최소한으로 유지되어야 하며, 이는 이주하기 시작한 선조에게 스트레스를 주지 않기 위한 것입니다.
4. 분해 후 1x PBS로 외식을 헹구고 10% FBS 및 10mM의 Glutamax 배지가 포함된 새로운 DMEM-F12 배지가 들어 있는 플레이트의 동일한 웰에 다시 놓습니다.
5. 인큐베이터에서 플레이트를 표준 배양 조건으로 유지하십시오. 이후 며칠 동안 연골 형성 동물의 이동을 관찰하십시오.
6. sub confluence에 도달하면 EDTA를 함유한 Trypsin을 0.125% 사용하여 MCP를 수확합니다.
7. 10% FBS와 10mM의 Glutamax를 함유한 DMEM-F12를 포함하는 표준 팽창 매체를 사용하여 MCP를 확장합니다.

6. 연골 세포, FAA-CP 및 MCP의 표현형 특성화

1. 유세포 분석(FACS)
   참고: 수확된 세포 그룹의 FACS 분석을 위해 다음 단계를 따릅니다.
   1. 0.125% 트립신을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 세포를 트립신화하고 실온에서 1200 x g, 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
   2. 상층액을 버리고 세척한 후 1x PBS로 펠릿을 다시 현탁합니다.
   3. FACS를 위해 라벨이 부착된 튜브로 현탁액을 옮깁니다.
   4. 현탁액을 두 개의 튜브, 즉 대조군 역할을 하는 '염색되지 않은' 튜브(항체가 없는 세포 현탁액)와 테스트 역할을 하는 '염색된' 튜브(항체가 있는 세포 현탁액)로 나눕니다.
   5. 염색을 위한 개별 항체/Cluster of differentiation(CD) 마커의 기술 데이터 시트를 따르십시오. 비교를 위한 항체는 CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC(양성 발현 마커)를 포함합니다. CD34-PE, CD45-FITC 및 CD14-FITC (음성 발현 마커) ^34,35; CD166-BB515 및 CD146-PE (잠재적 연골 생성 마커) ^36,37.
      참고: CD 마커는 빛에 민감합니다. 단계가 어둠 속에서 수행되도록 합니다.
   6. 어둠 속에서 30분 동안 세포 현탁액에 항체를 배양합니다.
   7. 염색 후 1x PBS 1mL를 튜브에 추가하고 1200 x g, 5분 실온에서 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
   8. 상층액의 3/4을 버립니다. 부드러운 분쇄에 의해 나머지 상등액 함량에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   9. FACS 분석을 진행합니다.

7. qRT-PCR

참고: 유전자 발현의 qRT-PCR 분석에는 비후 발현에 대한 콜라겐 I형(COL1A1), 콜라겐 X형(COL10A1) 및 런트 관련 전사 인자(RUNX2)와 연골 형성에 대한 SOX-9, 아그레칸(ACAN) 및 콜라겐 II(COL2A1) 평가가 포함됩니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 세포 그룹에서 RNA를 추출합니다.
2. 추출 후 A₂₆₀/_{A 280} 비율과 RNA 농도를 평가합니다.
3. 추출된 RNA 280ng를 활용하여 상보적 DNA(cDNA)를 구성합니다.
4. Sybr Green을 사용하여 qRT-PCR을 시작하며, 각 반응은 열순환기에서 7ng의 cDNA를 최종 농도로 포함합니다.
5. 각 유전자의 상대 mRNA 발현을 GAPDH reference housekeeping gene(ΔCt)으로 정규화합니다.
6. 각 개별 유전자의 ΔCt 값을 FAA-CPs(ΔΔCt)의 값과 비교하여 ^2-ΔΔCt 기술을 사용하여 각 유전자의 상대 발현을 계산합니다³⁷.

8. 다중 계통 차별화

참고: 상업적으로 이용 가능한 차등 매체는 삼계통 분화를 addipogenic, osteogenic 및 chondrogenic 계통으로 유도합니다.

1. 지방생성 분화를 위해 세포 배양 플레이트에 1000 cells/^cm2 의 로딩 밀도로 세포를 종화시키고 3주 동안 80%의 sub confluence까지 addipogenic 분화 배지(중간 변화 - 3일에 한 번)를 사용하여 배양합니다.
2. 골형성 및 연골형성 분화를 위해서는 28일 펠릿 배양 시스템³⁸을 따르십시오.
3. 원심분리기 0.5 x 10⁶ 개 세포를 400 x g 에서 37°C에서 12분 동안 사용하여 펠릿을 형성하고 골형성 및 연골형성 분화 배지를 사용하여 분화를 시작합니다.
4. 확인 염색을 위해 펠릿을 고정, 삽입 및 절단합니다(9단계).

9. 확인 염색

1. 지방생성 계통 세포의 경우 완충된 포르말린으로 세포를 고정하고 세척한 후 Oil Red O(0.5%)로 염색합니다. 대조군(10% FBS가 포함된 표준 DMEM 배지에서 배양)도 염색합니다.
2. 현미경으로 관찰하고 이미지를 획득합니다.
3. 분화된 골형성 계통 세포의 경우 Alizarin Red(2%)로 염색합니다.
   참고: 여러 확인 염색 프로토콜이 연골형성 분화 세포에 적용할 수 있습니다.
4. Alcian Blue 염색: 고정된 세포를 Alcian Blue로 5분 동안 염색하고 Neutral Red로 대조 염색합니다.
5. 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 평가하기 위해 사프라닌 O 염색을 수행합니다: Wiegert의 철 헤마톡실린으로 슬라이드를 염색한 다음 산 알코올(1%), 패스트 그린 용액(0.05%), 아세트산(1%) 및 사프라닌 O 용액(1%)으로 배양합니다.
6. 톨루이딘 블루 염색: 톨루이딘 블루(0.1%)로 슬라이드를 5분 동안 염색합니다.
7. PicroSirius Red 염색: Picrosirius Red(0.1%)로 슬라이드를 염색하고 Hematoxylin 염료를 사용하여 대조 염색합니다.
   알림: 염색 후에는 등급이 매겨진 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수하고 자일렌을 사용하여 제거합니다. DPX(Dibutylphthalate Polystyrene Xylene) 마운트를 사용하여 슬라이드를 장착하고 현미경으로 관찰한 다음 이미지를 획득합니다.
8. 연골형성 분화 펠릿의 면역조직화학(유형 II 콜라겐) 염색을 위해 효소 프로나제(1mg/mL) 및 히알루로니다아제(2.5mg/mL)를 사용하여 펠릿 절편에 효소 항원 회수를 적용합니다.
9. 1차 마우스 단클론 항콜라겐 II형 항체로 절편을 배양한 다음 1:250 2차 HRP 표지된 염소 항마우스 항체를 배양합니다.
10. 슬라이드를 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 발색으로 염색하고 헤마톡실린을 사용하여 대조염색합니다.
11. 현미경으로 관찰하고 이미지를 캡처합니다.

10. GAG/DNA 함량 측정

1. 파파인-시스테인 용액을 사용하여 65°C에서 16시간 동안 연골을 유발하는 분화된 펠릿을 분해합니다.
2. Picrogreen 시약³⁸ 을 사용하여 DNA 농도를 추정하고 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 파장(여기: 480nm, 방출: 520nm)에서 형광 강도를 획득합니다.
3. 디메틸 메틸렌 블루 염료 방법³⁸을 사용하여 총 GAG 함량을 평가합니다.
4. ELISA 플레이트 리더를 사용하여 525nm에서 광학 밀도를 측정합니다.
5. GAG 값을 DNA 값으로 정규화하고 총 GAG/DNA 비율을 계산합니다.

결과

86.9mg의 연골 절편에서 1.72 x 10⁵ 세포의 연골 세포 수율이 관찰되었습니다. 로딩 시, 연골세포는 즉시 부착하여 초기에는 둥근 조약돌 모양을 나타내고 추가 팽창 시 섬유아세포 상태로 변형됩니다(그림 1 A, B). 이러한 연골세포를 피브로넥틴 플레이트에 파종하면 일반적으로 2%의 접착력이 발생하며, 각 세포는 클론 성장(

토론

유리질 조직을 포함하는 관절 연골의 잠재적인 재생은 두 가지 기본 세포 유형인 연골세포(chondrocyte)와 연골형성체(chondroprogenitors)의 최적화를 통해 달성될 수 있습니다. 연골세포에 대한 광범위한 연구는 연골 복구에 대한 연골 세포의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만, 재생 조직의 특성에 대한 의문으로 인해 연골 세포의 표현형을 강화하고 대체 요법을 모색하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072