АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе подробно описывается выделение хондроцитов, хондропрогениторов, полученных методом анализа адгезии фибронектина (FAA-CPs), и мигрирующих хондропрогениторов (MCP) из суставного хряща человека. Он охватывает ферментативное расщепление, адгезию фибронектина и анализы на основе миграции для выделения и характеристики этих клеток.

Аннотация

Хондропрогениторные клетки (КПК), недавно идентифицированные как отдельная субпопуляция, демонстрируют многообещающие перспективы благодаря своим мезенхимальным свойствам, повышенному хондрогенезу и ограниченным гипертрофическим признакам. Обогащение предшественников достигается за счет дифференциальной адгезии фибронектина и анализа эксплантов на основе миграции, при этом хондропрогениторы, полученные из анализа адгезии фибронектина (FAA-CP) и мигрирующие хондропрогениторы (MCP), демонстрируют превосходный потенциал по сравнению с хондроцитами. В этой статье подробно рассматривается вопрос выделения резидентных хрящевых клеток, а именно хондроцитов и хондропрогениторов. В то время как ценные выводы из исследований хондроцитов вносят вклад в наше понимание восстановления хряща, текущие усилия направлены на использование хондропрогениторов и изучение их потенциала в качестве альтернативного терапевтического подхода. Кроме того, в этой методологической статье представлен подробный пошаговый протокол выделения трех конкретных типов клеток из хряща: хондроцитов, FAA-CP и MCP. Следуя стандартизированным процедурам, этот протокол способствует успешной экстракции этих подтипов клеток. Основанная на обширных исследованиях, статья фокусируется на сложных методах, используемых для выделения различных подмножеств, и оптимизированных условиях культивирования, необходимых для расширения и поддержания их культур. Методология включает в себя ферментативное выделение хондроцитов, полученных из суставного хряща человека, дифференциальную адгезию фибронектина после последовательного ферментативного расщепления, а также анализ эксплантов на основе миграции для получения хрящевых резидентных клеток.

Введение

Появление клеточной регенеративной терапии представляет собой важный подход к лечению заболеваний, связанных с хрящевой тканью, таких как остеоартрит (ОА) и хондральныедефекты. Эти заболевания, характеризующиеся разрывом или повреждением хряща в суставах, представляют собой значительные трудности во время лечения. Сообщается, что самовосстановление суставного хряща ограничено из-за его анейронной архитектуры, аваскулярности и низкой митотической активности2.

Наиболее часто используемыми клетками для регенерации хрящевой ткани являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и хондроциты3. Тем не менее, в нескольких исследованиях сообщалось об ограничениях в использовании этих клеток длярегенерации4. Эти ограничения включают терминальную дифференцировку хондроцитов во время расширенной экспансии in vitro для достижения необходимого количества клеток и гипертрофическую тенденцию МСК. Эти факторы могут привести к образованию восстановительной ткани с неоптимальным сочетанием фиброзного хряща и гиалина 5,6,7,8.

Открытие хондропрогениторных клеток (КПК) стало результатом поиска альтернативных клеток в суставном хряще9. Они вызвали огромный интерес благодаря своему сходству с МСК и их превосходному хондрогенному потенциалу, при этом демонстрируя сниженную гипертрофию - незаменимую комбинацию, которую ищут10,11. В отличие от хондроцитов, эти популяции предшественников, как сообщается, демонстрируют повышенную репликативную и теломеразную активность, а также повышенную экспрессию нейрогенного локуса гомологического белка 1 (NOTCH-1) и SRY-боксового фактора транскрипции 9 (SOX-9)12,13,14,15. Существует два стандартных метода выделения ЦПК как из хряща, так и из мениска, в том числе один, основанный на экспрессии их интегриновых рецепторов (CD49e/CD29), выделенных с помощью анализа адгезии фибронектина - хондропрогениторы, полученные из фибронектиновой адгезии (FAA-CPs), и другой, основанный на их повышенном миграционном потенциале из хрящевых эксплантов - мигрирующие хондропрогениторы (МКП)11,13,16,17,18,19. Многочисленные исследования in vitro демонстрируют хондрогенное превосходство и сниженную гипертрофию как FAA-CPCs, так и MCP по сравнению с хондроцитами и костным мозгом (BM)-MSCs 20,21,22,23.

Недавние исследования in vitro, сравнивающие FAA-CPC с MCP, продемонстрировали повышенную способность к регенерации хряща у последней популяции предшественников при нормальных кислородных условиях24. Эти оптимистичные результаты in vitro демонстрируют гиалиноподобную регенерацию, что способствует дальнейшим экспериментам in vivo. Тем не менее, сообщалось, что обе популяции ЦПК эффективно восстанавливают и регенерируют хрящ при остеоартрите и других остеохондральных заболеваниях на животных моделях 25,26,27,28,29.

Наша лаборатория активно участвовала в стандартизации методик выделения ЦПК и сравнении их фенотипических характеристик с хондроцитами и МСК. В этой статье будет представлен подробный протокол, объясняющий шаги, связанные с выделением и культивированием резидентных клеток хряща, а именно хондроцитов, FAA-CPC и MCP.

протокол

Протокол утвержден и соответствует соответствующим правилам и рекомендациям Институционального наблюдательного совета (Комитета по исследованиям и этике). После получения письменного информированного согласия берцово-бедренные суставы человека приобретаются у пациентов с остеоартритом (ОА) (радиологическая оценка Келлгрена-Лоуренса 4)30 , которым требуется полная замена коленного сустава в рамках их лечения. Суставы пациентов с любыми признаками опухолей, инфекций или воспалительного артрита (таких как ревматоидный артрит или подагра) были исключены из исследования. Гарантируется, что все процедуры проводятся в стерильных условиях, с соблюдением стандартных лабораторных протоколов на протяжении всего экспериментального процесса.

1. Получение большеберцово-бедренных суставов

  1. Получить коленные суставы (большеберцово-бедренные суставы) от доноров, которым требуется ампутация выше колена в рамках лечения, или у пациентов с остеоартритом IV степени30 (рентгенологические данные, показывающие заметное уменьшение суставной щели при хондральном склерозе), перенесших тотальную замену коленного сустава.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить получение информированного согласия от пациентов в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Обеспечить соблюдение правил Комитета по этике и Институционального наблюдательного совета.
  2. Исключите суставы с симптомами инфекции или воспаления.

2. Обработка заготовленных швов

  1. Поместите собранные большеберцово-бедренные суставы в 1x фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) в стерильных условиях.
  2. Подготовьте стерильную зону под капюшоном, поместив стерильную пеленку. Переложите заготовленные стыки на пеленку.
  3. Стабилизируйте рассекреченные большеберцово-бедренные суставы, удерживая субхондральную кость хрящом вверх.
  4. С помощью лезвия скальпеля (No 22) соберите хрящевую стружку прямоугольной формы из областей без нагрузки у пациентов с остеоартритом в течение 1-2 часов после получения сустава.
  5. Соберите участки хряща размером 8 мм x 10 мм от поверхностного слоя к более глубокому.
  6. Промойте срезы хряща 1x раствором PBS и поместите их в чашку Петри, содержащую 1-2 мл простой среды DMEM.
  7. Аккуратно измельчите ломтики хряща до размера менее 1 мм x 1 мм x 1 мм с помощью лезвия скальпеля (No 22).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы срезы хряща или измельченный хрящ не пересыхали; поместите их в питательную среду или PBS, лишенную сыворотки.

3. Выделение хондроцитов

  1. Поместите измельченный хрящ в вертикальную колбу T-25, содержащую 10 мл модифицированного Eagle Medium F12 от Dulbecco (DMEM-F12) с 0,15% коллагеназы типа II для ферментативного пищеварения. Оставьте колбу в покое на 12-14 ч в инкубаторе сСО2 , обеспечив стандартные условия культивирования31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать обычную среду DMEM-F12 без следов сыворотки, так как сыворотка инактивирует ферментативное действие.
  2. После ночного сбраживания переложите среду, содержащую высвобожденные клетки, в свежую стерильную центрифужную пробирку, содержащую равный объем DMEM-F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), используя клеточный фильтр для отделения клеток от мусора. Высвобождающиеся клетки являются «хондроцитами».
  3. Центрифугируйте отфильтрованные ячейки со скоростью 1200 x g в течение 5 минут при 37 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Восстановите полученную гранулу в 1 мл среды и подсчитайте высвобождаемые жизнеспособные клетки с помощью теста исключения трипанового синего.
  5. Загрузите хондроциты в колбу Т-25 в концентрации 10 000 клеток/см² и разверните до необходимого количества проходов с помощью DMEM-F12, содержащего 10% FBS. Дополнительные компоненты в среде включают аскорбиновую кислоту (62 мкг/мл), L-глутамин (2,5 мкм/л), пенициллин-стрептомицин (100 МЕ/мл) и амфотерицин-B (2 мкг/мл).
  6. Обновляйте среду каждые 3 дня и собирайте клетки в момент субслияния, используя 0,125% трипсин, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).

4. Выделение хондропрогениторов, полученных из анализа адгезии фибронектина (FAA-CPs)

  1. За 12 ч до высвобождения хондроцитов приготовьте 10 мл 1x PBS, содержащего 1 мМ MgCl2( 10 мкл) и 1 мМ CaCl2 (10 мкл), а также 100 мкл фибронектина (10 мкл/мл)32.
  2. Покрыть необходимое количество лунок 6-луночным планшетом (1,5 мл/9,3 см2 ) приготовленным раствором.
  3. Плотно закройте тарелку и поставьте в холодильник на ночь при температуре 4 °C.
  4. Кроме того, получите хрящевую стружку способом, аналогичным описанному для выделения хондроцитов (шаги 2.1-2.5).
  5. Подвергают хрящевую стружку последовательному ферментативному разложению в течение ночи (0,2% проназы в течение 3 ч; затем 0,04% коллагеназы II типа в течение 12 ч) в встряхивающей водяной бане, поддерживаемой при температуре 37 °С, для получения отдельных хондроцитов.
  6. На следующий день достаньте из холодильника 6-луночную пластину, покрытую фибронектином, и удалите излишки фибронектина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток фибронектина следует удалять медленно и осторожно, не нарушая покрытие на дне колодца. Присутствие MgCl2 (10 мкл) и 1 мМ CaCl2 имеет решающее значение для обеспечения прикрепления клеток.
  7. Добавьте в лунки с покрытием 2-3 мл обычной среды DMEM-F12.
  8. Высвободившиеся хондроциты засейте в лунки с покрытием при плотности загрузки 4000 клеток/лунку и оставьте планшет в покое на период 20 минут.
  9. После инкубации удалите излишки среды и неадгезивные клетки. Добавьте 2-3 мл стандартной питательной среды, используемой для хондроцитов (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Сохраняют адгезивные клетки в стандартных условиях культивирования в течение 10-12 дней для получения клонов CPC (колонии >32 клеток).
  11. Изолируют с использованием 0,125% трипсина-ЭДТА в течение 180 с, повторно наклеивают клоны в соотношении 1 клон/5 см² и расширяют обогащенные поликлональные ЦП до требуемого слияния. Полученные элементы называются «FAA-CPC».
  12. Далее культивируют клетки в среде DMEM-F12 + 10% FBS + трансформирующий фактор роста бета 2 (TGFβ2: 1 нг/мл) + фактор роста фибробластов (FGF2: 5 нг/мл).
    Примечание: Инкубация клеток на пластинах, покрытых фибронектином, не должна превышать 20 минут, так как хондроциты также могут начать склеиваться. В течение 20-минутного периода адгезии средство должно быть лишено сыворотки. Далее клетки, которые прилипают к форме клонов, должны быть культивированы в среде, дополнительно содержащей FBS. Клоны должны быть изолированы только после того, как убедится, что каждый клон имеет более 32 клеток; Это необходимо для того, чтобы избежать транзитных усилителей. Дальнейшая экспансия клонов после трипсинизации должна включать упомянутые дополнительные факторы роста. Плотность загрузки 4000 хондроцитов/9,3см2 пластины, покрытой фибронектином, после 20-минутной инкубации с последующей промывкой приводит к адгезии в общей сложности 80-100 клеток. Из них около 20 клонов будут развиваться и достигнут удвоения популяции на 5 в течение 10-12 дней.

5. Выделение мигрирующих хондропрогениторов

  1. Выбрейте экспланты хрящевой ткани (10 мм x 5 мм x 1 мм) из собранного суставного сустава и поместите их в стерильную 6-луночную пластину, содержащую среду DMEM-F12 с 10% FBS и 10 мМ глутамакс (2-3 экспланта/лунка)33.
  2. Оставьте планшет с эксплантами в покое на 48 часов в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C.
  3. Через 2 дня переложите экспланты в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл 0,1% раствора коллагеназы для ферментативного расщепления. Инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты необходимо промыть 1x PBS перед ферментативным перевариванием, так как следы сыворотки могут инактивировать действие фермента. Для промывки опустите экспланты в чашку Петри, наполненную 2-3 мл 1x PBS; Это также необходимо для обеспечения неконтаминации любыми высвобождающимися хондроцитами. Обращение с эксплантами должно быть сведено к минимуму, и это необходимо для того, чтобы не подвергать стрессу предшественников, которые начали мигрировать.
  4. После разложения промойте экспланты с помощью 1x PBS и поместите их обратно в те же лунки планшета, где содержится свежая среда DMEM-F12 с 10% FBS и 10 мМ среды Glutamax.
  5. Выдерживают тарелку в стандартных условиях культуры в инкубаторе. Наблюдайте за миграцией хондропрогениторов в последующие дни.
  6. По достижении субслияния собирают МКП, используя 0,125% трипсина, содержащего ЭДТА.
  7. Расширяйте МКП с помощью стандартной расширяющей среды, в состав которой входит DMEM-F12, содержащая 10% FBS и 10 мМ глутамакса.

6. Фенотипическая характеристика хондроцитов, FAA-CP и MCP

  1. Проточный цитометрический анализ (FACS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа с помощью FACS собранных групп клеток выполняются следующие шаги.
    1. Трипсинизируйте клетки в соответствии со стандартным протоколом с использованием 0,125% трипсина и центрифугируйте при 1200 x g, 5 мин, комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу.
    2. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте и снова суспендируйте гранулу с 1x PBS.
    3. Переложите суспензию в пробирки с маркировкой для FACS.
    4. Разделите суспензию поровну на две пробирки: «неокрашенную» пробирку, которая действует как контрольную (клеточная суспензия без антител), и «окрашенную» пробирку, которая действует как тест (клеточная суспензия с антителом).
    5. Следуйте техническому паспорту отдельных антител/маркеров кластера дифференцировки (CD) для окрашивания. Антитела для сравнения включают CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (маркеры положительной экспрессии); CD34-PE, CD45-FITC и CD14-FITC (маркеры отрицательной экспрессии)34,35; CD166-BB515 и CD146-PE (потенциальные хондрогенные маркеры)36,37.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CD-маркеры светочувствительны. Для обеспечения выполнения действий в темное время суток.
    6. Инкубировать клеточную суспензию с антителами в течение 30 минут в темноте.
    7. После окрашивания добавьте 1 мл 1x PBS в пробирки и центрифугируйте при 1200 x g, 5 минут, комнатной температуры, чтобы получить клеточную гранулу.
    8. Выбросьте три четверти надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся содержании надосадочной жидкости путем осторожного растирания.
    9. Перейти к анализу FACS.

7. qRT-PCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ экспрессии генов методом qRT-PCR включает оценку коллагена I типа (COL1A1), коллагена типа X (COL10A1) и рант-связанного транскрипционного фактора (RUNX2) на гипертрофическую экспрессию, а также SOX-9, Aggrecan (ACAN) и коллагена II типа (COL2A1) на хондрогенез.

  1. Извлекайте РНК из клеточных групп с помощью коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями производителя.
  2. После экстракции оцените соотношение A260/A280 и концентрацию РНК.
  3. Используйте 280 нг экстрагированной РНК для создания комплементарной ДНК (кДНК).
  4. Инициируйте qRT-PCR с помощью Sybr Green, каждая реакция содержит конечную концентрацию 7 нг кДНК на термоциклере.
  5. Нормализуйте относительную экспрессию мРНК каждого гена к референсному гену GAPDH (ΔCt).
  6. Рассчитайте относительную экспрессию каждого гена с помощью метода 2-ΔΔCt путем сравнения значения ΔCt каждого отдельного гена с значением FAA-CPs (ΔΔCt)37.

8. Многолинейная дифференциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная дифференциальная среда индуцирует трехлинейную дифференцировку на адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии.

  1. Для адипогенной дифференцировки затравливают клетки при плотности загрузки 1000 клеток/см2 в клеточной культуральной тарелке и культуре с использованием среды адипогенной дифференцировки (смена среды - 1 раз в 3 дня) до субслияния 80% в течение 3 недель.
  2. Для остеогенной и хондрогенной дифференциации следует применять 28-дневную систему культивирования гранул38.
  3. Центрифугируйте 0,5 x 106 клеток при 400 x g в течение 12 мин при 37 °C для образования гранул и инициирования дифференцировки с использованием остеогенной и хондрогенной среды для дифференцировки.
  4. Зафиксируйте, заделайте и разделите гранулы для подтверждающего окрашивания (шаг 9).

9. Подтверждающее окрашивание

  1. В случае адипогенных клеток линии закрепите клетки буферным формалином, промойте и окрашивайте маслом Red O (0,5%). Также покрасьте контрольные элементы (культивируемые на стандартной среде DMEM с 10% FBS).
  2. Наблюдайте под микроскопом и получайте изображения.
  3. Для дифференцированных остеогенных клеток линии окрашивают Ализарином красным (2%).
    Примечание: Для хондрогенных дифференцированных клеток применимы множественные подтверждающие протоколы окрашивания.
  4. Окрашивание Alcian Blue: Окрашивайте неподвижные элементы Alcian Blue в течение 5 минут и закрасьте нейтральным красным.
  5. Для оценки содержания гликозаминогликана (ГАГ) проводят окрашивание сафранином О: окрашивают предметные стекла железным гематоксилином Вигерта с последующей инкубацией кислым спиртом (1%), быстрым зеленым раствором (0,05%), уксусной кислотой (1%) и раствором сафранина О (1%).
  6. Окрашивание толуидиновым синим: Окрашивайте предметные стекла синим толуидином (0,1%) в течение 5 минут.
  7. Окрашивание PicroSirius Red: Окрасьте предметные стекла Picrosirius Red (0,1%) и контрокрашивание с помощью красителя Hematoxylin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания обезвоживайте предметные стекла с помощью отсортированного спирта и очистите их с помощью ксилола. Монтируйте предметные стекла с помощью монтанта из дибутилфталата полистирола ксилола (DPX), рассматривайте их под микроскопом и получайте изображения.
  8. Для иммуногистохимического окрашивания (коллаген II типа) хондрогенной дифференцированной пеллеты срезы гранул подвергают ферментативному забору антигена с использованием ферментов проназы (1 мг/мл) и гиалуронидазы (2,5 мг/мл).
  9. Инкубируйте срезы с первичным мышиным моноклональным антиколлагеновым антителом типа II, а затем вторичным козьим антимышиным антителом 1:250, меченным HRP.
  10. Окрашиваем предметные стекла хромогеном 3,3'-диаминобензидина (DAB) и противостоим им с помощью гематоксилина.
  11. Наблюдайте под микроскопом и делайте снимки.

10. Определение содержания ГАГ/ДНК

  1. Хондрогенные дифференцированные гранулы с использованием раствора папаин-цистеина при 65 °C в течение 16 ч.
  2. Оценить концентрацию ДНК с помощью реагента Picrogreen38 и получить интенсивность флуоресценции на длинах волн - возбуждение: 480 нм, излучение: 520 нм с помощью планшетного ридера ELISA.
  3. Оценка общего содержания ГАГ с использованием метода диметилметиленового синего красителя38.
  4. Измерьте оптическую плотность на длине волны 525 нм с помощью планшетного ридера ELISA.
  5. Нормализуйте значения GAG до значений DNA и рассчитайте общее соотношение GAG/DNA.

Результаты

Из 86,9 мг срезов хряща был отмечен выход хондроцитарных клеток 1,72 х 105 клеток. При загрузке хондроциты быстро адгезируются, представляя первоначальный округлой булыжник и трансформируясь в фибробластическое состояние при дальнейшем расширении (рис. 1...

Обсуждение

Потенциальная регенерация суставного хряща, содержащего гиалиновую ткань, может быть достигнута за счет оптимизации двух типов его нативных клеток: хондроцитов и хондропрогениторов. В то время как обширные исследования хондроцитов предоставили ценную информацию о?...

Раскрытие информации

Никакой.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность г-же Бхавини Кришнан и г-же Мерин Мэри Захария за их интеллектуальный вклад, а также Центру исследований стволовых клеток (подразделение inStem Bengaluru), факультету физиологии, Христианскому медицинскому колледжу, Веллор, за инфраструктурную поддержку. Текущие проекты поддерживаются Департаментом биотехнологии (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Правительством Индии, Советом по научным и инженерным исследованиям (CRG/2022/004277), Правительством Индии и грантами на исследования жидкостей, Христианский медицинский колледж, Веллор.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

Ссылки

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163 (2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3, (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203 (2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39 (2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246 (2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421 (2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462 (2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614 (2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966 (2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11 (2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685 (2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104 (2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052 (2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93 (2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536 (2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588 (2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66 (2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685 (2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106 (2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119 (2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713 (2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены