Aislamiento de condrocitos y condroprogenitores mediante adhesión de fibronectina y ensayo migratorio

Resumen

Este protocolo detalla el aislamiento de condrocitos, condroperogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) del cartílago articular humano. Abarca la digestión enzimática, la adhesión a la fibronectina y los ensayos basados en la migración para aislar y caracterizar estas células.

Resumen

Las células condroprogenitadoras (CPC), recientemente identificadas como una subpoblación distinta, son prometedoras debido a sus propiedades mesenquimales, mayor condrogénesis y rasgos hipertróficos limitados. El enriquecimiento de los progenitores se logra a través de la adhesión diferencial de fibronectina y ensayos de explantes basados en la migración, con condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) que demuestran un potencial superior en comparación con los condrocitos. Este artículo profundiza en los detalles del aislamiento de células derivadas del cartílago residente, a saber, condrocitos y condroprogenitores. Si bien los valiosos conocimientos de la investigación de los condrocitos contribuyen a nuestra comprensión de la reparación del cartílago, los esfuerzos continuos se dirigen hacia el uso de condroprogenitores y la exploración de su potencial como un enfoque terapéutico alternativo. Además, este artículo de metodología proporciona un protocolo detallado paso a paso para aislar tres tipos específicos de células del cartílago: condrocitos, FAA-CP y MCP. Al seguir procedimientos estandarizados, este protocolo facilita la extracción exitosa de estos subtipos de células. Basado en una extensa investigación, el artículo se centra en las intrincadas técnicas utilizadas para aislar los diferentes subconjuntos y las condiciones de cultivo optimizadas necesarias para expandir y mantener sus cultivos. La metodología abarca el aislamiento enzimático de condrocitos derivados del cartílago articular humano, la adhesión diferencial de fibronectina después de la digestión enzimática secuencial y los ensayos de explantes basados en la migración para obtener células residentes en el cartílago.

Introducción

La aparición de la terapia regenerativa basada en células representa un enfoque importante para el tratamiento de las dolencias relacionadas con el cartílago, como la osteoartritis (OA) y los defectos condrales¹. Estos trastornos, caracterizados por la ruptura o lesión del cartílago dentro de las articulaciones, presentan desafíos sustanciales durante el tratamiento. Se ha reportado que la autorreparación del cartílago articular es limitada debido a su arquitectura anenal, avascularidad y baja actividad mitótica².

Las células más utilizadas para la regeneración del tejido cartilaginoso son las células madre mesenquimales (MSC) y los condrocitos³. Sin embargo, varios estudios han reportado limitaciones en el uso de estas células para la regeneración⁴. Estas limitaciones incluyen la diferenciación terminal de los condrocitos durante la expansión in vitro extendida para lograr el recuento celular requerido y la tendencia hipertrófica de las MSC. Estos factores pueden dar lugar a la formación de tejido reparador con una combinación subóptima de fibrocartílago e hialina 5,6,7,8.

El descubrimiento de las células condroprogenitadoras (CPC) surgió de la búsqueda de células alternativas en el cartílago articular⁹. Han generado un inmenso interés debido a su parecido con las MSC y su potencial condrogénico superior, al tiempo que exhiben una hipertrofia reducida, una combinación indispensable buscada por ^10,11. A diferencia de los condrocitos, se ha reportado que estas poblaciones progenitoras exhiben una mayor actividad replicativa y de telomerasa, así como una mayor expresión de la proteína homóloga 1 del locus neurogénico notch (NOTCH-1) y el factor de transcripción SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Existen dos métodos estándar para aislar CPC reportados tanto en cartílago como en menisco, incluido uno basado en su expresión del receptor de integrina (CD49e/CD29), aislado a través de un ensayo de adhesión de fibronectina: Condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP), y el otro basado en su mayor potencial migratorio de los explantes de cartílago: Condroprogénidores migratorios (MCP)11,13,16,17,^{Isaías 18,19}. Numerosos estudios in vitro demuestran la superioridad condrogénica y la reducción de la hipertrofia tanto de las FAA-CPCs como de las MCPs en comparación con los condrocitos y las MSCs de médula ósea (BM)-^20,21,22,23.

Investigaciones recientes in vitro que comparan los FAA-CPC con los MCP han demostrado la mayor capacidad de regeneración del cartílago de esta última población progenitora en condiciones normales de oxígeno²⁴. Estos optimistas resultados in vitro muestran una regeneración similar a la hialina, lo que alienta la realización de nuevos experimentos in vivo. Sin embargo, se ha reportado que ambas poblaciones de CPC reparan y regeneran eficientemente el cartílago en la OA y otros trastornos osteocondrales en modelos animales 25,26,27,28,29.

Nuestro laboratorio ha contribuido activamente a estandarizar las técnicas de aislamiento de CPC y a comparar sus características fenotípicas con condrocitos y MSCs. Este artículo proporcionará un protocolo detallado que explica los pasos involucrados en el aislamiento y cultivo de células residentes de cartílago, a saber, condrocitos, FAA-CPC y MCP.

Protocolo

El protocolo ha sido aprobado y cumple con las normas y directrices pertinentes del Comité de Revisión Institucional (Comité de Investigación y Ética). Después de obtener el consentimiento informado por escrito, se obtienen articulaciones tibiofemorales humanas de pacientes con osteoartritis (OA) (puntuación radiológica de Kellgren-Lawrence 4)³⁰ que requieren un reemplazo total de rodilla como parte de su tratamiento. Se excluyeron del estudio las articulaciones de los pacientes con cualquier signo de tumores, infecciones o artritis inflamatoria (como artritis reumatoide o gota). Se garantiza que todos los procedimientos se lleven a cabo en condiciones estériles, siguiendo los protocolos estándar de laboratorio durante todo el proceso experimental.

1. Obtención de articulaciones tibiofemorales

1. Obtener articulaciones de rodilla (articulaciones tibiofemorales) de donantes humanos que requieran una amputación por encima de la rodilla como parte del tratamiento o de aquellos con osteoartritis de grado IV³⁰ (evidencia radiológica que muestra una marcada reducción del espacio articular con esclerosis condral) que se someten a un reemplazo total de rodilla.
   NOTA: Asegúrese de que se obtenga el consentimiento informado de los pacientes siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Asegurar el cumplimiento de las reglas del Comité de Ética y de la Junta de Revisión Institucional.
2. Excluya cualquier articulación que muestre síntomas de infección o inflamación.

2. Procesamiento de las articulaciones cosechadas

1. Coloque las articulaciones tibiofemorales recolectadas en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en condiciones estériles.
2. Prepare un área estéril debajo de la capucha colocando una almohadilla estéril. Transfiera las articulaciones cosechadas a la almohadilla inferior.
3. Estabilice las articulaciones tibiofemorales seccionadas sosteniendo el hueso subcondral con el cartílago hacia arriba.
4. Con una hoja de bisturí (n.º 22), extraiga virutas de cartílago de forma rectangular de las zonas que no soportan peso para los pacientes con artrosis dentro de 1-2 h después de obtener la articulación.
5. Cosecha las secciones de cartílago de 8 mm x 10 mm desde la capa superficial hasta la capa más profunda.
6. Lave las rodajas de cartílago con 1x solución de PBS y colóquelas en una placa de Petri que contenga 1-2 ml de medio DMEM simple.
7. Picar el cartílago en rodajas agradables hasta un tamaño de menos de 1 mm x 1 mm x 1 mm con una hoja de bisturí (n.º 22).
   NOTA: Asegúrese de que las rodajas de cartílago o el cartílago picado no se sequen; colóquelos en un medio de cultivo o PBS desprovisto de suero.

3. Aislamiento de condrocitos

1. Colocar el cartílago picado en un matraz T-25 vertical que contenga 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) con 0,15% de colagenasa tipo II para digestión enzimática. Deje el matraz sin tocar durante 12-14 h en una incubadora de_CO2 , garantizando las condiciones normales^{de cultivo 31}.
   NOTA: Se debe utilizar un medio DMEM-F12 simple sin trazas de suero, ya que el suero inactiva la acción enzimática.
2. Después de la digestión durante la noche, transfiera el medio que contiene las células liberadas a un tubo de centrífuga fresco y estéril que contenga un volumen igual de DMEM-F12 + 10% de suero fetal bovino (FBS), utilizando un colador de células para separar las células de los desechos. Las células liberadas son los "condrocitos".
3. Centrifugar las células filtradas a una velocidad de 1200 x g durante 5 minutos a 37 °C.
4. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet. Reconstituya el pellet obtenido en 1 mL de medio y cuente las células viables liberadas mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano.
5. Cargue los condrocitos en un matraz T-25 a una concentración de 10.000 células/cm² y amplíe hasta el número de paso requerido utilizando DMEM-F12 que contenga un 10% de FBS. Los componentes adicionales en el medio incluyen ácido ascórbico (62 μg/mL), L-glutamina (2,5 mM/L), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL) y anfotericina-B (2 μg/mL).
6. Refresque el medio cada 3 días y recoja las células en subconfluencia utilizando ácido etilendiaménico tetraacético (EDTA) al 0,125% que contiene tripsina.

4. Aislamiento de condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a fibronectina (FAA-CP)

1. 12 h antes de la liberación de los condrocitos, preparar 10 mL de 1x PBS que contenga 1 mM de MgCl₂ (10 μL) y 1 mM de CaCl₂ (10 μL), y 100 μL de Fibronectina (10 μL/mL)³².
2. Cubra el número requerido de pocillos de una placa de 6 pocillos (1,5 mL/9,3 cm²) con la solución preparada.
3. Selle la placa herméticamente y refrigere durante la noche a 4 °C.
4. Además, obtenga virutas de cartílago de una manera similar a la explicada para el aislamiento de condrocitos (pasos 2.1-2.5).
5. Someter las virutas de cartílago a una digestión enzimática secuencial durante la noche (0,2% de Pronase durante 3 h; seguida de 0,04% de Colagenasa tipo II durante 12 h) en un baño de agua agitado mantenido a 37 °C para obtener condrocitos individuales.
6. Al día siguiente, retire la placa de 6 pocillos recubierta de fibronectina del refrigerador y elimine el exceso de fibronectina.
   NOTA: El exceso de fibronectina debe eliminarse lenta y suavemente sin alterar el recubrimiento en el fondo del pozo. La presencia de MgCl₂ (10 μL) y 1 mM de CaCl₂ es crucial para asegurar la adhesión de las células.
7. Agregue 2-3 mL de medio DMEM-F12 simple en los pocillos recubiertos.
8. Siembre los condrocitos liberados en los pocillos recubiertos a una densidad de carga de 4000 células/pocillo y deje la placa sin tocar durante un período de 20 min.
9. Después de la incubación, retire el exceso de medios y las células no adherentes. Agregue 2-3 mL de medio de crecimiento estándar como se usa para los condrocitos (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. Mantener las células adherentes en condiciones de cultivo estándar durante 10-12 días para obtener clones de CPC (colonias de >32 células).
11. Aislar con tripsina-EDTA al 0,125% durante 180 s, replatear los clones en una proporción de 1 clon/5 cm² y expandir los CP policlonales enriquecidos hasta la confluencia requerida. Estas células obtenidas se denominan "FAA-CPC".
12. Cultivo adicional de las células en medio DMEM-F12 + 10% FBS + factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + factor de crecimiento de fibroblastos (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: La incubación de las células en placas recubiertas de fibronectina no debe exceder los 20 minutos, ya que los condrocitos también pueden comenzar a adherirse. Durante el período de adherencia de 20 minutos, el medio debe estar desprovisto de suero. A continuación, las células que se adhieren a formar clones deben cultivarse en un medio que contenga adicionalmente FBS. Los clones deben aislarse solo después de asegurarse de que cada clon tenga más de 32 células; Esto es para evitar los amplificadores de tránsito. Una mayor expansión de los clones después de la tripsinización debe incluir los factores de crecimiento adicionales mencionados. Una densidad de carga de 4000 condrocitos/9,3^cm2 de una placa recubierta de fibronectina, después de una incubación de 20 minutos seguida de un lavado, da como resultado la adhesión de 80-100 células en total. De estos, alrededor de 20 clones progresarán para crecer y lograr una duplicación de la población de 5 en 10-12 días.

5. Aislamiento de condroprogenitores migratorios

1. Afeitar los explantes de cartílago (10 mm x 5 mm x 1 mm) de la articulación extraída y colocarlos en una placa estéril de 6 pocillos que contenga medios DMEM-F12 con 10% de FBS y 10 mM de Glutamax (2-3 explantes/pocillo)³³.
2. Deje la placa con los explantes sin tocar durante 48 h en una incubadora de_CO2 mantenida a 37 °C.
3. Después de 2 días, transfiera los explantes a un tubo de centrífuga que contenga 10 mL de solución de colagenasa al 0,1% para digestión enzimática. Incubar el tubo a 37 °C durante 2 h.
   NOTA: Los explantes requieren ser enjuagados con 1x PBS antes de la digestión enzimática, ya que las trazas de suero pueden inactivar la acción enzimática. Para el lavado, sumerja los explantes en una placa de Petri llena de 2-3 mL de 1x PBS; Esto también es para garantizar la no contaminación con los condrocitos liberados. El manejo de los explantes debe mantenerse al mínimo, y esto es para evitar estresar a los progenitores que han comenzado a migrar.
4. Después de la digestión, enjuague los explantes con 1x PBS y vuelva a colocarlos en los mismos pocillos de la placa que contiene medios DMEM-F12 frescos con 10% de FBS y 10 mM de medio Glutamax.
5. Mantenga la placa en condiciones de cultivo estándar en la incubadora. Observe la migración de condroprogenitores en los días siguientes.
6. Al llegar a la subconfluencia, coseche los MCP utilizando 0,125% de tripsina que contenga EDTA.
7. Amplíe los MCP utilizando el medio de expansión estándar, que incluye DMEM-F12, que contiene un 10% de FBS y 10 mM de Glutamax.

6. Caracterización fenotípica de condrocitos, FAA-CPs y MCPs

1. Análisis de citometría de flujo (FACS)
   NOTA: Se siguen los siguientes pasos para el análisis FACS de los grupos de células cosechadas.
   1. Tripsinizar las células según el protocolo estándar utilizando tripsina al 0,125% y centrifugar a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obtener el pellet de la célula.
   2. Deseche el sobrenadante, lave y vuelva a suspender el pellet con 1x PBS.
   3. Transfiera la suspensión a tubos etiquetados para FACS.
   4. Divida la suspensión en partes iguales en dos tubos: un tubo "sin teñir" que actúa como control (suspensión celular sin anticuerpo) y tubos "teñidos" que actúan como pruebas (suspensión celular con anticuerpo).
   5. Siga la ficha técnica de los anticuerpos individuales/Cluster de marcadores de diferenciación (CD) para la tinción. Los anticuerpos para la comparación incluyen CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcadores de expresión positivos); CD34-PE, CD45-FITC y CD14-FITC (marcadores de expresión negativos)^34,35; CD166-BB515 y CD146-PE (potenciales marcadores condrogénicos)^36,37.
      NOTA: Los marcadores de CD son sensibles a la luz. Para asegurarse de que los pasos se realicen en la oscuridad.
   6. Incubar la suspensión celular con anticuerpos durante 30 minutos en la oscuridad.
   7. Después de la tinción, agregue 1 mL de 1x PBS a los tubos y centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obtener el pellet de celda.
   8. Deseche tres cuartas partes del sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en el contenido sobrenadante restante mediante una trituración suave.
   9. Proceda al análisis FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: El análisis qRT-PCR de la expresión génica implica la evaluación del colágeno tipo I (COL1A1), el colágeno tipo X (COL10A1) y el factor de transcripción relacionado con Runt (RUNX2) para la expresión hipertrófica, y SOX-9, Aggrecan (ACAN) y colágeno tipo II (COL2A1) para la condrogénesis.

1. Extraiga el ARN de los grupos celulares utilizando kits disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante.
2. Después de la extracción, evalúe la relación A₂₆₀/A₂₈₀ y la concentración de ARN.
3. Utilice 280 ng del ARN extraído para construir ADN complementario (ADNc).
4. Inicie la qRT-PCR con Sybr Green, cada reacción contiene una concentración final de 7 ng de ADNc en un termociclador.
5. Normalice la expresión relativa del ARNm de cada gen al gen de mantenimiento de referencia GAPDH (ΔCt).
6. Calcular la expresión relativa de cada gen utilizando la técnica ^2-ΔΔCt comparando el valor de ΔCt de cada gen individual con el de los FAA-CPs (ΔΔCt)³⁷.

8. Diferenciación multilinaje

NOTA: Los medios diferenciales disponibles en el mercado inducen la diferenciación trilineal en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos.

1. Para la diferenciación adipogénica, se deben utilizar células de siembra a una densidad de carga de 1000 células/^cm2 en una placa de cultivo celular y cultivar utilizando un medio de diferenciación adipogénico (cambio medio, una vez cada 3 días) hasta una subconfluencia del 80% durante 3 semanas.
2. Para la diferenciación osteogénica y condrogénica, siga el sistema de cultivo de pellets de 28 días³⁸.
3. Centrifugar 0,5 x 10⁶ celdas a 400 x g durante 12 min a 37 °C para formar gránulos e iniciar la diferenciación utilizando un medio de diferenciación osteogénico y condrogénico.
4. Fije, incruste y seccione los gránulos para una tinción confirmatoria (paso 9).

9. Tinción confirmatoria

1. En el caso de células de linaje adipogénico, fije las células con formol tamponado, lave y tiña con Oil Red O (0,5%). Tiña también los controles (cultivados en un medio DMEM estándar con 10% de FBS).
2. Observar bajo un microscopio y adquirir las imágenes.
3. Para las células de linaje osteogénico diferenciado, teñir con rojo de alizarina (2%).
   NOTA: Se aplican múltiples protocolos de tinción confirmatoria para las células diferenciadas condrogénicas.
4. Tinción con azul alcián: Teñir las células fijas con azul alcián durante 5 min y contrateñir con rojo neutro.
5. Para evaluar el contenido de glicosaminoglicanos (GAG), realice la tinción de safranina O: tiñir los portaobjetos con hematoxilina de hierro de Wiegert seguido de una incubación posterior con alcohol ácido (1 %), solución verde rápida (0,05 %), ácido acético (1 %) y solución de safranina O (1 %).
6. Tinción con azul de toluidina: Tiñe los portaobjetos con azul de toluidina (0,1%) durante 5 min.
7. Tinción PicroSirius Red: Teñir los portaobjetos con Picrosirius Red (0,1%) y contratinción con colorante de hematoxilina.
   NOTA: Después de la tinción, deshidrate los portaobjetos con alcohol graduado y aclare con xileno. Monte portaobjetos con un montante de dibutilftalato de poliestireno xileno (DPX), obsérvelos bajo un microscopio y adquiera imágenes.
8. Para la tinción inmunohistoquímica (colágeno tipo II) del pellet diferenciado condrogénico, se someten las secciones de pellets a la recuperación enzimática del antígeno utilizando las enzimas pronasa (1 mg/mL) e hialuronidasa (2,5 mg/mL).
9. Incubar las secciones con el anticuerpo anticolágeno monoclonal primario de ratón tipo II, seguido de un anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con HRP secundario a escala 1:250.
10. Teñir los portaobjetos con cromógeno 3,3′-diaminobenzidina (DAB) y contrateñirlos con hematoxilina.
11. Observe bajo un microscopio y capture imágenes.

10. Determinación del contenido de GAG/ADN

1. Digiera los gránulos diferenciados condrogénicos con una solución de papaína-cisteína a 65 °C durante 16 h.
2. Estime la concentración de ADN utilizando el reactivo Picrogreen³⁸ y adquiera la intensidad de fluorescencia en longitudes de onda: excitación: 480 nm, emisión: 520 nm utilizando un lector de placas ELISA.
3. Evalúe el contenido total de GAG utilizando el método del colorante azul de dimetilo^{metileno 38}.
4. Mida la densidad óptica a 525 nm utilizando un lector de placas ELISA.
5. Normalice los valores de GAG a los valores de ADN y calcule la relación total de GAG/ADN.

Resultados

A partir de 86,9 mg de cortes de cartílago, se observó un rendimiento de células condrocitos de 1,72 x 10⁵ células. Al cargarse, los condrocitos se adhieren rápidamente, presentando un aspecto inicial de adoquín redondeado y transformándose en un estado fibroblástico al expandirse más (Figura 1 A,B). La siembra de estos condrocitos en placas de fibronectina generalmente da como resultado una adhesión del 2%, con cada cé...

Discusión

La regeneración potencial del cartílago articular, que contiene tejido hialino, puede lograrse mediante la optimización de sus dos tipos de células nativas: condrocitos y condroprogenitores. Si bien la investigación exhaustiva sobre los condrocitos ha proporcionado información valiosa sobre su papel en la reparación del cartílago, las preguntas sobre la naturaleza del tejido regenerado han impulsado esfuerzos para mejorar su fenotipo y explorar terapias alternativas

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072