Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של כונדרוציטים, כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מסחוס מפרקי אנושי. הוא מכסה עיכול אנזימטי, הידבקות פיברונקטין ומבחנים מבוססי נדידה לבידוד ואפיון תאים אלה.

Abstract

תאי כונדרופרוגניטור (CPCs), שזוהו לאחרונה כתת-אוכלוסייה מובחנת, מציגים הבטחה בשל תכונותיהם המזנכימליות, כונדרוגנזה מוגברת ותכונות היפרטרופיות מוגבלות. העשרת האבות מושגת באמצעות הידבקות דיפרנציאלית של פיברונקטין ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה, כאשר כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs) וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מדגימים פוטנציאל מעולה בהשוואה לכונדרוציטים. מאמר זה מתעמק בפרטים של בידוד תאים שמקורם בסחוס תושבים, כלומר כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שתובנות חשובות ממחקר כונדרוציטים תורמות להבנתנו את תיקון הסחוס, מאמצים מתמשכים מופנים לשימוש בכונדרופרוגניטורים ולחקר הפוטנציאל שלהם כגישה טיפולית אלטרנטיבית. בנוסף, מאמר מתודולוגיה זה מספק פרוטוקול מפורט צעד-אחר-צעד לבידוד שלושה סוגי תאים ספציפיים מסחוס: כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs. על ידי ביצוע נהלים סטנדרטיים, פרוטוקול זה מקל על מיצוי מוצלח של תת-סוגי תאים אלה. המאמר מבוסס על מחקר מקיף, ומתמקד בטכניקות המורכבות המשמשות לבידוד תת-הקבוצות השונות ובתנאי התרבות האופטימליים הנדרשים להרחבה ותחזוקה של התרבויות שלהם. המתודולוגיה כוללת בידוד אנזימטי של כונדרוציטים שמקורם בסחוס מפרקי אנושי, הידבקות פיברונקטין דיפרנציאלית לאחר עיכול אנזימטי רציף, ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה להשגת תאים תושבי סחוס.

Introduction

הופעתו של טיפול רגנרטיבי מבוסס תאים מייצגת גישה משמעותית לטיפול במחלות הקשורות לסחוס, כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA) ומומים כונדרליים1. הפרעות אלו, המאופיינות בפירוק או פגיעה של סחוס במפרקים, מהוות אתגרים משמעותיים במהלך הטיפול. התיקון העצמי של הסחוס המפרקי מדווח כמוגבל בשל הארכיטקטורה העצבית, האווסקולריות והפעילות המיטוטית הנמוכה שלו2.

התאים הנפוצים ביותר להתחדשות רקמת סחוס הם תאי גזע מזנכימליים (MSCs) וכונדרוציטים3. עם זאת, מספר מחקרים דיווחו על מגבלות בשימוש בתאים אלה להתחדשות4. מגבלות אלו כוללות התמיינות סופית של כונדרוציטים במהלך התרחבות מבחנה מורחבת כדי להשיג את ספירת התאים הנדרשת ואת הנטייה ההיפרטרופית של MSCs. גורמים אלה יכולים לגרום להיווצרות רקמת תיקון עם שילוב לא אופטימלי של סחוס פיברובי והיאלין 5,6,7,8.

הגילוי של תאי כונדרופרוגניטור (CPCs) נבע מהחיפוש אחר תאים חלופיים בסחוס מפרקי9. הם עוררו עניין עצום בשל הדמיון שלהם ל-MSCs והפוטנציאל הכונדרוגני המעולה שלהם, כל זאת תוך הפגנת היפרטרופיה מופחתת - שילוב הכרחי המבוקש10,11. בניגוד לכונדרוציטים, אוכלוסיות אבות אלה דווחו כמציגות פעילות שכפול וטלומראז מוגברת, כמו גם ביטוי מוגבר של חלבון הומולוג 1 (NOTCH-1) וגורם שעתוק SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. ישנן שתי שיטות סטנדרטיות לבידוד CPCs המדווחות הן מסחוס והן ממניסקוס, כולל אחת המבוססת על ביטוי קולטן האינטגרין שלהם (CD49e/CD29), המבודד באמצעות בדיקת הידבקות פיברונקטין - Chondroprogenitors שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), והשנייה מבוססת על פוטנציאל הנדידה המוגבר שלהם מצמחי סחוס - כונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs)11,13,16,17,18,19. מחקרים רבים במבחנה מדגימים את העליונות הכונדרוגנית וההיפרטרופיה המופחתת של FAA-CPCs ו-MCPs בהשוואה לכונדרוציטים ומח עצם (BM)-MSCs 20,21,22,23.

מחקרים אחרונים במבחנה המשווים FAA-CPCs ל-MCPs הדגימו את יכולת התחדשות הסחוס המשופרת של אוכלוסיית האב האחרונה בתנאי חמצן רגילים24. התוצאות האופטימיות הללו במבחנה מציגות התחדשות דמוית היאלין, ומעודדות ניסויים נוספים in vivo. עם זאת, שתי האוכלוסיות של CPCs דווחו כמתקנים ומחדשים ביעילות סחוס בדלקת מפרקים ניוונית והפרעות אוסטאוכונדרליות אחרות במודלים של בעלי חיים 25,26,27,28,29.

המעבדה שלנו תרמה באופן פעיל לסטנדרטיזציה של טכניקות בידוד CPC והשוואת המאפיינים הפנוטיפיים שלהן עם כונדרוציטים ו-MSCs. מאמר זה יספק פרוטוקול מפורט המסביר את השלבים הכרוכים בבידוד ותרבית תאים תושבים בסחוס, כלומר כונדרוציטים, FAA-CPCs ו-MCPs.

Protocol

הפרוטוקול אושר ועומד בתקנות ובהנחיות המתאימות של ועדת הביקורת המוסדית (ועדת מחקר ואתיקה). לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, מפרקים טיביו-פמורליים אנושיים נרכשים מחולי דלקת מפרקים ניוונית (OA) (ציון רדיולוגי של קלגרן-לורנס 4)30 הזקוקים להחלפת ברך מלאה כחלק מהטיפול שלהם. המפרקים של חולים עם סימנים כלשהם של גידולים, זיהומים או דלקת מפרקים דלקתית (כגון דלקת מפרקים שגרונית או גאוט) לא נכללו במחקר. מובטח שכל ההליכים מבוצעים בתנאים סטריליים, תוך הקפדה על פרוטוקולי מעבדה סטנדרטיים לאורך כל תהליך הניסוי.

1. השגת מפרקים טיביו-פמורליים

  1. השג מפרקי ברכיים (מפרקים טיביו-פמורליים) מתורמים אנושיים הזקוקים לקטיעה מעל הברך כחלק מהטיפול או מאלה עם דלקת מפרקים ניווניתדרגה 4 30 (ראיות רדיולוגיות המראות הפחתה ניכרת של חלל המפרק עם טרשת כונדרלית) העוברים החלפת ברך מלאה.
    הערה: ודא שהסכמה מדעת מתקבלת מהמטופלים בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. להבטיח עמידה בכללי ועדת האתיקה וועדת הביקורת המוסדית.
  2. אל תכלול מפרקים המראים תסמינים של זיהום או דלקת.

2. עיבוד מפרקים שנקטפו

  1. הנח את המפרקים הטיביו-פמורליים שנקטפו בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS) בתנאים סטריליים.
  2. הכן אזור סטרילי מתחת למכסה המנוע על ידי הנחת כרית תחתונה סטרילית. העבירו את המפרקים שנקטפו אל המשטח התחתון.
  3. ייצב את המפרקים הטיביו-פמורליים החתוכים על ידי החזקת העצם התת-כונדרלית כשהסחוס פונה כלפי מעלה.
  4. בעזרת להב אזמל (מס' 22), קצור שבבי סחוס בצורת מלבני מהאזורים שאינם נושאי משקל לחולי OA תוך 1-2 שעות מקבלת המפרק.
  5. קצרו את קטעי הסחוס בגודל 8 מ"מ על 10 מ"מ מהשכבה השטחית לשכבה העמוקה יותר.
  6. שוטפים את פרוסות הסחוס בתמיסת PBS 1x ומניחים אותן בצלחת פטרי המכילה 1-2 מ"ל של מדיום DMEM רגיל.
  7. טוחנים את פרוסות הסחוס יפה לגודל של פחות מ -1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ בעזרת להב אזמל (מס '22).
    הערה: ודא שפרוסות הסחוס או הסחוס הטחון לא יתייבשו; מקם אותם במדיום תרבותי או PBS נטול סרום.

3. בידוד כונדרוציטים

  1. מניחים את הסחוס הטחון בבקבוק T-25 זקוף המכיל 10 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) עם 0.15% קולגנאז מסוג II לעיכול אנזימטי. השאירו את הבקבוק ללא הפרעה למשך 12-14 שעות בחממת CO2 , תוך הבטחת תנאי תרבות סטנדרטיים31.
    הערה: יש להשתמש במדיום DMEM-F12 רגיל ללא עקבות של סרום, מכיוון שסרום משבית את הפעולה האנזימטית.
  2. לאחר עיכול לילה, העבירו את המדיום המכיל את התאים המשוחררים לצינור צנטריפוגה טרי וסטרילי המכיל נפח שווה של DMEM-F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS), באמצעות מסננת תאים כדי להפריד את התאים מהפסולת. התאים המשוחררים הם ה"כונדרוציטים".
  3. צנטריפוגה את התאים המסוננים במהירות של 1200 x g למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הרכיבו מחדש את הגלולה שהתקבלה ב-1 מ"ל של מדיום וספרו את התאים ברי הקיימא ששוחררו באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן.
  5. טען את הכונדרוציטים בבקבוק T-25 בריכוז של 10,000 תאים/סמ"ר והרחיב למספר המעבר הנדרש באמצעות DMEM-F12 המכיל 10% FBS. רכיבים נוספים במדיום כוללים חומצה אסקורבית (62 מיקרוגרם/מ"ל), L-גלוטמין (2.5 מ"מ/ליטר), פניצילין-סטרפטומיצין (100 יחב"ל/מ"ל) ואמפוטריצין-B (2 מיקרוגרם/מ"ל).
  6. רענן את המדיום כל 3 ימים וקצור תאים בתת-מפגש באמצעות 0.125% טריפסין המכיל חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA).

4. בידוד של כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs)

  1. 12 שעות לפני שחרור הכונדרוציטים, הכינו 10 מ"ל של 1x PBS המכילים 1 מ"מ של MgCl2 (10 מיקרוליטר) ו-1 מ"מ של CaCl2 (10 מיקרוליטר), ו-100 מיקרוליטר של פיברונקטין (10 מיקרוליטר / מ"ל)32.
  2. מצפים את מספר הבארות הנדרש של צלחת 6 בארות (1.5 מ"ל/9.3 ס"מ2) באמצעות התמיסה המוכנה.
  3. אוטמים היטב את הצלחת ומכניסים למקרר למשך הלילה ל-4 מעלות צלזיוס.
  4. בנוסף, השג שבבי סחוס באופן דומה לזה המוסבר לבידוד כונדרוציטים (שלבים 2.1-2.5).
  5. חשפו את שבבי הסחוס לעיכול אנזימטי רציף למשך הלילה (0.2% פרונאז למשך 3 שעות; ואחריו 0.04% קולגנאז מסוג II למשך 12 שעות) באמבט מים רועדים שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להשגת כונדרוציטים בודדים.
  6. למחרת, הוציאו מהמקרר את צלחת 6 הבארות המצופה פיברונקטין והוציאו עודפי פיברונקטין.
    הערה: יש להסיר עודפי פיברונקטין לאט ובעדינות מבלי להפריע לציפוי בתחתית הבאר. נוכחותם של MgCl2 (10 מיקרוליטר) ו-1 מ"מ של CaCl2 היא חיונית כדי להבטיח את הצמדת התאים.
  7. הוסף 2-3 מ"ל של מדיום DMEM-F12 רגיל לבארות המצופות.
  8. זרעו את הכונדרוציטים המשוחררים על הבארות המצופות בצפיפות העמסה של 4000 תאים לבאר והשאירו את הצלחת ללא הפרעה לתקופה של 20 דקות.
  9. לאחר הדגירה, הסר את עודפי המדיה והתאים שאינם נדבקים. הוסף 2-3 מ"ל של מצע גידול סטנדרטי המשמש לכונדרוציטים (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. שמור על התאים הדבקים בתנאי תרבית סטנדרטיים למשך 10-12 ימים כדי להשיג שיבוטים של CPC (מושבות של >32 תאים).
  11. בודד באמצעות 0.125% טריפסין-EDTA למשך 180 שניות, צלח מחדש את השיבוטים ביחס של 1 שיבוט / 5 סמ"ר, והרחיב את ה-CPs הפוליקלונליים המועשרים למפגש הנדרש. תאים אלה המתקבלים מכונים "FAA-CPCs".
  12. תרבית נוספת של התאים במדיום DMEM-F12 + 10% FBS + גורם גדילה טרנספורמטיבי בטא 2 (TGFβ2: 1 ננוגרם/מ"ל) + גורם גדילה פיברובלסטים (FGF2: 5 ננוגרם/מ"ל).
    הערה: הדגירה של תאים על צלחות מצופות פיברונקטין לא תעלה על 20 דקות, מכיוון שגם כונדרוציטים עשויים להתחיל להידבק. במהלך תקופת ההדבקה של 20 דקות, המדיום חייב להיות נטול סרום. לאחר מכן, יש לגדל את התאים הנצמדים ליצירת שיבוטים במדיום המכיל בנוסף FBS. יש לבודד את השיבוטים רק לאחר שווידאתם שלכל שיבוט יש יותר מ-32 תאים; זאת כדי להימנע ממגברי מעבר. הרחבה נוספת של השיבוטים לאחר טריפסיניזציה צריכה לכלול את גורמי הגדילה הנוספים שהוזכרו. צפיפות העמסה של 4000 כונדרוציטים / 9.3 ס"מרבוע של צלחת מצופה פיברונקטין, לאחר דגירה של 20 דקות ואחריה שטיפה, מביאה להידבקות של 80-100 תאים בסך הכל. מתוכם, כ-20 שיבוטים יתקדמו לגדול ולהגיע להכפלת אוכלוסייה של 5 תוך 10-12 ימים.

5. בידוד של כונדרופרוגניטורים נודדים

  1. גלחו את צמחי הסחוס (10 מ"מ x 5 מ"מ x 1 מ"מ) מהמפרק המפרקי שנקטף והניחו אותם בצלחת סטרילית של 6 בארות המכילה מדיה DMEM-F12 עם 10% FBS ו-10 מ"מ גלוטמקס (2-3 צמחים לבאר)33.
  2. השאירו את הצלחת עם האקספלנטים ללא הפרעה למשך 48 שעות בחממת CO2 שנשמרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר יומיים, העבירו את הצמחים לצינור צנטריפוגה המכיל 10 מ"ל של תמיסת קולגנאז 0.1% לעיכול אנזימטי. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    הערה: יש לשטוף את האקספלנטים עם 1x PBS לפני עיכול אנזימטי, מכיוון שעקבות של סרום יכולים להשבית את פעולת האנזים. לשטיפה, טובלים את הצמחים בכלי פטרי מלא ב 2-3 מ"ל של 1x PBS; זאת גם כדי להבטיח אי זיהום עם כונדרוציטים משוחררים. יש לשמור על הטיפול בצמחים למינימום, וזאת כדי להימנע מלחץ על האבות שהחלו לנדוד.
  4. לאחר העיכול, שטפו את האקספלנטים עם 1x PBS והניחו אותם בחזרה באותן בארות של הצלחת המכילה מדיה DMEM-F12 טרייה עם 10% FBS ו-10 מ"מ של מדיום Glutamax.
  5. שמור על הצלחת בתנאי תרבות סטנדרטיים בחממה. שימו לב לנדידת כונדרופרוגניטורים בימים שלאחר מכן.
  6. בהגעה לתת-מפגש, קצרו את ה-MCPs באמצעות 0.125% של טריפסין המכיל EDTA.
  7. הרחב את ה-MCPs באמצעות מדיום ההרחבה הסטנדרטי, הכולל את DMEM-F12, המכיל 10% FBS ו-10 מ"מ של Glutamax.

6. אפיון פנוטיפי של כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs

  1. ניתוח ציטומטרי זרימה (FACS)
    הערה: השלבים הבאים מתבצעים לניתוח FACS של קבוצות התאים שנקטפו.
    1. טריפסין את התאים לפי פרוטוקול סטנדרטי באמצעות 0.125% טריפסין וצנטריפוגה בטמפרטורה של 1200 x גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר כדי להשיג את גלולת התא.
    2. השליכו את ה-supernatant, שטפו והשעו מחדש את הגלולה עם 1x PBS.
    3. העבר את המתלה לצינורות מסומנים עבור FACS.
    4. חלקו את התרחיף באופן שווה לשני צינורות: צינור 'לא מוכתם' המשמש כבקרה (תרחיף תאים ללא נוגדן) וצינורות 'מוכתמים' המשמשים כבדיקות (תרחיף תאים עם נוגדן).
    5. עקוב אחר גיליון הנתונים הטכניים של נוגדנים בודדים/סמני אשכול התמיינות (CD) לצביעה. נוגדנים להשוואה כוללים CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (סמני ביטוי חיובי); CD34-PE, CD45-FITC ו-CD14-FITC (סמני ביטוי שליליים)34,35; CD166-BB515 ו-CD146-PE (סמנים כונדרוגניים פוטנציאליים)36,37.
      הערה: סמני תקליטורים רגישים לאור. כדי להבטיח שהשלבים נעשים בחושך.
    6. דגרו על תרחיף התאים עם נוגדן למשך 30 דקות בחושך.
    7. לאחר הצביעה, הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לצינורות ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 1200 x גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר כדי להשיג את גלולת התא.
    8. השליכו שלושה רבעים מהסופרנטנט. יש להשעות מחדש את הגלולה בתכולת העל-טבעית שנותרה על ידי טריטורציה עדינה.
    9. המשך לניתוח FACS.

7. qRT-PCR

הערה: ניתוח qRT-PCR של ביטוי גנים כולל הערכה של קולגן מסוג I (COL1A1), קולגן מסוג X (COL10A1) וגורם שעתוק הקשור ל-Runt (RUNX2) לביטוי היפרטרופי ו-SOX-9, Aggrecan (ACAN) וקולגן מסוג II (COL2A1) לכונדרוגנזה.

  1. חלץ RNA מקבוצות התאים באמצעות ערכות זמינות מסחרית לפי הוראות היצרן.
  2. לאחר המיצוי, הערך את יחס A260/A280 ואת ריכוז ה-RNA.
  3. השתמש ב-280 ננוגרם של ה-RNA המופק לבניית DNA משלים (cDNA).
  4. התחל qRT-PCR באמצעות Sybr Green, כל תגובה מכילה ריכוז סופי של 7 ננוגרם של cDNA על תרמו-סייקלר
  5. לנרמל את ביטוי ה-mRNA היחסי של כל גן לגן משק הבית הייחוס GAPDH (ΔCt).
  6. חשב את הביטוי היחסי של כל גן באמצעות טכניקת 2-ΔΔCt על ידי השוואת ערך ה-ΔCt של כל גן בודד לזה של FAA-CPs (ΔΔCt)37.

8. בידול רב שושלות

הערה: מדיה דיפרנציאלית זמינה מסחרית גורמת להתמיינות משולשת לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות.

  1. להתמיינות אדיפוגנית, תאי זרע בצפיפות העמסה של 1000 תאים/סמ "ר בצלחת תרבית תאים ותרבית באמצעות מדיום התמיינות אדיפוגני (שינוי בינוני - אחת ל-3 ימים) עד תת-מפגש של 80% למשך 3 שבועות.
  2. להתמיינות אוסטאוגנית וכונדרוגנית, עקוב אחר מערכת תרבית הגלולה ל-28 יום38.
  3. צנטריפוגה 0.5 x 106 תאים ב-400 x גרם למשך 12 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ליצירת כדורים וליזום התמיינות באמצעות מדיום התמיינות אוסטאוגני וכונדרוגני.
  4. תקן, הטמע וחתך את הכדורים לצביעה מאשרת (שלב 9).

9. מכתים מאשרים

  1. במקרה של תאי שושלת אדיפוגניים, יש לתקן את התאים בפורמלין חוצץ, לשטוף ולהכתים עם שמן אדום O (0.5%). מכתים גם את הפקדים (מתורבתים על מדיום DMEM סטנדרטי עם 10% FBS).
  2. התבונן במיקרוסקופ ורכוש את התמונות.
  3. עבור תאי השושלת האוסטיאוגניים המובחנים, יש לצבוע באדום אליזרין (2%).
    הערה: פרוטוקולי צביעה מאשרים מרובים חלים על התאים הממוינים הכונדרוגניים.
  4. צביעה בכחול אלציאן: צבעו את התאים הקבועים בכחול אלציאן למשך 5 דקות וצביעו באדום ניטרלי.
  5. להערכת תכולת גליקוזאמינוגליקן (GAG), בצע צביעת ספרנין O: צבע את השקופיות עם המטוקסילין ברזל של Wiegert ואחריו דגירה לאחר מכן עם אלכוהול חומצי (1%), תמיסה ירוקה מהירה (0.05%), חומצה אצטית (1%) ותמיסת Safranin O (1%).
  6. צביעת טולואידין כחול: מכתים את השקופיות בכחול טולואידין (0.1%) למשך 5 דקות.
  7. צביעת PicroSirius אדום: מכתימים את השקופיות באדום פיקרוסיריוס (0.1%) וצביעה נגדית באמצעות צבע המטוקסילין.
    הערה: לאחר הצביעה, יש לייבש את השקופיות באמצעות אלכוהול מדורג ולנקות באמצעות קסילן. הרכיבו מגלשות באמצעות תושבת Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX), התבוננו בהן תחת מיקרוסקופ ורכשו תמונות.
  8. עבור צביעה אימונוהיסטוכימית (קולגן מסוג II) של הגלולה המובחנת הכונדרוגנית, הכניסו את חלקי הגלולה לאחזור אנטיגן אנזימטי באמצעות האנזימים פרונאז (1 מ"ג/מ"ל) והיאלורונידאז (2.5 מ"ג/מ"ל).
  9. דגרו את החלקים עם נוגדן אנטי-קולגן חד-שבטי ראשוני של עכבר מסוג II, ואחריו נוגדן אנטי-עכברי עיזים 1:250 משני עם תווית HRP.
  10. צבעו את השקופיות בכרומוגן 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) וצבעו אותן באמצעות המטוקסילין.
  11. התבונן במיקרוסקופ וצלם תמונות.

10. קביעת תכולת GAG/DNA

  1. עכל את הכדורים המובחנים הכונדרוגניים באמצעות תמיסת פפאין-ציסטאין בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  2. העריכו את ריכוז ה-DNA באמצעות מגיב Picrogreen38 ורכשו את עוצמת הקרינה באורכי גל - עירור: 480 ננומטר, פליטה: 520 ננומטר באמצעות קורא צלחות ELISA.
  3. הערך את תכולת ה-GAG הכוללת באמצעות שיטת הצבע הכחול דימתיל מתילן38.
  4. מדוד צפיפות אופטית ב-525 ננומטר באמצעות קורא לוחות ELISA.
  5. נרמל את ערכי ה-GAG לערכי ה-DNA וחשב את יחס ה-GAG/DNA הכולל.

תוצאות

מתוך 86.9 מ"ג של פרוסות סחוס, נצפתה תפוקת תאי כונדרוציטים של 1.72 x 105 תאים. עם הטעינה, כונדרוציטים נדבקים מיד, מציגים מראה ראשוני מעוגל של אבן מרוצפת והופכים למצב פיברובלסטי עם התרחבות נוספת (איור 1 A,B). זריעת כונדרוציטים אלה על צלחות פיברונקטין מ...

Discussion

ההתחדשות הפוטנציאלית של הסחוס המפרקי, המכיל רקמת היאלין, עשויה להיות מושגת באמצעות אופטימיזציה של שני סוגי התאים המקוריים שלו: כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שמחקר מקיף על כונדרוציטים סיפק תובנות חשובות לגבי תפקידם בתיקון סחוס, שאלות לגבי אופי הרקמה המתחדשת הני?...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לגב' בהוויני קרישנאן ולגב' מרין מרי זכריה על תרומתן האינטלקטואלית ולמרכז לחקר תאי גזע (יחידה של inStem בנגלור), המחלקה לפיזיולוגיה, המכללה הרפואית הנוצרית, ולורה, על תמיכתם בתשתיות. הפרויקטים המתמשכים נתמכים על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR32777/MED/31/415/2019), ממשלת הודו, מועצת המחקר למדע והנדסה (CRG/2022/004277), ממשלת הודו ומענקי מחקר נוזלים, המכללה הרפואית הנוצרית, ולור.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

References

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163 (2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3, (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203 (2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39 (2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246 (2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421 (2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462 (2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614 (2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966 (2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11 (2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685 (2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104 (2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052 (2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93 (2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536 (2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588 (2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66 (2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685 (2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106 (2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119 (2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713 (2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved