تصور استجابة تلف الحمض النووي في خلايا بركنجي باستخدام الثقافات العضوية المخيخية

Summary

خلايا بركنجي المخيخية (PCs) حساسة بشكل خاص لأوجه القصور في استجابة تلف الحمض النووي. يتم تقديم بروتوكول للتقييم البصري لديناميكيات استجابة الكمبيوتر الشخصي لتلف الحمض النووي ، والذي يتضمن تلطيخ سلاسل البولي (ADP-ribose) المرتبطة بالبروتين داخل الثقافات العضوية المخيخية.

Abstract

تظهر خلايا بركنجي المخيخية (PCs) تفاعلا فريدا بين معدلات الأيض العالية ، وبنية الكروماتين المحددة ، ونشاط النسخ المكثف ، مما يجعلها عرضة بشكل خاص لتلف الحمض النووي. هذا يتطلب استجابة فعالة لتلف الحمض النووي (DDR) لمنع تنكس المخيخ ، وغالبا ما يبدأ بسبب خلل أو فقدان الكمبيوتر. ومن الأمثلة البارزة على ذلك متلازمة عدم استقرار الجينوم ، الرنح وتوسع الشعيرات (AT ) ، والتي تتميز بنضوب الكمبيوتر التدريجي وتدهور المخيخ. يعد التحقيق في آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في أجهزة الكمبيوتر أمرا حيويا لتوضيح المسارات المؤدية إلى انحطاطها في مثل هذه الاضطرابات. ومع ذلك ، فإن تعقيد عزل وزراعة أجهزة الكمبيوتر في المختبر قد أعاق منذ فترة طويلة جهود البحث. تقدم مزارع النمط العضوي المخيخي الفئران (الشريحة) بديلا عمليا ، حيث تحاكي عن كثب بيئة الأنسجة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن هذا النموذج مقيد بمؤشرات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج القابلة للتصوير المجهري. لقد قمنا بتحسين بروتوكول ثقافة النمط العضوي ، مما يدل على أن التصوير الفلوري لسلاسل البولي (ADP-ribose) (PAR) المرتبطة بالبروتين ، وهو مؤشر DDR سريع ومبكر ، يكشف بشكل فعال عن ديناميكيات DDR في أجهزة الكمبيوتر داخل هذه الثقافات ، استجابة للإجهاد الجيني.

Introduction

تتعرض سلامة الحمض النووي الخلوي للتهديد باستمرار من العوامل الضارة بالحمض النووي ، والتي يغلب عليها المنتجات الثانوية الأيضية مثل أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تسبب عشرات الآلاف من آفات الحمض النووي لكل خلية يوميا¹. يعد الحفاظ المستمر على استقرار الجينوم أمرا ضروريا للتوازن الخلوي^2،3. حجر الزاوية في هذه الصيانة هو استجابة تلف الحمض النووي (DDR) - وهي شبكة إشارات معقدة ذات طبقات تبدأ مسارات محددة لإصلاح الحمض النووي مع ضبط العديد من العمليات الخلوية الأخرى^{بعناية 4،5}. يتجلى العجز في نزع السلاح ....

Protocol

انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المواد والمعدات والأجسام المضادة. تم استخدام الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجنة الأخلاقيات في جامعة تل أبيب بعد الموافقة. يتم تنفيذ الإجراء على صغار الفئران البالغة من العمر 10 أيام ، بغض النظر عن جنسهم. إذا لزم الأمر ، يتم إجراء التنميط الجيني في اليوم السابق باستخدام خزعة الذيل والطرق القياسية. المحاليل معقمة ومخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك ؛ انظر الجدول 1.

1. تحضير الثقافات

ملاحظة: قم بإجراء الإجراء في بيئة معقمة وقم بتطهير سطح العمل مسبقا باستخدا....

النتائج

يوضح الشكل 1 المظهر العام لثقافات النمط العضوي المخيخي. يظهر الصف العلوي في الشكل 1 أ أوراق المخيخ ، والتي يتم الحفاظ عليها في الثقافة ، بينما يظهر الصف السفلي أجهزة الكمبيوتر الملطخة ب Calbindin D-28k (أخضر) والنوى العصبية الملطخة ب NeuN (أحمر). في

Discussion

تعليقات عامة
تتمثل الميزة الرئيسية لنظام الثقافة العضوية في أنه يسهل الدراسات باستخدام أنسجة القشرة المخيخية ، مما يحافظ على تنظيمه الهيكلي لعدة أسابيع في إعداد طبق الثقافة. هذا النظام مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية متعمقة لخلايا بركنجي (PCs) ، بما في ذلك الفح.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature