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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) sono particolarmente sensibili alle carenze nella risposta al danno del DNA. Viene presentato un protocollo per la valutazione visiva della dinamica della risposta del PC al danno al DNA, che prevede la colorazione di catene poli(ADP-ribosio) legate alle proteine all'interno di colture organotipiche cerebellari.

Abstract

Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) mostrano un'interazione unica di alti tassi metabolici, architettura specifica della cromatina e ampia attività trascrizionale, che le rendono particolarmente vulnerabili ai danni al DNA. Ciò richiede un'efficiente risposta al danno del DNA (DDR) per prevenire la degenerazione cerebellare, spesso avviata da disfunzione o perdita di PC. Un esempio notevole è la sindrome da instabilità del genoma, atassia-teleangectasia (A-T), caratterizzata da progressiva deplezione di PC e deterioramento cerebellare. Studiare i meccanismi DDR nei PC è vitale per chiarire i percorsi che portano alla loro degenerazione in tali disturbi. Tuttavia, la complessità dell'isolamento e della coltivazione dei PC in vitro ha a lungo ostacolato gli sforzi della ricerca. Le colture organotipiche cerebellari murine (fette) offrono un'alternativa fattibile, che imita fedelmente l'ambiente tissutale in vivo . Tuttavia, questo modello è limitato a indicatori DDR suscettibili di imaging microscopico. Abbiamo perfezionato il protocollo di coltura organotipica, dimostrando che l'imaging fluorescente delle catene di poli(ADP-ribosio) (PAR) legate alle proteine, un indicatore DDR rapido e precoce, rivela efficacemente le dinamiche DDR nei PC all'interno di queste colture, in risposta allo stress genotossico.

Introduzione

L'integrità del DNA cellulare è costantemente minacciata da agenti che danneggiano il DNA, prevalentemente sottoprodotti metabolici come le specie reattive dell'ossigeno, che infliggono decine di migliaia di lesioni al DNA per cellula al giorno. Il mantenimento persistente della stabilità del genoma è essenziale per l'omeostasi cellulare 2,3. La pietra angolare di questo mantenimento è la risposta al danno del DNA (DDR), una rete di segnalazione intricata e stratificata che avvia specifici percorsi di riparazione del DNA regolando attentamente molti altri processi cellulari 4,5. I deficit nella DDR si manifestano comunemente come "sindromi da instabilità del genoma", caratterizzate da instabilità cromosomica, progressivo deterioramento dei tessuti, crescita o sviluppo alterati, predisposizione al cancro e maggiore sensibilità a particolari agenti dannosi per il DNA 6,7,8,9. In particolare, la neurodegenerazione, che spesso include l'atrofia cerebellare, è una caratteristica distintiva di molte sindromi da instabilità genomica 7,10,11,12.

La malattia autosomica recessiva, atassia-teleangectasia (A-T), è un esempio ben documentato di disturbo da instabilità genomica 13,14,15. Questa condizione deriva da mutazioni nulle nel gene ATM (A-T, mutato), responsabile della codifica della proteina chinasi cardine, ATM, che è nota principalmente come mobilizzatore DDR in risposta alle rotture del doppio filamento del DNA (DSB)16,17. L'A-T si manifesta come una malattia multisistemica, caratterizzata prevalentemente da progressiva degenerazione cerebellare, che porta a disabilità motorie acute, immunodeficienza, atrofia gonadica, predisposizione al cancro ed estrema sensibilità alle radiazioni ionizzanti. Le cellule in coltura di individui con A-T mostrano instabilità cromosomica e una maggiore sensibilità agli agenti genotossici, in particolare quelli che causano DSB 15,18,19. È importante sottolineare che l'ATM svolge anche un ruolo nella riparazione di altre lesioni del DNA, sottolineando la sua ampia importanza nel mantenimento della stabilità del genoma 20,21,22.

Nonostante la ricerca approfondita sui numerosi ruoli dell'ATM, il meccanismo specifico che porta alla degenerazione cerebellare nell'A-T rimane un argomento di dibattito attivo, con vari modelli proposti per chiarire questo processo 23,24,25,26,27,28,29,30. Il nostro modello28 suggerisce che la degenerazione cerebellare nei pazienti con A-T inizia con la disfunzione e l'eventuale perdita di cellule di Purkinje (PC). Considerando il ruolo critico dell'ATM nel preservare la stabilità del genoma di fronte a continui danni al DNA, i PC sono particolarmente vulnerabili all'assenza di ATM. Attribuiamo questa vulnerabilità alla combinazione della loro elevata attività metabolica, della caratteristica struttura della cromatina e dell'estesa attività trascrizionale. In definitiva, si suggerisce che la perdita della funzione PC, e quindi la loro degenerazione, sia dovuta all'inattivazione stocastica e funzionale dei geni, una conseguenza della produzione di trascritti difettosi28.

Lo studio della biologia del PC in laboratorio è ostacolato dalle sfide nella coltivazione di PC isolati, poiché queste cellule dipendono fortemente dal loro ambiente naturale e dalle cellule vicine per la sopravvivenza e la funzione, rendendole incompatibili con la crescita dissociata della coltura. Ciononostante, i PC possono rimanere vitali per lunghi periodi nelle colture di fette di tessuto. Le colture organotipiche cerebellari, che sono fette di tessuto tipicamente derivate dalla cerebella dei roditori, mantengono l'organizzazione strutturale del tessuto e supportano varie manipolazioni sperimentali analoghe a quelle possibili con le cellule in coltura. Pertanto, queste colture consentono studi cerebellari in un ambiente controllato 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. In particolare, nel contesto dell'A-T, le colture organotipiche cerebellari murine si sono dimostrate strumentali nell'esplorazione della DDR nei PC con deficit di Atm 40,41,42,43. Mentre i topi carenti di ATM mostrano solo un fenotipo cerebellare sottile 44,45,46,47, presumibilmente a causa delle differenze tra la fisiologia cerebellare umana e quella del topo, l'ipotesi è che i ruoli di ATM siano in gran parte conservati in queste specie. Questa nozione è supportata dalle nostre osservazioni che la risposta carente ai DSB del DNA nei PC murini Atm-/- si allinea con quella osservata in altri tipi di cellule murine e umane con deficit di ATM/Atm 40,41,42,43.

Un limite nell'analisi delle risposte del PC a vari stimoli o stress all'interno di colture organotipiche è la necessità di fare affidamento sull'imaging microscopico per le letture. La DDR viene solitamente studiata utilizzando letture biochimiche di massa, sebbene vengano utilizzati anche comuni marcatori immunofluorescenti, come seguire le dinamiche di formazione e risoluzione dei focolai nucleari dell'istone fosforilato H2AX (γH2AX) e della proteina 53BP1, che sono considerati indicatori di DSB48,49. Una misura più ampia è l'imaging fluorescente della formazione di catene di poli(ADP-ribosio) (PAR) sulle proteine, una risposta rapida e robusta al danno precoce del DNA, in particolare alle rotture del filamento 7,50. Abbiamo modificato il protocollo di Komulainen et al.51 per la colorazione PAR in colture organotipiche cerebellari. Abbiamo osservato una pronunciata risposta PAR in nuclei considerevoli di PC. Viene presentato qui il nostro protocollo perfezionato per stabilire colture organotipiche cerebellari murine e per visualizzare la risposta PAR sotto stress genotossico.

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Protocollo

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su materiali, attrezzature e anticorpi. Le procedure per gli animali sono state impiegate secondo le linee guida etiche del Comitato Etico dell'Università di Tel Aviv dopo l'approvazione. La procedura viene eseguita su cuccioli di topo di 10 giorni, indipendentemente dal loro sesso. Se necessario, la genotipizzazione viene eseguita il giorno precedente utilizzando una biopsia della coda e metodi standard. Le soluzioni sono sterili e conservate a 4 °C, salvo diversa indicazione; vedere la Tabella 1.

1. Preparazione delle colture

NOTA: Eseguire la procedura in un ambiente sterile e disinfettare preventivamente la superficie di lavoro utilizzando etanolo al 70%.

  1. Aggiungere 1 mL di BME a ciascun pozzetto di piastre a 6 pozzetti. Utilizzando una pinza sterile, posizionare un singolo inserto di coltura cellulare in ciascun pozzetto e incubare le piastre in un incubatore a 37 °C/5% di CO2 per almeno 2 ore prima della procedura di dissezione.
  2. Allestire un'area di dissezione all'interno di una cappa biologica, contenente il tritatessuti, piastre di coltura da 30 mm, un microscopio binoculare e una fonte di luce.
  3. Immergere gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% durante tutto il processo. Utilizzare una coppetta urinaria riempita con etanolo al 70% per l'immersione e una coppetta urinaria separata con 1x PBS per lavare via l'etanolo prima dell'uso.
  4. Per ogni dissezione (cioè per ogni cervelletto), preparare due piastre di coltura da 30 mm riempite con terreno di dissezione freddo e lasciarle in ghiaccio.
  5. Spruzzare l'animale con etanolo al 70%.
  6. Usando forbici affilate, decapita rapidamente l'animale. Per esporre il cervello, fai una piccola incisione con le forbici lontano dal cervelletto. Usando una pinzetta con le estremità arrotondate, stacca delicatamente il cranio. Rimuovere il cranio in piccoli pezzi per evitare di danneggiare il tessuto cerebellare.
  7. Trasferire immediatamente il cervello in un mezzo di dissezione a freddo o rimuovere direttamente il cervelletto dall'interno del cranio. Per fare ciò, esporre il cervelletto e separare la corteccia cerebellare dal tronco encefalico scollegando le tre paia di peduncoli, utilizzando una spatola a iride ricurva fine. Per identificare i peduncoli, vista dal rostrale alla caudale: i peduncoli cerebellari superiori accoppiati collegano il mesencefalo a ciascun lato del cervelletto; i peduncoli cerebellari medi accoppiati collegano il ponte a ciascun lato del cervelletto; e i peduncoli cerebellari inferiori accoppiati si collegano al midollo su ciascun lato del cervelletto. Una volta che il cervelletto è visibile, separalo dal cervello usando la stessa spatola: fai scorrere la spatola tra il cervelletto, il collicolo superiore e il tronco encefalico.
    NOTA: Non fare uno sforzo particolare per rimuovere le meningi poiché si staccano facilmente dopo che il cervelletto è stato tagliato.
  8. Impostare il tritatutto su uno spessore della fetta di 350 μm.
  9. Prima di posizionare il cervelletto sulla base del tritatutto, rimuovere il tampone di dissezione in eccesso dal tessuto. Ciò migliorerà l'adesione del tessuto alla base del tritatutto.
  10. Posizionare il cervelletto sulla piattaforma di taglio in orientamento verticale ed eseguire il taglio parasagittale con uno spessore della fetta di 350 μm. Separare delicatamente le fette con una spatola a iride fine e metterle in un mezzo di dissezione freddo.
  11. Trasferire il tessuto affettato in un tampone di dissezione a freddo fresco. Utilizzare un puntale da 1.000 μl per guidare delicatamente le fette di tessuto nella piastra contenente il tampone di dissezione a freddo.
  12. Sotto il binocolo utilizzare due spatole a iride curve per separare accuratamente le fette di tessuto l'una dall'altra. Per le colture, utilizzare fette derivate dal verme cerebellare situato nella zona cortico-nucleare mediale dell'organo.
  13. Trasferire ogni fetta di tessuto su un inserto di coltura utilizzando una spatola larga e spostare ogni inserto che trasporta una fetta di tessuto in un pozzetto delle piastre a 6 pozzetti contenenti il terreno preriscaldato. Lasciare le piastre nell'incubatrice.
  14. Sostituire il terreno a giorni alterni: aspirare il terreno usato utilizzando una pipetta di vetro sterile e con una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 1 mL di MBE fresco con la punta della pipetta appoggiata alla parete del pozzetto. Assicurarsi di non dirigere il flusso del fluido sul tessuto.
    NOTA: La fetta di tessuto mostrerà un aspetto simile all'infiammazione per i primi 5-7 giorni in coltura e sarà pronta per gli esperimenti non appena questo fenomeno scompare e fino a 2 settimane dopo l'insediamento della coltura.

2. Trattamento con agenti dannosi per il DNA, fissazione, colorazione e imaging microscopico

  1. Aggiungere sostanze chimiche dannose per il DNA direttamente nel terreno di coltura a concentrazioni finali appropriate, per durate predeterminate. Trascorso il periodo di esposizione, rimuovere le sostanze chimiche sostituendo il terreno con un terreno di coltura fresco.
  2. Se la lettura DDR prevede la colorazione PAR, aggiungere un inibitore della poli(ADP-ribosio) glicoidrolasi (PARG) al terreno di coltura a una concentrazione finale di 10 μM, 30 minuti prima della fissazione.
    NOTA: Questo trattamento è fondamentale in quanto la modifica PAR è di breve durata e continuamente degradata da PARG.
  3. Immediatamente prima della fissazione, aspirare il terreno e sostituirlo con 1 mL di tampone fosfato 0,1 M a temperatura ambiente.
    NOTA: Il tampone freddo potrebbe causare il distacco delle fette di tessuto dall'inserto.
  4. Fissare immediatamente le fette sostituendo il tampone con una miscela di acetone/metanolo (1:1) preraffreddata (-20 °C) in modo tale che la fetta di tessuto sia immersa in questa miscela e lasciare agire per 20 minuti a -20 °C.
    NOTA: È possibile fermarsi in questa fase e procedere con l'immunocolorazione in un secondo momento. Per fare ciò, lavare i tessuti 3 volte con tampone fosfato 0,1 M preraffreddato a 4 °C, assicurandosi che il tessuto sia immerso nel tampone. I fazzoletti possono essere conservati in tampone fosfato 0,1M per un massimo di 2 settimane a 4 °C.
  5. Trasferire la fetta di tessuto in un pozzetto in una piastra a 48 pozzetti.
  6. Usa un bisturi e un tagliere per rimuovere i margini dell'inserto, tagliando intorno alla fetta di tessuto. Mettere ogni fetta in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Aggiungere 100 μl di tampone fosfato 0,1 M.
  7. Per la permeabilizzazione, aspirare il tampone, aggiungere al pozzetto 100 μl di tampone fosfato 0,1 M contenente l'1% di Triton X-100 e lasciare agire per 5 minuti a temperatura ambiente.
  8. Aspirare la soluzione e aggiungere 100 μL di soluzione bloccante (vedere Tabella 1) per pozzetto. Agitare delicatamente a temperatura ambiente per 2 ore.
  9. Durante la fase di blocco, diluire l'anticorpo primario o il reagente anti-PAR (1:800) nella soluzione bloccante.
  10. Rimuovere la soluzione bloccante (non è necessario lavarla) e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi primari in ciascun pozzetto. Applicare una leggera agitazione per 2 ore a temperatura ambiente.
  11. Diluire gli anticorpi secondari in tampone fosfato 0,1 M contenente Triton X-100 allo 0,2% (1:500) riducendo al minimo la loro esposizione alla luce.
  12. Aspirare la soluzione di anticorpi primari e lavare le fette 3 x 5 min con tampone fosfato 0,1 M contenente 0,2% di Triton X-100, a temperatura ambiente, agitando delicatamente.
  13. Sostituire la soluzione di lavaggio con 100 μl di soluzione di anticorpi secondari (diluizione 1:500). Continuare ad agitare delicatamente per 2 ore a temperatura ambiente al buio (coprire i piatti con un foglio di alluminio).
  14. Per preparare una soluzione DAPI, diluire la soluzione madre (2 mg/mL) a 1 μg/mL in 1x PBS.
  15. Venti minuti prima della fine delle 2 ore di incubazione con l'anticorpo secondario, aggiungere 20 μl della soluzione finale di DAPI a ciascun pozzetto e continuare ad agitare per 20 minuti. Aspirare il liquido e lavare con la soluzione di lavaggio per 3 x 5 minuti agitando delicatamente.
  16. Per il montaggio, posizionare il tessuto su un vetrino da microscopio con il fazzoletto rivolto verso l'alto, aggiungere il mezzo di montaggio e coprire con un vetro di copertura. Posizionare i vetrini su una superficie piana e lasciarli asciugare per una notte al buio, a temperatura ambiente (evitare di utilizzare supporti di montaggio contenenti DAPI per evitare sfocature).
  17. Conservare i vetrini a 4 °C in una scatola resistente alla luce.
  18. Acquisisci immagini microscopiche utilizzando un microscopio confocale e filtri appropriati.

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Risultati

La Figura 1 illustra l'aspetto generale delle colture organotipiche cerebellari. La riga superiore della Figura 1A mostra la foliazione cerebellare, che viene mantenuta in coltura, mentre la riga inferiore mostra i PC colorati per la Calbindina D-28k (verde) e i nuclei neuronali colorati per NeuN (rosso). Nella Figura 1B, gli astrociti nei PC (rosso) sono colorati per GFAP (verde), una proteina di t...

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Discussione

Osservazioni generali
Il principale vantaggio del sistema di coltura organotipica è che facilita gli studi utilizzando il tessuto della corteccia cerebellare, preservandone l'organizzazione strutturale per diverse settimane nella configurazione del piatto di coltura. Questo sistema è utile per condurre analisi morfologiche approfondite delle cellule di Purkinje (PC), compresi esami dettagliati delle spine dendritiche e delle caratteristiche ultrastrutturali

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione a questo studio.

Riconoscimenti

Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dalla Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation e dall'Associazione israeliana per la lotta contro la malattia A-T.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dishCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri dishCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
Adhesive microscope slidesMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Blades for chopperTED PELLAModel TC752-1 Style Razor Blades
BMEGIBCO41010-026 500ml. No L-Glut
Cell culture insertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS w/o phenol redSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS with phenol redSartorius02-015-1A
Horse serum GIBCO26050088heat inactivated
Iris forcepsCellPathGZX-0100-00A130mm blunt serrated
Iris spatulaF.S.T10092-12
L-Glutamine (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
Methanol Sigma-AldrichG5767
MicroscopeOlympus
Mounting Medium withoutGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitorTocris Bioscience, United KingdomPDD 00017273light sensitive 
Phosphate bufferBiological Indo.02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well platesCorning incorporatedCLS3516
Spare Chopping Discs TED PELLAModel 10180-01
Tissue chopperMcIlwainModel TC75210180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG 
Invitrogen		A212061:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protienMilliphoreMAB34021:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagentMilliphoreMABE10161:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)Cell signaling40841:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

Riferimenti

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