소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화

요약

소뇌 Purkinje 세포(PC)는 DNA 손상 반응의 결핍에 특히 민감합니다. DNA 손상에 대한 PC 반응의 역학을 시각적으로 평가하기 위한 프로토콜이 제시되며, 여기에는 소뇌 기관형 배양 내 단백질 결합 폴리(ADP-ribose) 사슬 염색이 포함됩니다.

초록

소뇌 Purkinje 세포(PC)는 높은 대사율, 특정 염색질 구조 및 광범위한 전사 활성의 독특한 상호 작용을 나타내므로 DNA 손상에 특히 취약합니다. 이를 위해서는 종종 PC 기능 장애 또는 손실로 시작되는 소뇌 변성을 예방하기 위해 효율적인 DNA 손상 반응(DDR)이 필요합니다. 대표적인 예가 게놈 불안정 증후군인 운동실조-모세혈관 확장증(A-T)으로, 점진적인 PC 고갈과 소뇌 악화를 특징으로 합니다. PC에서 DDR 메커니즘을 조사하는 것은 이러한 장애에서 PC의 퇴화로 이어지는 경로를 밝히는 데 매우 중요합니다. 그러나 in vitro 에서 PC를 분리하고 배양하는 복잡성은 오랫동안 연구 노력을 방해해 왔습니다. Murine cerebellar organotypic (slice) 배양은 in vivo 조직 환경을 밀접하게 모방하여 실현 가능한 대안을 제공합니다. 그러나 이 모델은 현미경 이미징에 적합한 DDR 표시기로 제한됩니다. 당사는 유기형 배양 프로토콜을 개선하여 빠르고 빠른 DDR 지표인 단백질 결합 폴리(ADP-ribose)(PAR) 사슬의 형광 이미징이 유전독성 스트레스에 대한 반응으로 이러한 배양 내 PC의 DDR 역학을 효과적으로 드러낸다는 것을 입증했습니다.

서문

세포 DNA의 무결성은 매일 세포당 수만 건의 DNA 병변을 일으키는 활성 산소종과 같은 대사 부산물과 같은 DNA 손상 물질로 인해 지속적으로 위협을 받고 있습니다¹. 게놈 안정성의 지속적인 유지는 세포 항상성 ^2,3에 필수적입니다. 이 유지 관리의 초석은 DNA 손상 반응(DDR)으로, 이는 다른 많은 세포 과정을 신중하게 조정하면서 특정 DNA 복구 경로를 시작하는 복잡하고 계층화된 신호 네트워크입니다 ^4,5. DDR의 결핍은 일반적으로 염색체 불안정성, 진행성 조직 저하, 성장 또는 발달 장애, 암에 대한 소인, 특정 DNA 손상 물질에 대한 민감성 증가를 특징으로 하는 '게놈 불안정 증후군'으로 나타납니다 6,7,8,9. 특히, 종종 소뇌 위축을 ....

프로토콜

재료, 장비 및 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 동물 시술은 텔아비브 대학 윤리 위원회의 승인 후 윤리 지침에 따라 채택되었습니다. 이 절차는 성별에 관계없이 10일 된 새끼 쥐에게 수행됩니다. 필요한 경우, 꼬리 생검 및 표준 방법을 사용하여 전날에 유전형 분석을 수행합니다. 용액은 멸균되며 달리 명시되지 않는 한 4°C에서 보관됩니다. 표 1을 참조하십시오.

1. 문화의 준비

알림: 멸균 환경에서 절차를 수행하고 70% 에탄올을 사용하여 미리 작업 표면을 소독하십시오.

1. 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 BME를 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 단일 세포 배양 삽입물을 각 웰에 넣고 절개 절차 전에 최소 2시간 동안 37°C/5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
2. 조직 초퍼, 30mm 배양 플레이트, 양안 현미경 및 광원을 포함하는 생물학적 후드 내에 해부 영역을 설정합니다.
3. 과정 전반에 걸쳐 수술 도구를 70% 에탄올에 담그십시오. 70....

토론

일반 의견
유기형 배양 시스템의 주요 장점은 소뇌 피질 조직을 사용하여 연구를 용이하게 하여 배양 접시 설정에서 몇 주 동안 구조적 조직을 보존한다는 것입니다. 이 시스템은 수상돌기 가시 및 초구조적 특징(52,53,54,55,56,57,58,59)에 대한

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature