소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화

요약

소뇌 Purkinje 세포(PC)는 DNA 손상 반응의 결핍에 특히 민감합니다. DNA 손상에 대한 PC 반응의 역학을 시각적으로 평가하기 위한 프로토콜이 제시되며, 여기에는 소뇌 기관형 배양 내 단백질 결합 폴리(ADP-ribose) 사슬 염색이 포함됩니다.

초록

소뇌 Purkinje 세포(PC)는 높은 대사율, 특정 염색질 구조 및 광범위한 전사 활성의 독특한 상호 작용을 나타내므로 DNA 손상에 특히 취약합니다. 이를 위해서는 종종 PC 기능 장애 또는 손실로 시작되는 소뇌 변성을 예방하기 위해 효율적인 DNA 손상 반응(DDR)이 필요합니다. 대표적인 예가 게놈 불안정 증후군인 운동실조-모세혈관 확장증(A-T)으로, 점진적인 PC 고갈과 소뇌 악화를 특징으로 합니다. PC에서 DDR 메커니즘을 조사하는 것은 이러한 장애에서 PC의 퇴화로 이어지는 경로를 밝히는 데 매우 중요합니다. 그러나 in vitro 에서 PC를 분리하고 배양하는 복잡성은 오랫동안 연구 노력을 방해해 왔습니다. Murine cerebellar organotypic (slice) 배양은 in vivo 조직 환경을 밀접하게 모방하여 실현 가능한 대안을 제공합니다. 그러나 이 모델은 현미경 이미징에 적합한 DDR 표시기로 제한됩니다. 당사는 유기형 배양 프로토콜을 개선하여 빠르고 빠른 DDR 지표인 단백질 결합 폴리(ADP-ribose)(PAR) 사슬의 형광 이미징이 유전독성 스트레스에 대한 반응으로 이러한 배양 내 PC의 DDR 역학을 효과적으로 드러낸다는 것을 입증했습니다.

서문

세포 DNA의 무결성은 매일 세포당 수만 건의 DNA 병변을 일으키는 활성 산소종과 같은 대사 부산물과 같은 DNA 손상 물질로 인해 지속적으로 위협을 받고 있습니다¹. 게놈 안정성의 지속적인 유지는 세포 항상성 ^2,3에 필수적입니다. 이 유지 관리의 초석은 DNA 손상 반응(DDR)으로, 이는 다른 많은 세포 과정을 신중하게 조정하면서 특정 DNA 복구 경로를 시작하는 복잡하고 계층화된 신호 네트워크입니다 ^4,5. DDR의 결핍은 일반적으로 염색체 불안정성, 진행성 조직 저하, 성장 또는 발달 장애, 암에 대한 소인, 특정 DNA 손상 물질에 대한 민감성 증가를 특징으로 하는 '게놈 불안정 증후군'으로 나타납니다 6,7,8,9. 특히, 종종 소뇌 위축을 포함하는 신경 퇴행은 많은 게놈 불안정 증후군 7,10,11,12의 뚜렷한 특징입니다.

상염색체 열성 질환인 운동실조-모세혈관확장증(a-T)은 게놈 불안정성 장애(genome instability disorder 13,14,15)의 잘 문서화된 예이다. 이 상태는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 반응으로 주로 DDR 동원제로 알려진 중추적 단백질 키나아제, ATM을 암호화하는 ATM(A-T, 돌연변이) 유전자의 null 돌연변이로 인해 발생합니다^16,17. A-T는 주로 진행성 소뇌 변성을 특징으로 하는 다계통 장애로 나타나 급성 운동 장애, 면역 결핍, 생식선 위축, 암 소인 및 전리 방사선에 대한 극도의 민감성을 유발합니다. A-T가 있는 개인의 배양 세포는 염색체 불안정성과 유전독성 물질, 특히 DSB^15,18,19를 유발하는 물질에 대한 민감도 증가를 보여줍니다. 중요한 것은, ATM은 또한 게놈 안정성^20,21,22 유지에 있는 그것의 넓은 중요성을 강조하는 다른 DNA 병변을 고치기에 있는 역할을 한다.

ATM의 수많은 역할에 대한 철저한 연구에도 불구하고, A-T에서 소뇌 퇴행을 유발하는 특정 메커니즘은 여전히 활발한 논쟁의 주제로 남아 있으며, 이 과정을 설명하기 위해 다양한 모델이 제안되고^{있습니다(23,24,25,26,27,28,29,30}). 우리의 모델²⁸은 A-T 환자의 소뇌 변성이 Purkinje 세포(PC)의 기능 장애 및 궁극적인 손실로 시작된다는 것을 시사합니다. 지속적인 DNA 손상에 직면하여 게놈 안정성을 보존하는 ATM의 중요한 역할을 고려할 때 PC는 ATM이 없는 경우에 특히 취약합니다. 우리는 이러한 취약성을 높은 대사 활동, 독특한 염색질 구조 및 광범위한 전사 활동의 조합에 기인합니다. 궁극적으로, PC 기능의 상실, 그리고 그에 따른 그들의 퇴행은 유전자의 확률적, 기능적 불활성화에 기인하며, 이는 결함이 있는 전사체를 생성하는 결과라고 제안된다²⁸.

실험실에서 PC 생물학을 연구하는 것은 고립된 PC를 배양하는 데 어려움이 있는데, 이는 이러한 세포가 생존과 기능을 위해 자연 환경과 인접 세포에 크게 의존하여 해리된 배양 성장과 양립할 수 없게 만들기 때문입니다. 그럼에도 불구하고 PC는 조직 절편 배양에서 오랜 기간 동안 생존 가능한 상태를 유지할 수 있습니다. 일반적으로 설치류 소뇌에서 유래한 조직 절편인 소뇌 기관형 배양은 조직의 구조적 조직을 유지하고 배양된 세포에서 가능한 것과 유사한 다양한 실험적 조작을 지원합니다. 그러므로, 이러한 배양은 통제된 환경 내에서 소뇌 연구를 가능하게 한다 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. 특히, A-T의 맥락에서, 쥐 소뇌 기관형 배양은 Atm-결핍 PCs^40,41,42,43에서 DDR을 탐색하는 데 중요한 것으로 입증되었습니다. Atm 결핍 마우스는 미묘한 소뇌 표현형 44,45,46,47 만 표시하는데, 이는 아마도 인간과 마우스 소뇌 생리학의 차이로 인한 것으로 추정되지만, ATM의 역할은 이들 종에 걸쳐 대체로 보존되어 있다는 가정이 있습니다. 이 개념은 Atm^-/- 쥐 PC에서 DNA DSB에 대한 결핍 반응이 다른 쥐 및 인간 ATM/Atm 결핍 세포 유형^40,41,42,43에서 관찰된 반응과 일치한다는 우리의 관찰에 의해 뒷받침됩니다.

유기체형 배양 내에서 다양한 자극 또는 스트레스에 대한 PC 반응을 분석하는 데 있어 한계는 판독을 위해 현미경 이미징에 의존해야 한다는 것입니다. DDR은 일반적으로 대량 생화학적 판독을 사용하여 연구되지만, DSB^48,49의 지표로 간주되는 인산화 히스톤 H2AX(γH2AX) 및 53BP1 단백질의 핵 병소의 형성 및 분해능 역학을 따르는 것과 같은 일반적인 면역 형광 마커도 사용됩니다. 더 광범위한 측정은 단백질에 대한 폴리(ADP-리보스)(PAR) 사슬 형성의 형광 이미징으로, 특히 가^{닥 파손에} 대한 빠르고 강력한 초기 DNA 손상 반응, ^7,50. 소뇌 기관형 배양에서 PAR 염색을 위해 Komulainen et ^al.51에 의해 프로토콜을 수정했습니다. 우리는 PC의 큰 핵에서 뚜렷한 PAR 반응을 관찰했습니다. 여기에 제시된 것은 쥐 소뇌 기관형 배양을 확립하고 유전독성 스트레스 하에서 PAR 반응을 시각화하기 위한 당사의 정제된 프로토콜입니다.

프로토콜

재료, 장비 및 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 동물 시술은 텔아비브 대학 윤리 위원회의 승인 후 윤리 지침에 따라 채택되었습니다. 이 절차는 성별에 관계없이 10일 된 새끼 쥐에게 수행됩니다. 필요한 경우, 꼬리 생검 및 표준 방법을 사용하여 전날에 유전형 분석을 수행합니다. 용액은 멸균되며 달리 명시되지 않는 한 4°C에서 보관됩니다. 표 1을 참조하십시오.

1. 문화의 준비

알림: 멸균 환경에서 절차를 수행하고 70% 에탄올을 사용하여 미리 작업 표면을 소독하십시오.

1. 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 BME를 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 단일 세포 배양 삽입물을 각 웰에 넣고 절개 절차 전에 최소 2시간 동안 37°C/5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
2. 조직 초퍼, 30mm 배양 플레이트, 양안 현미경 및 광원을 포함하는 생물학적 후드 내에 해부 영역을 설정합니다.
3. 과정 전반에 걸쳐 수술 도구를 70% 에탄올에 담그십시오. 70% 에탄올로 채워진 소변 컵을 사용하여 담그고 1x PBS가 있는 별도의 소변 컵을 사용하여 사용하기 전에 에탄올을 씻어냅니다.
4. 각 절개에 대해(즉, 각 소뇌에 대해) 저온 해부 배지로 채워진 두 개의 30mm 배양 플레이트를 준비하고 얼음 위에 둡니다.
5. 동물에게 70% 에탄올을 뿌립니다.
6. 날카로운 가위를 사용하여 신속하게 동물의 목을 베십시오. 뇌를 노출시키려면 소뇌에서 멀리 떨어진 곳을 가위로 작게 절개한다. 끝이 둥근 핀셋을 사용하여 두개골을 부드럽게 벗겨냅니다. 소뇌 조직이 손상되지 않도록 두개골을 작은 조각으로 제거합니다.
7. 즉시 뇌를 차가운 해부 매체로 옮기거나 두개골 내부의 소뇌를 직접 제거합니다. 이렇게하려면 소뇌를 노출시키고 미세한 곡선 홍채 주걱을 사용하여 세 쌍의 꽃자루를 분리하여 소뇌 피질을 뇌간에서 분리하십시오. 꽃자루를 식별하려면 로스트랄에서 꼬리까지 보십시오: 한 쌍의 상부 소뇌 꽃자루는 중뇌를 소뇌의 양쪽에 연결합니다. 한 쌍을 이루는 중간 소뇌 꽃자루는 소뇌의 양쪽에 pons를 연결합니다. 그리고 한 쌍의 하소뇌 꽃자루는 소뇌의 양쪽에 있는 수질에 연결됩니다. 소뇌가 보이면 동일한 주걱을 사용하여 대뇌에서 분리합니다: 주걱을 소뇌, 상구, 뇌간 사이로 밀어 넣습니다.
   알림: 수막은 소뇌를 절단한 후 쉽게 분리되므로 제거하려고 특별한 노력을 기울이지 마십시오.
8. 티슈 초퍼를 350μm의 슬라이스 두께로 설정합니다.
9. 초퍼의 바닥에 소뇌를 배치하기 전에 조직에서 과도한 절개 완충액을 제거합니다. 이렇게 하면 초퍼 베이스에 대한 조직의 접착력이 향상됩니다.
10. 절단 플랫폼에 소뇌를 수직 방향으로 배치하고 350μm의 슬라이스 두께에서 시상 절단을 수행합니다. 미세한 홍채 주걱을 사용하여 조각을 부드럽게 분리하고 차가운 해부 매체에 넣습니다.
11. 얇게 썬 조직을 신선한 차가운 해부 완충액으로 다시 옮깁니다. 1,000μL 팁을 사용하여 조직 조각을 냉간 해부 완충액이 들어 있는 접시에 섬세하게 넣습니다.
12. 쌍안경 아래에서 두 개의 구부러진 홍채 주걱을 사용하여 조직 조각을 서로 조심스럽게 분리합니다. 배양의 경우, 장기의 내측 피질 핵 영역에 위치한 소뇌 지렁이에서 파생된 절편을 사용하십시오.
13. 넓은 주걱을 사용하여 각 조직 절편을 배양 삽입물로 옮기고 조직 절편이 있는 각 삽입물을 예열된 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 웰로 이동합니다. 플레이트를 인큐베이터에 그대로 둡니다.
14. 이틀에 한 번씩 배지 교체: 멸균 유리 피펫을 사용하여 사용된 배지를 흡입하고 5mL 혈청학적 피펫으로 피펫의 팁이 웰 벽에 기대도록 하여 새 MBE를 1mL를 추가합니다. 매체 흐름이 조직으로 향하지 않도록 하십시오.
    참고: 조직 절편은 배양 후 처음 5-7일 동안 염증과 유사한 모습을 보이며 이 현상이 사라지는 즉시 그리고 배양 확립 후 최대 2주까지 실험할 준비가 됩니다.

2. DNA 손상제에 의한 처리, 고정, 염색 및 현미경 이미징

1. DNA를 손상시키는 화학 물질을 미리 결정된 기간 동안 적절한 최종 농도로 배양 배지에 직접 첨가합니다. 노출 기간이 지나면 배지를 새로운 배양 배지로 교체하여 화학 물질을 제거하십시오.
2. DDR 판독에 PAR 염색이 포함된 경우 고정 30분 전에 최종 농도 10μM의 배양 배지에 폴리(ADP-리보스) 당가수분해효소(PARG) 억제제를 추가합니다.
   참고: PAR 수정은 수명이 짧고 PARG에 의해 지속적으로 저하되기 때문에 이 처리가 중요합니다.
3. 고정 직전에 배지를 흡입하고 실온에서 1mL의 0.1M 인산염 완충액으로 교체합니다.
   참고: 콜드 버퍼로 인해 인서트에서 조직 절편이 분리될 수 있습니다.
4. 티슈 슬라이스가 이 혼합물에 잠기도록 버퍼를 예냉각(-20°C) 아세톤:메탄올 혼합물(1:1)로 교체하여 슬라이스를 즉시 고정하고 -20°C에서 20분 동안 그대로 둡니다.
   참고: 이 단계에서 중단하고 나중에 면역염색을 진행할 수 있습니다. 이렇게 하려면 4°C로 예열된 0.1M 인산염 완충액으로 조직을 3번 세척하여 조직이 완충액에 잠기도록 합니다. 조직은 이제 4 °C에서 최대 2주 동안 0.1M 인산염 완충액에 보관할 수 있습니다.
5. 조직 조각을 48웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
6. 메스와 도마를 사용하여 인서트의 여백을 제거하고 조직 조각 주위를 자릅니다. 각 슬라이스를 48웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 100μL의 0.1M 인산염 완충액을 추가합니다.
7. 투과화를 위해 완충액을 흡입하고 1% Triton X-100을 함유한 0.1M 인산염 완충액 100μL를 웰에 넣고 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다.
8. 용액을 흡입하고 웰당 100μL의 차단 용액( 표 1 참조)을 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
9. 차단 단계 중에는 차단 용액에 1차 항체 또는 항-PAR 시약(1:800)을 희석합니다.
10. 차단 용액을 제거하고(세척 필요 없음) 각 웰에 100μL의 1차 항체 혼합물을 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
11. 2차 항체를 0.2% Triton X-100(1:500)을 함유한 0.1M 인산염 완충액에 희석하면서 빛에 대한 노출을 최소화합니다.
12. 1차 항체 용액을 흡인하고 0.2% Triton X-100을 함유한 0.1M 인산염 완충액으로 실온에서 부드럽게 흔들어 3 x 5분 동안 슬라이스를 세척합니다.
13. 세척 용액을 100μL의 2차 항체 용액(1:500 희석)으로 교체합니다. 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다(플레이트를 알루미늄 호일로 덮음).
14. DAPI 용액을 준비하려면 원액(2mg/mL)을 1x PBS에서 1μg/mL로 희석합니다.
15. 2차 항체로 2시간 배양이 끝나기 20분 전에 최종 DAPI 용액 20μL를 각 웰에 추가하고 20분 동안 계속 흔듭니다. 액체를 흡인하고 세척 용액으로 부드럽게 흔들어 3 x 5분 동안 세척합니다.
16. 장착을 위해 조직이 위를 향하게 하여 현미경 유리 슬라이드에 조직을 놓고 장착 매체를 추가하고 커버 유리로 덮습니다. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 실온의 어두운 곳에서 밤새 건조시킵니다(흐릿함을 방지하기 위해 DAPI가 포함된 장착 매체를 사용하지 마십시오).
17. 슬라이드를 4°C에서 차광 상자에 넣어 보관하십시오.
18. 컨포칼 현미경과 적절한 필터를 사용하여 현미경 이미지를 캡처합니다.

결과

그림 1은 소뇌 기관형 배양(cerebellar organotypic cultures)의 일반적인 모습을 보여줍니다. 그림 1A 의 맨 윗줄은 배양 상태에서 유지되는 소뇌 박리를 보여주고, 맨 아래 줄은 Calbindin D-28k(녹색)에 대해 염색된 PC와 NeuN(빨간색)에 대해 염색된 신경 세포핵을 보여줍니다. 그림 1B에서 PC의 성상교세포(빨간색)는 중?...

토론

일반 의견
유기형 배양 시스템의 주요 장점은 소뇌 피질 조직을 사용하여 연구를 용이하게 하여 배양 접시 설정에서 몇 주 동안 구조적 조직을 보존한다는 것입니다. 이 시스템은 수상돌기 가시 및 초구조적 특징(52,53,54,55,56,57,58,59)에 대한

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature