Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares

Resumo

As células cerebelares de Purkinje (PCs) são particularmente sensíveis a deficiências na resposta a danos no DNA. Um protocolo é apresentado para a avaliação visual da dinâmica da resposta do PC ao dano ao DNA, que envolve a coloração de cadeias de poli(ADP-ribose) ligadas a proteínas dentro de culturas organotípicas cerebelares.

Resumo

As células cerebelares de Purkinje (PCs) exibem uma interação única de altas taxas metabólicas, arquitetura específica da cromatina e extensa atividade transcricional, tornando-as particularmente vulneráveis a danos no DNA. Isso requer uma resposta eficiente ao dano ao DNA (DDR) para prevenir a degeneração cerebelar, muitas vezes iniciada por disfunção ou perda do PC. Um exemplo notável é a síndrome de instabilidade do genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), marcada por depleção progressiva do PC e deterioração cerebelar. Investigar os mecanismos de DDR em PCs é vital para elucidar os caminhos que levam à sua degeneração em tais distúrbios. No entanto, a complexidade de isolar e cultivar PCs in vitro há muito dificulta os esforços de pesquisa. As culturas organotípicas (fatias) cerebelares murinas oferecem uma alternativa viável, imitando de perto o ambiente de tecido in vivo . No entanto, este modelo é restrito a indicadores DDR passíveis de imagens microscópicas. Refinamos o protocolo de cultura organotípica, demonstrando que a imagem fluorescente de cadeias de poli(ADP-ribose) (PAR) ligadas a proteínas, um indicador de DDR rápido e precoce, revela efetivamente a dinâmica de DDR em PCs dentro dessas culturas, em resposta ao estresse genotóxico.

Introdução

A integridade do DNA celular está constantemente sob ameaça de agentes prejudiciais ao DNA, predominantemente subprodutos metabólicos como espécies reativas de oxigênio, que infligem dezenas de milhares de lesões de DNA por célula diariamente¹. A manutenção persistente da estabilidade do genoma é essencial para a homeostase celular ^2,3. A pedra angular dessa manutenção é a resposta a danos no DNA (DDR) - uma intrincada rede de sinalização em camadas que inicia vias específicas de reparo do DNA enquanto ajusta cuidadosamente muitos outros processos celul....

Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, equipamentos e anticorpos. Os procedimentos em animais foram empregados de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Ética da Universidade de Tel Aviv após a aprovação. O procedimento é realizado em filhotes de camundongos de 10 dias, independentemente do sexo. Se necessário, a genotipagem é realizada no dia anterior usando uma biópsia de cauda e métodos padrão. As soluções são estéreis e conservadas a 4 °C, salvo indicação em contrário; ver Tabela 1.

1. Preparação das culturas

Discussão

Observações na generalidade
A principal vantagem do sistema de cultura organotípica é que ele facilita os estudos usando o tecido do córtex cerebelar, preservando sua organização estrutural por várias semanas na configuração da placa de cultura. Este sistema é útil para a realização de análises morfológicas aprofundadas de células de Purkinje (PCs), incluindo exames detalhados de espinhas dendríticas e características ultraestruturais 52,53,54,55,56.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature