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Resumo

As células cerebelares de Purkinje (PCs) são particularmente sensíveis a deficiências na resposta a danos no DNA. Um protocolo é apresentado para a avaliação visual da dinâmica da resposta do PC ao dano ao DNA, que envolve a coloração de cadeias de poli(ADP-ribose) ligadas a proteínas dentro de culturas organotípicas cerebelares.

Resumo

As células cerebelares de Purkinje (PCs) exibem uma interação única de altas taxas metabólicas, arquitetura específica da cromatina e extensa atividade transcricional, tornando-as particularmente vulneráveis a danos no DNA. Isso requer uma resposta eficiente ao dano ao DNA (DDR) para prevenir a degeneração cerebelar, muitas vezes iniciada por disfunção ou perda do PC. Um exemplo notável é a síndrome de instabilidade do genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), marcada por depleção progressiva do PC e deterioração cerebelar. Investigar os mecanismos de DDR em PCs é vital para elucidar os caminhos que levam à sua degeneração em tais distúrbios. No entanto, a complexidade de isolar e cultivar PCs in vitro há muito dificulta os esforços de pesquisa. As culturas organotípicas (fatias) cerebelares murinas oferecem uma alternativa viável, imitando de perto o ambiente de tecido in vivo . No entanto, este modelo é restrito a indicadores DDR passíveis de imagens microscópicas. Refinamos o protocolo de cultura organotípica, demonstrando que a imagem fluorescente de cadeias de poli(ADP-ribose) (PAR) ligadas a proteínas, um indicador de DDR rápido e precoce, revela efetivamente a dinâmica de DDR em PCs dentro dessas culturas, em resposta ao estresse genotóxico.

Introdução

A integridade do DNA celular está constantemente sob ameaça de agentes prejudiciais ao DNA, predominantemente subprodutos metabólicos como espécies reativas de oxigênio, que infligem dezenas de milhares de lesões de DNA por célula diariamente1. A manutenção persistente da estabilidade do genoma é essencial para a homeostase celular 2,3. A pedra angular dessa manutenção é a resposta a danos no DNA (DDR) - uma intrincada rede de sinalização em camadas que inicia vias específicas de reparo do DNA enquanto ajusta cuidadosamente muitos outros processos celulares 4,5. Os déficits na DDR são comumente manifestados como 'síndromes de instabilidade do genoma', marcadas por instabilidade cromossômica, deterioração progressiva do tecido, crescimento ou desenvolvimento prejudicado, predisposição ao câncer e sensibilidade aumentada a determinados agentes que danificam o DNA 6,7,8,9. Notavelmente, a neurodegeneração, que muitas vezes inclui atrofia cerebelar, é uma característica distinta de muitas síndromes de instabilidade do genoma 7,10,11,12.

O distúrbio autossômico recessivo, ataxia-telangiectasia (A-T), é um exemplo bem documentado de um distúrbio de instabilidade do genoma 13,14,15. Essa condição surge de mutações nulas no gene ATM (A-T, mutado), responsável por codificar a proteína quinase principal, ATM, que é conhecida principalmente como mobilizadora de DDR em resposta a quebras de fita dupla de DNA (DSBs) 16 , 17 . A T-A se manifesta como um distúrbio multissistêmico, predominantemente caracterizado por degeneração cerebelar progressiva, levando a deficiências motoras agudas, imunodeficiência, atrofia gonadal, predisposição ao câncer e extrema sensibilidade à radiação ionizante. Células cultivadas de indivíduos com A-T apresentam instabilidade cromossômica e aumento da sensibilidade a agentes genotóxicos, especialmente aqueles causadores de DSBs 15,18,19. É importante ressaltar que o ATM também desempenha um papel no reparo de outras lesões de DNA, ressaltando sua ampla importância na manutenção da estabilidade do genoma 20,21,22.

Apesar da pesquisa minuciosa sobre os inúmeros papéis da ATM, o mecanismo específico que leva à degeneração cerebelar na A-T continua sendo um tópico de debate ativo, com vários modelos propostos para elucidar esse processo 23,24,25,26,27,28,29,30. Nosso modelo28 sugere que a degeneração cerebelar em pacientes com A-T começa com a disfunção e eventual perda de células de Purkinje (PCs). Considerando o papel crítico do ATM na preservação da estabilidade do genoma em face de danos contínuos ao DNA, os PCs são particularmente vulneráveis à ausência de ATM. Atribuímos essa vulnerabilidade à combinação de sua alta atividade metabólica, estrutura distinta da cromatina e extensa atividade transcricional. Em última análise, sugere-se que a perda da função do PC e, portanto, sua degeneração, é devido à inativação estocástica e funcional dos genes, uma consequência da produção de transcritos defeituosos28.

O estudo da biologia do PC em laboratório é impedido por desafios no cultivo de PCs isolados, pois essas células dependem fortemente de seu meio natural e das células vizinhas para sobrevivência e função, tornando-as incompatíveis com o crescimento dissociado da cultura. No entanto, os PCs podem permanecer viáveis por longos períodos em culturas de fatias de tecido. As culturas organotípicas cerebelares, que são fatias de tecido tipicamente derivadas de cerebelo de roedores, mantêm a organização estrutural do tecido e suportam várias manipulações experimentais análogas às possíveis com células cultivadas. Portanto, essas culturas permitem estudos cerebelares em um ambiente controlado 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Especificamente, no contexto de A-T, as culturas organotípicas cerebelares murinas provaram ser fundamentais na exploração do DDR em PCs deficientes em Atm 40,41,42,43. Embora os camundongos deficientes em Atm exibam apenas um fenótipo cerebelar sutil 44,45,46,47, presumivelmente devido a diferenças entre a fisiologia cerebelar humana e de camundongo, a suposição é que os papéis do ATM são amplamente conservados nessas espécies. Essa noção é apoiada por nossas observações de que a resposta deficiente a DSBs de DNA em PCs murinos Atm-/- se alinha com a observada em outros tipos de células murinas e humanas deficientes em ATM/Atm40,41,42,43.

Uma limitação na análise das respostas do PC a vários estímulos ou estresses em culturas organotípicas é a necessidade de confiar em imagens microscópicas para leituras. A DDR é geralmente estudada por meio de leituras bioquímicas em massa, embora marcadores imunofluorescentes comuns também sejam utilizados, como seguir a dinâmica de formação e resolução de focos nucleares de histona fosforilada H2AX (γH2AX) e da proteína 53BP1, que são considerados indicadores de DSBs48,49. Uma medida mais ampla é a imagem fluorescente da formação da cadeia de poli (ADP-ribose) (PAR) em proteínas, uma resposta rápida e robusta a danos precoces no DNA, particularmente a quebras de fita 7,50. Modificamos o protocolo de Komulainen et al.51 para coloração PAR em culturas organotípicas cerebelares. Observamos uma resposta PAR pronunciada nos núcleos consideráveis dos PCs. Apresentamos aqui nosso protocolo refinado para estabelecer culturas organotípicas cerebelares murinas e para visualizar a resposta PAR sob estresse genotóxico.

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Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, equipamentos e anticorpos. Os procedimentos em animais foram empregados de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Ética da Universidade de Tel Aviv após a aprovação. O procedimento é realizado em filhotes de camundongos de 10 dias, independentemente do sexo. Se necessário, a genotipagem é realizada no dia anterior usando uma biópsia de cauda e métodos padrão. As soluções são estéreis e conservadas a 4 °C, salvo indicação em contrário; ver Tabela 1.

1. Preparação das culturas

NOTA: Realize o procedimento em um ambiente estéril e desinfete a superfície de trabalho com antecedência usando etanol a 70%.

  1. Adicione 1 mL de BME a cada poço de placas de 6 poços. Usando uma pinça estéril, coloque uma única inserção de cultura de células em cada poço e incube as placas em uma incubadora a 37 ° C / 5% CO2 por um mínimo de 2 h antes do procedimento de dissecação.
  2. Configure uma área de dissecação dentro de uma capa biológica, contendo o picador de tecido, placas de cultura de 30 mm, um microscópio binocular e uma fonte de luz.
  3. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas em etanol 70% durante todo o processo. Use um copo urinário cheio de etanol 70% para imersão e um copo urinário separado com 1x PBS para lavar o etanol antes de usar.
  4. Para cada dissecção (ou seja, para cada cerebelo), prepare duas placas de cultura de 30 mm cheias de meio de dissecção a frio e deixe-as no gelo.
  5. Pulverize o animal com etanol 70%.
  6. Usando uma tesoura afiada, decapite rapidamente o animal. Para expor o cérebro, faça uma pequena incisão com uma tesoura longe do cerebelo. Usando uma pinça com pontas arredondadas, retire suavemente o crânio. Remova o crânio em pequenos pedaços para evitar danificar o tecido cerebelar.
  7. Transfira imediatamente o cérebro para o meio de dissecção a frio ou remova diretamente o cerebelo de dentro do crânio. Para fazer isso, exponha o cerebelo e separe o córtex cerebelar do tronco encefálico, desconectando os três pares de pedúnculos, usando uma espátula de íris curva fina. Para identificar os pedúnculos, veja de rostral para caudal: os pedúnculos cerebelares superiores emparelhados conectam o mesencéfalo a cada lado do cerebelo; os pedúnculos cerebelares médios emparelhados conectam a ponte a cada lado do cerebelo; e os pedúnculos cerebelares inferiores emparelhados se conectam à medula de cada lado do cerebelo. Quando o cerebelo estiver visível, separe-o do cérebro usando a mesma espátula: deslize a espátula entre o cerebelo, o colículo superior e o tronco encefálico.
    NOTA: Não faça um esforço especial para remover as meninges, pois elas se desprendem facilmente após o cerebelo ser cortado.
  8. Ajuste o picador de tecidos para uma espessura de fatia de 350 μm.
  9. Antes de posicionar o cerebelo na base do picador, remova o excesso de tampão dissecante do tecido. Isso melhorará a adesão do tecido à base do picador.
  10. Posicione o cerebelo na plataforma de corte em uma orientação vertical e execute o corte parassagital com uma espessura de corte de 350 μm. Separe delicadamente as fatias usando uma espátula de íris fina e coloque-as em meio de dissecção a frio.
  11. Transfira o tecido fatiado de volta para um tampão de dissecção frio fresco. Use uma ponta de 1.000 μL para guiar delicadamente as fatias de tecido para o prato contendo tampão de dissecção a frio.
  12. Sob o binóculo, use duas espátulas de íris curvas para separar cuidadosamente as fatias de tecido uma da outra. Para culturas, use fatias derivadas do vermis cerebelar situado na zona corticonuclear medial do órgão.
  13. Transfira cada fatia de tecido para uma inserção de cultura usando uma espátula larga e mova cada inserção carregando uma fatia de tecido para um poço nas placas de 6 poços contendo o meio pré-aquecido. Deixe as placas na incubadora.
  14. Substitua o meio em dias alternados: aspire o meio usado usando uma pipeta de vidro estéril e, com uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione 1 mL de MBE fresco com a ponta da pipeta encostada na parede do poço. Certifique-se de não direcionar o fluxo do meio para o tecido.
    NOTA: A fatia de tecido exibirá uma aparência semelhante a inflamação nos primeiros 5-7 dias em cultura e estará pronta para experimentos assim que esse fenômeno desaparecer e até 2 semanas após o estabelecimento da cultura.

2. Tratamento com agentes prejudiciais ao DNA, fixação, coloração e imagens microscópicas

  1. Adicionar produtos químicos que danificam o ADN directamente ao meio de cultura em concentrações finais adequadas, durante períodos pré-determinados. Após o período de exposição, remova os produtos químicos substituindo o meio por meio de cultura fresco.
  2. Se a leitura de DDR envolver coloração PAR, adicione um inibidor de poli(ADP-ribose) glicohidrolase (PARG) ao meio de cultura a uma concentração final de 10 μM, 30 min antes da fixação.
    NOTA: Este tratamento é crítico, pois a modificação do PAR é de curta duração e continuamente degradada pelo PARG.
  3. Imediatamente antes da fixação, aspirar o meio e substituí-lo por 1 ml de tampão fosfato 0,1 M à temperatura ambiente.
    NOTA: O tampão frio pode causar o descolamento das fatias de tecido da inserção.
  4. Fixar imediatamente as fatias substituindo o tampão por uma mistura pré-arrefecida (-20 °C) de acetona:metanol (1:1) de modo a que a fatia de tecido fique submersa nesta mistura e deixar repousar 20 min a -20 °C.
    NOTA: É possível parar nesta fase e prosseguir com a imunocoloração mais tarde. Para isso, lave os tecidos 3x com tampão fosfato 0,1 M pré-resfriado a 4 °C, certificando-se de que o tecido esteja submerso no tampão. Os tecidos podem ser armazenados agora em tampão fosfato 0,1M por até 2 semanas a 4 °C.
  5. Transfira a fatia de tecido para um poço em uma placa de 48 poços.
  6. Use um bisturi e uma tábua de corte para remover as margens da inserção, cortando ao redor da fatia de tecido. Coloque cada fatia em um poço de um prato de 48 poços. Adicione 100 μL de tampão fosfato 0,1 M.
  7. Para permeabilização, aspire o tampão, adicione ao poço 100 μL de tampão fosfato 0,1 M contendo 1% de Triton X-100 e deixe por 5 min em temperatura ambiente.
  8. Aspirar a solução e adicionar 100 μL de solução de bloqueio (ver Tabela 1) por alvéolo. Agite suavemente em temperatura ambiente por 2 h.
  9. Durante a etapa de bloqueio, diluir o anticorpo primário ou o reagente anti-PAR (1:800) na solução de bloqueio.
  10. Remova a solução de bloqueio (não há necessidade de lavar) e adicione 100 μL de mistura de anticorpos primários a cada poço. Aplique agitação suave por 2 h em temperatura ambiente.
  11. Dilua os anticorpos secundários em tampão fosfato 0,1 M contendo 0,2% de Triton X-100 (1:500), minimizando sua exposição à luz.
  12. Aspire a solução de anticorpo primário e lave as fatias 3 x 5 min com tampão fosfato 0,1 M contendo 0,2% de Triton X-100, à temperatura ambiente, agitando suavemente.
  13. Substitua a solução de lavagem por 100 μL de solução de anticorpos secundários (diluição 1:500). Continue agitando suavemente por 2 h em temperatura ambiente no escuro (cubra as placas com papel alumínio).
  14. Para preparar uma solução de DAPI, dilua a solução estoque (2 mg / mL) para 1 μg / mL em 1x PBS.
  15. Vinte minutos antes do final da incubação de 2 h com o anticorpo secundário, adicione 20 μL da solução final de DAPI a cada poço e continue agitando por 20 min. Aspire o líquido e lave com a solução de lavagem por 3 x 5 min com agitação suave.
  16. Para a montagem, coloque o tecido em uma lâmina de vidro de microscópio com o tecido voltado para cima, adicione o meio de montagem e cubra com um vidro de cobertura. Coloque as lâminas em uma superfície plana e deixe-as secar durante a noite no escuro, em temperatura ambiente (evite usar um meio de montagem contendo DAPI para evitar desfoque).
  17. Armazene as lâminas a 4 °C em uma caixa à prova de luz.
  18. Capture imagens microscópicas usando um microscópio confocal e filtros apropriados.

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Resultados

A Figura 1 ilustra a aparência geral das culturas organotípicas cerebelares. A linha superior da Figura 1A mostra a foliação cerebelar, que é mantida em cultura, enquanto a linha inferior mostra os PCs corados para Calbindina D-28k (verde) e os núcleos neuronais corados para NeuN (vermelho). Na Figura 1B, os astrócitos nos PCs (vermelho) são corados para GFAP (verde), uma proteína intermedi...

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Discussão

Observações na generalidade
A principal vantagem do sistema de cultura organotípica é que ele facilita os estudos usando o tecido do córtex cerebelar, preservando sua organização estrutural por várias semanas na configuração da placa de cultura. Este sistema é útil para a realização de análises morfológicas aprofundadas de células de Purkinje (PCs), incluindo exames detalhados de espinhas dendríticas e características ultraestruturais 52,53,54,55,56...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a este estudo.

Agradecimentos

O trabalho em nosso laboratório é apoiado pela Fundação de Pesquisa Médica Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson e pela Associação Israelense de Combate à Doença A-T.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dishCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri dishCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
Adhesive microscope slidesMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Blades for chopperTED PELLAModel TC752-1 Style Razor Blades
BMEGIBCO41010-026 500ml. No L-Glut
Cell culture insertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS w/o phenol redSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS with phenol redSartorius02-015-1A
Horse serum GIBCO26050088heat inactivated
Iris forcepsCellPathGZX-0100-00A130mm blunt serrated
Iris spatulaF.S.T10092-12
L-Glutamine (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
Methanol Sigma-AldrichG5767
MicroscopeOlympus
Mounting Medium withoutGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitorTocris Bioscience, United KingdomPDD 00017273light sensitive 
Phosphate bufferBiological Indo.02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well platesCorning incorporatedCLS3516
Spare Chopping Discs TED PELLAModel 10180-01
Tissue chopperMcIlwainModel TC75210180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG 
Invitrogen		A212061:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protienMilliphoreMAB34021:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagentMilliphoreMABE10161:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)Cell signaling40841:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

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