使用小脑器官型培养物可视化浦肯野细胞中的 DNA 损伤反应

摘要

小脑浦肯野细胞 （PC） 对 DNA 损伤反应的缺陷特别敏感。提出了一种方案，用于视觉评估 PC 对 DNA 损伤的反应动力学，其中包括对小脑器官型培养物中的蛋白质结合多聚 （ADP-核糖） 链进行染色。

摘要

小脑浦肯野细胞 （PC） 表现出高代谢率、特异性染色质结构和广泛转录活性的独特相互作用，使它们特别容易受到 DNA 损伤。这需要有效的 DNA 损伤反应 （DDR） 来防止小脑变性，这通常是由 PC 功能障碍或丢失引起的。一个值得注意的例子是基因组不稳定综合征，共济失调-毛细血管扩张症 （A-T），其特征是进行性 PC 耗竭和小脑恶化。研究 PC 中的 DDR 机制对于阐明导致它们在此类疾病中退化的途径至关重要。然而，体外分离和培养 PC 的复杂性长期以来 一直阻碍着研究工作。小鼠小脑器官型（切片）培养物提供了一种可行的替代方案，与 体内 组织环境非常相似。然而，该模型仅限于适合显微镜成像的 DDR 指标。我们改进了器官型培养方案，证明蛋白质结合的聚 （ADP-核糖） （PAR） 链的荧光成像是一种快速和早期的 DDR 指标，可有效揭示这些培养物中 PC 中的 DDR 动力学，以响应遗传毒性应激。

引言

细胞 DNA 的完整性不断受到 DNA 损伤剂的威胁，主要是活性氧等代谢副产物，每天每个细胞都会造成数以万计的 DNA 损伤¹。持续维持基因组稳定性对于细胞稳态至关重要 ^2,3。这种维持的基石是 DNA 损伤反应 （DDR） - 一个复杂的分层信号转导网络，可启动特定的 DNA 修复途径，同时仔细调整许多其他细胞过程 ^4,5。DDR 缺陷通常表现为“基因组不稳定综合征”，其特征是染色体不稳定、进行性组织恶化、生长或发育受损、癌症易感性以及对特定 DNA 损伤剂的敏感性增加 6,7,8,9。值得注意的是，神经退行性变（通常包括小脑萎缩）是许多基因组不稳定综合征的一个显著特征 7,10,11,12。....

研究方案

有关材料、设备和抗体的详细信息，请参阅 材料表 。批准后，根据特拉维夫大学伦理委员会的伦理准则采用动物程序。该程序在 10 天大的小鼠幼崽上进行，无论它们的性别如何。如果需要，在前一天使用尾部活检和标准方法进行基因分型。除非另有说明，否则溶液是无菌的，并储存在 4 °C 下;请参阅 表 1。

1. 培养物的制备

注意：在无菌环境中执行该程序，并使用 70% 乙醇提前对工作台面进行消毒。

1. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 的 BME。使用无菌镊子，将单个细胞培养插入物放入每个孔中，并在解剖程序之前将板在 37 °C/5% CO₂ 培养箱中孵育至少 2 小时。
2. 在生物罩内设置一个解剖区域，包含组织切碎器、30 毫米培养板、双目显微镜和光源。
3. 在整个过程中将手术工具浸入 70% 乙醇中。使用装有 70% 乙醇的尿杯浸泡，并使用装有 1x PBS 的单独尿杯洗去乙醇。
4. 对于每次解剖（即对于每个小脑），准备两个装满冷解剖培养基的 30 mm 培养板，并将它们放在冰上。
5. 用 70% 乙醇喷洒动物。
6. 使用锋利的剪刀，迅速将动....

讨论

一般评论
器官型培养系统的主要优点是它有助于使用小脑皮层组织进行研究，在培养皿设置中将其结构组织保留数周。该系统可用于对浦肯野细胞 （PC） 进行深入的形态学分析，包括树突棘和超微结构特征的详细检查 52,53,54,55,56,57,58,59。^.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature