JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мозжечковые клетки Пуркинье (ПК) особенно чувствительны к дефициту в ответе на повреждение ДНК. Представлен протокол визуальной оценки динамики ответа ПК на повреждение ДНК, который включает окрашивание связанных с белками поли(АДФ-рибозных) цепей в мозжечковых органотипических культурах.

Аннотация

Клетки мозжечка Пуркинье (ПК) демонстрируют уникальное взаимодействие высоких скоростей метаболизма, специфической архитектуры хроматина и обширной транскрипционной активности, что делает их особенно уязвимыми к повреждению ДНК. Это обуславливает необходимость эффективного ответа на повреждение ДНК (DDR) для предотвращения мозжечковой дегенерации, часто инициированной дисфункцией или потерей РПЖ. Ярким примером является синдром нестабильности генома, атаксия-телеангиэктазия (А-Т), характеризующийся прогрессирующим истощением РПЖ и ухудшением состояния мозжечка. Изучение механизмов РДР в РПЖ имеет жизненно важное значение для выяснения путей, ведущих к их дегенерации при таких расстройствах. Тем не менее, сложность выделения и культивирования ПК in vitro долгое время препятствовала исследовательским усилиям. Мышиные мозжечковые органотипические (срезовые) культуры представляют собой возможную альтернативу, близко имитируя тканевую среду in vivo . Тем не менее, эта модель ограничена показателями РДР, поддающимися микроскопической визуализации. Мы усовершенствовали протокол органотипических культур, продемонстрировав, что флуоресцентная визуализация связанных с белками поли(АДФ-рибоз) (ФАР) цепей, быстрый и ранний индикатор DDR, эффективно выявляет динамику DDR в ПК в этих культурах в ответ на генотоксический стресс.

Введение

Целостность клеточной ДНК постоянно находится под угрозой из-за повреждающих ДНК агентов, преимущественно побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода,которые ежедневно наносят десятки тысяч повреждений ДНК на клетку. Постоянное поддержание стабильности генома имеет важное значение для клеточного гомеостаза 2,3. Краеугольным камнем этого поддержания является реакция на повреждение ДНК (DDR) - сложная слоистая сигнальная сеть, которая инициирует определенные пути репарации ДНК, тщательно регулируя многие другие клеточные процессы 4,5. Дефицит РДР обычно проявляется в виде «синдромов нестабильности генома», характеризующихся хромосомной нестабильностью, прогрессирующим разрушением тканей, нарушением роста или развития, предрасположенностью к раку и повышенной чувствительностью к определенным агентам, повреждающим ДНК 6,7,8,9. Примечательно, что нейродегенерация, которая часто включает в себя мозжечковую атрофию, является отличительной чертой многих синдромов нестабильности генома 7,10,11,12.

Аутосомно-рецессивное заболевание, атаксия-телеангиэктазия (А-Т), является хорошо задокументированным примером нарушения нестабильности генома 13,14,15. Это состояние возникает из-за нулевых мутаций в гене ATM (A-T, мутированный), ответственном за кодирование ключевой протеинкиназы, ATM, которая известна в первую очередь как мобилизатор DDR в ответ на двухцепочечные разрывы ДНК (DSB)16,17. А-Т проявляется как мультисистемное расстройство, характеризующееся преимущественно прогрессирующей мозжечковой дегенерацией, приводящей к острым двигательным нарушениям, иммунодефициту, атрофии гонад, предрасположенности к раку и крайней чувствительности к ионизирующему излучению. Культивируемые клетки индивидуумов с А-Т демонстрируют хромосомную нестабильность и повышенную чувствительность к генотоксическим агентам, особенно вызывающим DSB 15,18,19. Важно отметить, что ATM также играет роль в восстановлении других повреждений ДНК, подчеркивая его широкое значение в поддержании стабильности генома 20,21,22.

Несмотря на тщательные исследования многочисленных ролей ATM, конкретный механизм, приводящий к мозжечковой дегенерации при А-Т, остается темой активных дебатов, с различными моделями, предложенными для объяснения этого процесса 23,24,25,26,27,28,29,30. Наша модель28 предполагает, что мозжечковая дегенерация у пациентов с А-Т начинается с дисфункции и последующей потери клеток Пуркинье (РПЖ). Учитывая решающую роль ATM в сохранении стабильности генома в условиях продолжающегося повреждения ДНК, ПК особенно уязвимы к отсутствию ATM. Мы связываем эту уязвимость с сочетанием их высокой метаболической активности, характерной структуры хроматина и обширной транскрипционной активности. В конечном счете, предполагается, что потеря функции ПК и, следовательно, их дегенерация обусловлены стохастической, функциональной инактивацией генов, являющейся следствием производства дефектных транскриптов28.

Изучение биологии РПЖ в лаборатории затруднено проблемами культивирования изолированных РПЖ, поскольку эти клетки в значительной степени зависят от своей естественной среды и соседних клеток для выживания и функционирования, что делает их несовместимыми с ростом диссоциированной культуры. Тем не менее, ПК могут оставаться жизнеспособными в течение длительного периода времени в культурах срезов тканей. Мозжечковые органотипические культуры, представляющие собой срезы тканей, обычно получаемые из церебеллы грызунов, поддерживают структурную организацию ткани и поддерживают различные экспериментальные манипуляции, аналогичные тем, которые возможны с культивируемыми клетками. Таким образом, эти культуры позволяют проводить исследования мозжечка в контролируемых условиях 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. В частности, в контексте А-Т органотипические культуры мозжечка мышей сыграли важную роль в изучении РДР в ПК с дефицитом ATM 40,41,42,43. В то время как мыши с дефицитом ATM демонстрируют лишь едва заметный мозжечковый фенотип 44,45,46,47, предположительно из-за различий между физиологией мозжечка человека и мыши, предполагается, что роль ATM в значительной степени сохраняется у всех этих видов. Это мнение подтверждается нашими наблюдениями о том, что дефицитный ответ на DSB ДНК в мышиных ПК Atm-/- соответствует тому, который наблюдается у других типов клеток ATM/ATM у других мышей и человека с дефицитом ATM/ATM 40,41,42,43.

Ограничением в анализе реакции ПК на различные стимулы или стрессы в органотипических культурах является необходимость полагаться на микроскопическую визуализацию для считывания. DDR обычно изучают с помощью объемных биохимических считываний, хотя используются и общие иммунофлуоресцентные маркеры, такие как отслеживание динамики образования и разрешения ядерных очагов фосфорилированного гистона H2AX (γH2AX) и белка 53BP1, которые считаются индикаторами DSB48,49. Более широким показателем является флуоресцентная визуализация формирования поли(АДФ-рибозы) (PAR) цепи на белках, что обеспечивает быструю и устойчивую раннюю реакцию на повреждение ДНК, особенно на разрывы цепи 7,50. Мы модифицировали протокол Komulainen et al.51 для окрашивания PAR в мозжечковых органотипических культурах. Мы наблюдали выраженный ответ ФАР в крупных ядрах РПЖ. Здесь представлен наш усовершенствованный протокол для создания органотипических культур мозжечка у мышей и для визуализации ответа ФАР в условиях генотоксического стресса.

протокол

Подробную информацию о материалах, оборудовании и антителах см. в Таблице материалов . Процедуры с животными применялись в соответствии с этическими принципами Комитета по этике Тель-Авивского университета после одобрения. Процедура проводится на 10-дневных щенках мыши, независимо от их пола. При необходимости генотипирование проводится в предыдущий день с помощью биопсии хвоста и стандартных методов. Растворы стерильны и хранятся при температуре 4 °C, если не указано иное; см. Таблицу 1.

1. Подготовка культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите процедуру в стерильной среде и заранее продезинфицируйте рабочую поверхность с использованием 70% этанола.

  1. Добавьте 1 мл BME в каждую лунку 6-луночных планшетов. С помощью стерильных щипцов поместите в каждую лунку вкладыш для одной клеточной культуры и инкубируйте планшеты в инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2 в течение как минимум 2 часов до процедуры вскрытия.
  2. Установите зону диссекции внутри биологического колпака, содержащую тканевой измельчитель, 30-миллиметровые культуральные планшеты, бинокулярный микроскоп и источник света.
  3. Погружайте хирургические инструменты в 70% этанол на протяжении всего процесса. Используйте мочевую чашу, наполненную 70% этанолом, для погружения и отдельную мочевую чашу с 1x PBS, чтобы смыть этанол перед использованием.
  4. Для каждого рассечения (т. е. для каждого мозжечка) подготовьте две 30 мм культуральные пластины, заполненные средой для холодной диссекции, и оставьте их на льду.
  5. Опрыскайте животное 70% этанолом.
  6. С помощью острых ножниц быстро обезглавьте животное. Чтобы обнажить мозг, сделайте небольшой разрез ножницами в сторону от мозжечка. С помощью пинцета с закругленными концами аккуратно снимите череп. Удаляйте череп небольшими частями, чтобы не повредить ткань мозжечка.
  7. Немедленно перенесите мозг в холодную среду для рассечения или непосредственно удалите мозжечок изнутри черепа. Для этого обнажите мозжечок и отделите кору мозжечка от ствола мозга, отсоединив три пары цветоносов, с помощью тонкого изогнутого шпателя радужной оболочки. Чтобы определить цветоносы, посмотрите с рострального на каудальный: парные верхние ножки мозжечка соединяют средний мозг с каждой стороны мозжечка; Парные средние ножки мозжечка соединяют мосты с каждой стороны мозжечка; а парные нижние ножки мозжечка соединяются с мозговым веществом с каждой стороны мозжечка. Как только мозжечок станет виден, отделите его от головного мозга с помощью того же шпателя: проведите шпателем между мозжечком, верхним колликулусом и стволом мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прилагайте особых усилий для удаления мозговых оболочек, так как они легко отделяются после разрезания мозжечка.
  8. Установите измельчитель тканей на толщину среза 350 мкм.
  9. Перед размещением мозжечка на основании измельчителя удалите излишки рассекающего буфера из тканей. Это улучшит адгезию ткани к основанию измельчителя.
  10. Расположите мозжечок на режущей платформе в вертикальной ориентации и проведите парасагиттальную нарезку при толщине среза 350 мкм. Аккуратно разделите ломтики с помощью тонкого шпателя для радужки и положите их в холодную среду для рассечения.
  11. Перенесите срезанную ткань обратно в свежий буфер для холодного рассечения. Используйте наконечник объемом 1 000 мкл, чтобы аккуратно направить срезы ткани в чашку, содержащую буфер для холодной диссекции.
  12. Под бинокль используют два изогнутых шпателя радужной оболочки, чтобы аккуратно отделить срезы тканей друг от друга. Для культур используйте срезы, полученные из червей мозжечка, расположенных в медиальной кортико-ядерной зоне органа.
  13. Переложите каждый срез ткани на вкладыш для культуры с помощью широкого шпателя и переместите каждый вкладыш, содержащий срез ткани, в лунку в 6-луночных планшетах, содержащих предварительно нагретую среду. Оставьте пластины в инкубаторе.
  14. Заменяйте среду через день: отсасывайте использованную среду с помощью стерильной стеклянной пипетки, а с помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 1 мл свежей MBE так, чтобы кончик пипетки был прислонен к стенке лунки. Следите за тем, чтобы поток среды не направлялся на ткани.
    Примечание: Срез ткани будет иметь воспаленный вид в течение первых 5-7 дней в культуре и будет готов к экспериментам, как только это явление исчезнет, и в течение 2 недель после создания культуры.

2. Лечение ДНК-повреждающими препаратами, фиксация, окрашивание и микроскопическая визуализация

  1. Добавляйте разрушающие ДНК химические вещества непосредственно в питательную среду в соответствующих конечных концентрациях в течение заданного периода времени. По истечении периода воздействия удалите химикаты, заменив среду свежей питательной средой.
  2. Если считывание DDR включает окрашивание PAR, добавьте ингибитор поли(АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) в питательную среду в конечной концентрации 10 мкМ за 30 мин до фиксации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лечение имеет решающее значение, так как модификация PAR кратковременна и постоянно разрушается под действием PARG.
  3. Непосредственно перед фиксацией аспирируйте среду и замените ее 1 мл 0,1 М фосфатного буфера комнатной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холодный буфер может привести к отслоению срезов ткани от вставки.
  4. Немедленно закрепите ломтики, заменив буфер на предварительно охлажденную (-20 °C) смесь ацетона:метанола (1:1) так, чтобы срез ткани был погружен в эту смесь, и оставьте на 20 минут при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно остановиться и продолжить иммуноокрашивание позже. Для этого промойте салфетки 3 раза 0,1 М фосфатным буфером, предварительно охлажденным до 4 °C, убедившись, что ткань погружена в буфер. В настоящее время ткани могут храниться в 0,1М фосфатном буфере до 2 недель при 4 °C.
  5. Переложите срез ткани в лунку в 48-луночной пластине.
  6. С помощью скальпеля и разделочной доски удалите края вставки, разрезая вокруг среза ткани. Поместите каждый ломтик в лунку 48-луночной тарелки. Добавьте 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера.
  7. Для пермеабилизации аспирируют буфер, добавляют в лунку 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 1% Triton X-100, и оставляют на 5 мин при комнатной температуре.
  8. Отсадите раствор и добавьте 100 мкл блокирующего раствора (см. таблицу 1) в лунку. Аккуратно встряхивайте при комнатной температуре в течение 2 часов.
  9. На этапе блокирования разведите первичное антитело или реагент против PAR (1:800) в блокирующем растворе.
  10. Удалите блокирующий раствор (не нужно мыть) и добавьте по 100 мкл первичной смеси антител в каждую лунку. Применять при легком встряхивании в течение 2 ч при комнатной температуре.
  11. Вторичные антитела разбавляют в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,2% Triton X-100 (1:500), сводя к минимуму их воздействие света.
  12. Отсадите первичный раствор антитела и промойте срезы 3 x 5 мин 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 0,2% Triton X-100, при комнатной температуре, с легким встряхиванием.
  13. Замените раствор для промывки 100 μл раствора вторичного антитела (разведение 1:500). Продолжайте осторожное встряхивание в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте (накройте пластины алюминиевой фольгой).
  14. Чтобы приготовить раствор DAPI, разбавьте исходный раствор (2 мг/мл) до 1 мкг/мл в 1x PBS.
  15. За двадцать минут до окончания 2-часовой инкубации с вторичным антителом добавьте по 20 мкл окончательного раствора DAPI в каждую лунку и продолжайте встряхивание в течение 20 минут. Отсадите жидкость и промойте раствором для мытья в течение 3 х 5 минут, осторожно встряхивая.
  16. Для монтажа поместите салфетку на предметное стекло микроскопа салфеткой вверх, добавьте монтажный материал и накройте покровным стеклом. Поместите слайды на плоскую поверхность и дайте им высохнуть в течение ночи в темноте, при комнатной температуре (избегайте использования монтажной среды, содержащей DAPI, чтобы предотвратить размытие).
  17. Храните предметные стекла при температуре 4 °C в светонепроницаемой коробке.
  18. Захватывайте микроскопические изображения с помощью конфокального микроскопа и соответствующих фильтров.

Результаты

На рисунке 1 показан общий вид органотипических культур мозжечка. В верхнем ряду на рисунке 1A показано отслоение мозжечка, которое сохраняется в культуре, в то время как в нижнем ряду показаны PC, окрашенные на Calbindin D-28k (зеленый), и ядра не...

Обсуждение

Общие замечания
Основное преимущество органотипической системы культивирования заключается в том, что она облегчает исследования с использованием ткани коры мозжечка, сохраняя ее структурную организацию в течение нескольких недель в культуральной чашк?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данным исследованием.

Благодарности

Работа в нашей лаборатории поддерживается Фондом медицинских исследований доктора Мириам и Шелдона Г. Адельсона и Израильской ассоциацией по борьбе с болезнью А-Т.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dishCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri dishCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
Adhesive microscope slidesMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Blades for chopperTED PELLAModel TC752-1 Style Razor Blades
BMEGIBCO41010-026 500ml. No L-Glut
Cell culture insertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS w/o phenol redSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS with phenol redSartorius02-015-1A
Horse serum GIBCO26050088heat inactivated
Iris forcepsCellPathGZX-0100-00A130mm blunt serrated
Iris spatulaF.S.T10092-12
L-Glutamine (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
Methanol Sigma-AldrichG5767
MicroscopeOlympus
Mounting Medium withoutGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitorTocris Bioscience, United KingdomPDD 00017273light sensitive 
Phosphate bufferBiological Indo.02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well platesCorning incorporatedCLS3516
Spare Chopping Discs TED PELLAModel 10180-01
Tissue chopperMcIlwainModel TC75210180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG 
Invitrogen		A212061:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protienMilliphoreMAB34021:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagentMilliphoreMABE10161:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)Cell signaling40841:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

Ссылки

  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724 (2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64 (2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217 (2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159 (2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950 (2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622 (2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896 (2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279 (2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537 (2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173 (2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218 (2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540 (2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243 (2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193 (2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851 (2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637 (2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685 (2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены