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この記事について

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要約

小脳プルキンエ細胞(PC)は、DNA損傷応答の欠損に対して特に敏感です。DNA損傷に対するPC応答のダイナミクスを視覚的に評価するためのプロトコルが提示され、これには小脳器官型培養内のタンパク質結合ポリ(ADP-リボース)鎖の染色が含まれます。

要約

小脳プルキンエ細胞(PC)は、高い代謝率、特異的なクロマチン構造、および広範な転写活性のユニークな相互作用を示し、DNA損傷に対して特に脆弱です。これには、PCの機能不全や喪失によって引き起こされることが多い小脳変性を防ぐために、効率的なDNA損傷応答(DDR)が必要です。顕著な例は、進行性のPC枯渇と小脳の悪化を特徴とするゲノム不安定性症候群である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)です。PCのDDRメカニズムを調べることは、このような疾患におけるPCの変性につながる経路を解明するために不可欠です。しかし、 in vitro でのPCの単離と培養の複雑さは、長い間研究努力の妨げとなってきました。マウス小脳器官型(スライス)培養は、 in vivo 組織環境を密接に模倣した実行可能な代替手段を提供します。しかし、このモデルは、顕微鏡イメージングに適したDDRインジケーターに制約されています。私たちは、タンパク質結合ポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖の蛍光イメージング、迅速かつ早期のDDR指標が、遺伝毒性ストレスに応答して、これらの培養内のPCのDDRダイナミクスを効果的に明らかにすることを示し、器官型培養プロトコルを洗練しました。

概要

細胞DNAの完全性は、DNA損傷物質、主に活性酸素種などの代謝副産物によって常に脅威にさらされており、細胞あたり毎日数万のDNA損傷を引き起こします1。ゲノムの安定性の持続的な維持は、細胞の恒常性維持に不可欠です2,3。この維持の基礎は、DNA損傷応答(DDR)であり、これは、他の多くの細胞プロセスを慎重に調整しながら、特定のDNA修復経路を開始する複雑な層状シグナル伝達ネットワークである4,5。DDRの欠損は、染色体の不安定性、進行性の組織劣化、成長または発達の障害、癌の素因、および特定のDNA損傷物質に対する感受性の増加を特徴とする「ゲノム不安定症候群」として一般的に現れます6,7,8,9。特に、神経変性はしばしば小脳萎縮を含み、多くのゲノム不安定症候群の明確な特徴である7,10,11,12。

常染色体劣性遺伝性疾患である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)は、ゲノム不安定性障害13,14,15の十分に文書化された例です。この状態は、DNA二本鎖切断(DSB)に応答するDDRモビライザーとして主に知られている重要なプロテインキナーゼであるATMをコードする役割を担うATM(A-T、変異)遺伝子のヌル変異から生じます16,17。A-Tは、主に進行性の小脳変性を特徴とするマルチシステム障害として現れ、急性運動障害、免疫不全、性腺萎縮、癌の素因、および電離放射線に対する極端な感受性を引き起こします。A-Tを有する個体の培養細胞は、染色体の不安定性を示し、遺伝毒性物質、特にDSBを引き起こす薬剤15,18,19に対する感受性の増加を示します。重要なことに、ATMは他のDNA損傷の修復にも役割を果たしており、ゲノムの安定性を維持する上でのその広範な重要性を強調しています20,21,22。

ATMの多くの役割についての徹底的な研究にもかかわらず、A-Tにおける小脳変性につながる特定のメカニズムは活発な議論のトピックであり、このプロセスを解明するためにさまざまなモデルが提案されています23、24、25、26、27、28、29、30。私たちのモデル28 は、A-T 患者の小脳変性がプルキンエ細胞 (PC) の機能不全と最終的な喪失から始まることを示唆しています。DNA損傷が進行する中でゲノムの安定性を維持する上でATMが重要な役割を果たすことを考えると、PCはATMがないと特に脆弱です。この脆弱性は、それらの高い代謝活性、独特のクロマチン構造、および広範な転写活性の組み合わせに起因すると考えています。最終的に、PC機能の喪失、したがってそれらの変性は、遺伝子の確率的、機能的不活性化、すなわち欠陥のある転写産物を産生した結果によるものであることが示唆されている28。

研究室でのPC生物学の研究は、単離されたPCの培養における課題によって妨げられており、これらの細胞は生存と機能のために自然環境と隣接する細胞に大きく依存しており、解離した培養成長と互換性がありません。それにもかかわらず、PCは組織スライス培養において長期間生存し続けることができます。小脳器官型培養は、典型的にはげっ歯類の小脳に由来する組織切片であり、組織の構造組織を維持し、培養細胞で可能なものと同様にさまざまな実験的操作をサポートします。したがって、これらの培養物は、制御された環境内での小脳研究を可能にする 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 .具体的には、A-Tの文脈では、マウスの小脳器官型培養物は、Atm欠損PC40,41,42,43におけるDDRの探索に役立つことが証明されている。Atm欠損マウスは、おそらくヒトとマウスの小脳生理機能の違いにより、微妙な小脳表現型44,45,46,47しか示しませんが、ATMの役割はこれらの種全体で大部分保存されていると仮定されています。この概念は、Atm-/-マウスPCにおけるDNA DSBに対する欠損応答が、他のマウスおよびヒトATM/Atm欠損細胞型40,41,42,43で観察されたものと一致するという我々の観察によって支持されている。

器官型培養内のさまざまな刺激やストレスに対するPC応答の解析には、読み出しのために顕微鏡イメージングに頼る必要があるという制限があります。DDRは通常、バルク生化学的読み出しを使用して研究されますが、一般的な免疫蛍光マーカーも利用されます。たとえば、DSBの指標と考えられているリン酸化ヒストンH2AX(γH2AX)および53BP1タンパク質の核病巣の形成と分解能のダイナミクスを追跡するなど、48,49。より広範な尺度は、タンパク質上のポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖形成の蛍光イメージングであり、特に鎖切断7,50に対する迅速かつ堅牢な早期DNA損傷応答です。我々は、小脳器官型培養におけるPAR染色のためのKomulainenら51によるプロトコールを変更した。PCの大きな核で顕著なPAR応答が観察されました。ここでは、マウスの小脳器官型培養を確立し、遺伝毒性ストレス下でのPAR応答を視覚化するための洗練されたプロトコルを示します。

プロトコル

材料、装置、抗体の詳細については、 Table of Materials を参照してください。動物の手順は、承認後、テルアビブ大学の倫理委員会の倫理ガイドラインに基づいて採用されました。この手順は、性別に関係なく、生後10日のマウスの子犬に対して行われます。必要に応じて、前日に尾部生検と標準的な方法を用いてジェノタイピングを行います。溶液は滅菌されており、特に明記されていない限り4°Cで保存します。 表 1 を参照してください。

1. 培養物の準備

注:無菌環境内で手順を実施し、70%エタノールを使用して事前に作業面を消毒してください。

  1. 6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのBMEを添加します。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに単一細胞培養インサートを配置し、解剖手順の前にプレートを37°C/5%CO2 インキュベーターで最低2時間インキュベートします。
  2. 生物学的フード内に解剖エリアを設置し、組織チョッパー、30 mm培養プレート、双眼顕微鏡、および光源を含めます。
  3. プロセス全体を通して、手術器具を70%エタノールに浸します。70%エタノールを充填した尿カップを浸漬し、1x PBSを充填した別の尿カップを使用してエタノールを洗い流してから使用してください。
  4. 解剖ごとに(つまり、小脳ごとに)、冷たい解剖培地で満たされた2つの30mm培養プレートを準備し、氷の上に置きます。
  5. 動物に70%エタノールをスプレーします。
  6. 鋭利なハサミを使用して、動物をすばやく斬首します。脳を露出させるには、小脳から離れたところにハサミで小さな切開を行います。端が丸いピンセットを使用して、頭蓋骨をそっと剥がします。小脳組織の損傷を避けるために、頭蓋骨を細かく取り除きます。
  7. すぐに脳を冷郭清培地に移すか、頭蓋骨内から直接小脳を取り除きます。これを行うには、小脳を露出させ、細かく湾曲した虹彩ヘラを使用して、3対の脚を切断することにより、小脳皮質を脳幹から分離します。脚を識別するには、吻側から尾側まで見ます:ペアの上小脳脚は、中脳を小脳の両側に接続します。ペアになった中小脳脚は、橋を小脳の両側に接続します。そして、ペアの下小脳脚は、小脳の両側の髄質に接続します。小脳が見えたら、同じヘラを使用して小脳から小脳から分離します:へらを小脳、上丘、および脳幹の間にスライドさせます。
    注:髄膜をスライスした後、髄膜が容易に剥がれるため、髄膜を取り除くために特別な努力をしないでください。
  8. ティッシュチョッパーをスライスの厚さ350μmに設定します。
  9. 小脳をチョッパーの基部に配置する前に、組織から余分な解剖バッファーを取り除きます。.これにより、チョッパーの基部への組織の接着性が向上します。
  10. 小脳を切断プラットフォームに垂直に置き、スライスの厚さ350μmで傍矢状スライスを行います。細い虹彩スパチュラを使用してスライスをそっと分離し、冷たい解剖培地に入れます。
  11. スライスした組織を新鮮な冷解剖バッファーに戻します。1,000 μLのチップを使用して、組織スライスを冷解剖バッファーを含むディッシュに繊細に導きます。
  12. 双眼鏡の下で、2つの湾曲した虹彩ヘラを使用して、組織スライスを互いに慎重に分離します。培養には、臓器の内側皮質核ゾーンにある小脳虫部に由来するスライスを使用します。
  13. 幅広のスパチュラを使用して各組織スライスを培養インサートに移し、組織スライスを運ぶ各インサートを、予め加温した培地を含む6ウェルプレートのウェルに移動します。プレートをインキュベーターに置いておきます。
  14. 1日おきに培地を交換してください:滅菌ガラスピペットを使用して使用済みの培地を吸引し、5 mLの血清ピペットを使用して、ピペットの先端をウェルの壁に立てかけた状態で1 mLの新鮮なMBEを追加します。媒体の流れが組織に向けられないように注意してください。
    注:組織切片は、培養の最初の5〜7日間は炎症様の外観を示し、この現象が消えるとすぐに、培養確立後最大2週間で実験の準備が整います。

2. DNA損傷剤による治療、固定、染色、顕微鏡イメージング

  1. DNAを損傷する化学物質を、適切な最終濃度で、所定の時間、培養培地に直接添加します。曝露期間後、培地を新鮮な培地と交換して化学物質を取り除きます。
  2. DDRの読み出しにPAR染色が含まれる場合は、固定の30分前に、ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ(PARG)の阻害剤を最終濃度10 μMの培地に加えます。
    注:PAR修飾は短命で、PARGによって継続的に分解されるため、この処理は重要です。
  3. 固定する直前に、培地を吸引し、室温で1 mLの0.1 Mリン酸緩衝液と交換します。
    注:コールドバッファーは、インサートから組織スライスが剥がれる原因となる可能性があります。
  4. バッファーを予冷済み(-20°C)アセトン:メタノールミックス(1:1)に交換して、組織スライスをこのミックスに沈め、-20°Cで20分間放置して、スライスを直ちに固定します。
    注:この段階で停止し、後で免疫染色を進めることは可能です。これを行うには、4°Cに予冷した0.1 Mリン酸緩衝液で組織を3倍洗浄し、組織が緩衝液に浸されていることを確認します。組織は、0.1Mリン酸緩衝液に4°Cで最大2週間保存できるようになりました。
  5. 組織スライスを48ウェルプレートのウェルに移します。
  6. メスとまな板を使用してインサートのマージンを取り除き、ティッシュスライスの周りを切り取ります。各スライスを48ウェルプレートのウェルに入れます。100 μLの0.1 Mリン酸緩衝液を添加します。
  7. 透過処理のために、バッファーを吸引し、1% Triton X-100を含む0.1 Mリン酸バッファー100 μLをウェルに添加し、室温で5分間放置します。
  8. 溶液を吸引し、ウェルあたり100 μLのブロッキング溶液( 表1を参照)を加えます。室温で2時間静かに振とうします。
  9. ブロッキングステップでは、一次抗体または抗PAR試薬をブロッキング溶液中で希釈(1:800)します。
  10. ブロッキング溶液を取り出し(洗浄不要)、各ウェルに100 μLの一次抗体ミックスを加えます。室温で2時間穏やかに振とうします。
  11. 二次抗体を0.2% Triton X-100 (1:500) を含む0.1 Mリン酸緩衝液で希釈し、光への曝露を最小限に抑えます。
  12. 一次抗体溶液を吸引し、0.2% Triton X-100を含む0.1 Mリン酸緩衝液でスライスを5分×3回、室温で穏やかに振とうしながら洗浄します。
  13. 洗浄液を100 μLの二次抗体溶液(1:500希釈)と交換します。暗所で室温で2時間穏やかに振とう続けます(プレートをアルミホイルで覆います)。
  14. DAPI溶液を調製するには、原液(2 mg/mL)を1x PBSで1 μg/mLに希釈します。
  15. 二次抗体との2時間インキュベーションが終了する20分前に、最終DAPI溶液20μLを各ウェルに加え、20分間振とう続けます。液体を吸引し、洗浄液で3 x 5分間、穏やかに振って洗浄します。
  16. 埋込みは、顕微鏡スライドガラス上に組織を上に向けて置き、封入剤を加え、カバーガラスで覆います。スライドを平らな面に置き、室温で暗所で一晩乾燥させます(ダピを含む封入剤の使用は避けてください)。
  17. スライドは4°Cで防光ボックスに保管します。
  18. 共焦点顕微鏡と適切なフィルターを使用して顕微鏡画像をキャプチャします。

結果

図1は、小脳器官型培養の一般的な外観を示しています。 図1A の上段は培養で維持される小脳葉状化を示し、下段はカルビンジンD-28kで染色されたPC(緑)とNeuNで染色された神経核(赤)を示しています。 図1Bでは、PCのアストロサイト(赤)を、中間フィラメントIII型タンパク質であるGFAP(緑)について染色し...

ディスカッション

一般的なコメント
器官型培養システムの主な利点は、小脳皮質組織を使用した研究を容易にし、培養皿のセットアップでその構造組織を数週間保存することです。このシステムは、樹状突起スパインや超微細構造の特徴52,53,54,55,56,57,58,59の詳細な検査を含む、プルキンエ細胞(PC)の詳細な形態学的解?...

開示事項

著者らは、この研究に関連する利益相反を宣言しません。

謝辞

私たちの研究室での研究は、ミリアム博士とシェルドンG.アデルソン医学研究財団とイスラエルAT病と戦うための協会によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dishCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri dishCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
Adhesive microscope slidesMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Blades for chopperTED PELLAModel TC752-1 Style Razor Blades
BMEGIBCO41010-026 500ml. No L-Glut
Cell culture insertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS w/o phenol redSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS with phenol redSartorius02-015-1A
Horse serum GIBCO26050088heat inactivated
Iris forcepsCellPathGZX-0100-00A130mm blunt serrated
Iris spatulaF.S.T10092-12
L-Glutamine (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
Methanol Sigma-AldrichG5767
MicroscopeOlympus
Mounting Medium withoutGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitorTocris Bioscience, United KingdomPDD 00017273light sensitive 
Phosphate bufferBiological Indo.02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well platesCorning incorporatedCLS3516
Spare Chopping Discs TED PELLAModel 10180-01
Tissue chopperMcIlwainModel TC75210180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG 
Invitrogen		A212061:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protienMilliphoreMAB34021:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagentMilliphoreMABE10161:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)Cell signaling40841:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

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