小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答の可視化

要約

小脳プルキンエ細胞(PC)は、DNA損傷応答の欠損に対して特に敏感です。DNA損傷に対するPC応答のダイナミクスを視覚的に評価するためのプロトコルが提示され、これには小脳器官型培養内のタンパク質結合ポリ(ADP-リボース)鎖の染色が含まれます。

要約

小脳プルキンエ細胞(PC)は、高い代謝率、特異的なクロマチン構造、および広範な転写活性のユニークな相互作用を示し、DNA損傷に対して特に脆弱です。これには、PCの機能不全や喪失によって引き起こされることが多い小脳変性を防ぐために、効率的なDNA損傷応答(DDR)が必要です。顕著な例は、進行性のPC枯渇と小脳の悪化を特徴とするゲノム不安定性症候群である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)です。PCのDDRメカニズムを調べることは、このような疾患におけるPCの変性につながる経路を解明するために不可欠です。しかし、 in vitro でのPCの単離と培養の複雑さは、長い間研究努力の妨げとなってきました。マウス小脳器官型(スライス)培養は、 in vivo 組織環境を密接に模倣した実行可能な代替手段を提供します。しかし、このモデルは、顕微鏡イメージングに適したDDRインジケーターに制約されています。私たちは、タンパク質結合ポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖の蛍光イメージング、迅速かつ早期のDDR指標が、遺伝毒性ストレスに応答して、これらの培養内のPCのDDRダイナミクスを効果的に明らかにすることを示し、器官型培養プロトコルを洗練しました。

概要

細胞DNAの完全性は、DNA損傷物質、主に活性酸素種などの代謝副産物によって常に脅威にさらされており、細胞あたり毎日数万のDNA損傷を引き起こします¹。ゲノムの安定性の持続的な維持は、細胞の恒常性維持に不可欠です^2,3。この維持の基礎は、DNA損傷応答(DDR)であり、これは、他の多くの^{細胞プロセスを慎重に}調整しながら、特定のDNA修復経路を開始する複雑な層状シグナル伝達ネットワークである^4,5。DDRの欠損は、染色体の不安定性、進行性の組織劣化、成長または発達の障害、癌の素因、および特定のDNA損傷物質に対する感受性の増加を特徴とする「ゲノム不安定症候群」として一般的に現れます6,7,8,9。特に、神経変性はしばしば小脳萎縮を含み、多くのゲノム不安定症候群の明確な特徴である^....

プロトコル

材料、装置、抗体の詳細については、 Table of Materials を参照してください。動物の手順は、承認後、テルアビブ大学の倫理委員会の倫理ガイドラインに基づいて採用されました。この手順は、性別に関係なく、生後10日のマウスの子犬に対して行われます。必要に応じて、前日に尾部生検と標準的な方法を用いてジェノタイピングを行います。溶液は滅菌されており、特に明記されていない限り4°Cで保存します。 表 1 を参照してください。

1. 培養物の準備

注:無菌環境内で手順を実施し、70%エタノールを使用して事前に作業面を消毒してください。

1. 6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのBMEを添加します。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに単一細胞培養インサートを配置し、解剖手順の前にプレートを37°C/5%CO₂ インキュベーターで最低2時間インキュベートします。
2. 生物学的フード内に解剖エリアを設置し、組織チョッパー、30 mm培養プレート、双眼顕微鏡、および光源を含めます。
3. プロセス全体を通して、手術器具を70%エタノールに浸します。70%エタノールを充填した尿カップを浸漬し、1x P....

ディスカッション

一般的なコメント
器官型培養システムの主な利点は、小脳皮質組織を使用した研究を容易にし、培養皿のセットアップでその構造組織を数週間保存することです。このシステムは、樹状突起スパインや超微細構造の特徴52,53,54,55,56,57,58,59の詳細な検査を含む、プルキンエ細胞(PC)の詳細な形態学的解?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature