Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Résumé

Les cellules cérébelleuses de Purkinje (PC) sont particulièrement sensibles aux déficiences de la réponse aux dommages de l’ADN. Un protocole est présenté pour l’évaluation visuelle de la dynamique de la réponse de la PC aux dommages à l’ADN, ce qui implique la coloration des chaînes poly(ADP-ribose) liées aux protéines dans des cultures organotypiques cérébelleuses.

Résumé

Les cellules cérébelleuses de Purkinje (PC) présentent une interaction unique entre des taux métaboliques élevés, une architecture chromatinienne spécifique et une activité transcriptionnelle étendue, ce qui les rend particulièrement vulnérables aux dommages à l’ADN. Cela nécessite une réponse efficace aux dommages de l’ADN (DDR) pour prévenir la dégénérescence cérébelleuse, souvent initiée par un dysfonctionnement ou une perte de PC. Un exemple notable est le syndrome d’instabilité du génome, l’ataxie-télangiectasie (A-T), marqué par une déplétion progressive de la PC et une détérioration cérébelleuse. L’étude des mécanismes de DDR dans les PC est essentielle pour élucider les voies menant à leur dégénérescence dans de tels troubles. Cependant, la complexité de l’isolement et de la culture des PC in vitro a longtemps entravé les efforts de recherche. Les cultures organotypiques cérébelleuses murines (tranches) offrent une alternative réalisable, imitant étroitement l’environnement tissulaire in vivo . Pourtant, ce modèle est limité à des indicateurs DDR se prêtant à l’imagerie microscopique. Nous avons affiné le protocole de culture organotypique, démontrant que l’imagerie fluorescente des chaînes de poly(ADP-ribose) (PAR) liées aux protéines, un indicateur DDR rapide et précoce, révèle efficacement la dynamique de la DDR dans les PC au sein de ces cultures, en réponse au stress génotoxique.

Introduction

L’intégrité de l’ADN cellulaire est constamment menacée par des agents endommageant l’ADN, principalement des sous-produits métaboliques comme les espèces réactives de l’oxygène, qui infligent des dizaines de milliers de lésions d’ADN par cellule chaque jour^. Le maintien persistant de la stabilité du génome est essentiel pour l’homéostasie cellulaire ^2,3. La pierre angulaire de cette maintenance est la réponse aux dommages de l’ADN (DDR) - un réseau de signalisation complexe et stratifié qui initie des voies de réparation spécifiques de l’ADN tout

Protocole

Voir la table des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, l’équipement et les anticorps. Les procédures sur les animaux ont été utilisées conformément aux directives éthiques du comité d’éthique de l’Université de Tel Aviv après approbation. La procédure est effectuée sur des bébés souris âgés de 10 jours, quel que soit leur sexe. Si nécessaire, le génotypage est effectué la veille à l’aide d’une biopsie de la queue et de méthodes standard. Les solutions sont stériles et conservées à 4 °C, sauf indication contraire ; voir tableau 1.

1. Préparation des cultur....

Discussion

Observations générales
L’avantage majeur du système de culture organotypique est qu’il facilite les études utilisant le tissu du cortex cérébelleux, en préservant son organisation structurelle pendant plusieurs semaines dans la configuration de la boîte de culture. Ce système est utile pour effectuer des analyses morphologiques approfondies des cellules de Purkinje (PC), y compris des examens détaillés des épines dendritiques et des caractéristiques

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature