Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Résumé

Les cellules cérébelleuses de Purkinje (PC) sont particulièrement sensibles aux déficiences de la réponse aux dommages de l’ADN. Un protocole est présenté pour l’évaluation visuelle de la dynamique de la réponse de la PC aux dommages à l’ADN, ce qui implique la coloration des chaînes poly(ADP-ribose) liées aux protéines dans des cultures organotypiques cérébelleuses.

Résumé

Les cellules cérébelleuses de Purkinje (PC) présentent une interaction unique entre des taux métaboliques élevés, une architecture chromatinienne spécifique et une activité transcriptionnelle étendue, ce qui les rend particulièrement vulnérables aux dommages à l’ADN. Cela nécessite une réponse efficace aux dommages de l’ADN (DDR) pour prévenir la dégénérescence cérébelleuse, souvent initiée par un dysfonctionnement ou une perte de PC. Un exemple notable est le syndrome d’instabilité du génome, l’ataxie-télangiectasie (A-T), marqué par une déplétion progressive de la PC et une détérioration cérébelleuse. L’étude des mécanismes de DDR dans les PC est essentielle pour élucider les voies menant à leur dégénérescence dans de tels troubles. Cependant, la complexité de l’isolement et de la culture des PC in vitro a longtemps entravé les efforts de recherche. Les cultures organotypiques cérébelleuses murines (tranches) offrent une alternative réalisable, imitant étroitement l’environnement tissulaire in vivo . Pourtant, ce modèle est limité à des indicateurs DDR se prêtant à l’imagerie microscopique. Nous avons affiné le protocole de culture organotypique, démontrant que l’imagerie fluorescente des chaînes de poly(ADP-ribose) (PAR) liées aux protéines, un indicateur DDR rapide et précoce, révèle efficacement la dynamique de la DDR dans les PC au sein de ces cultures, en réponse au stress génotoxique.

Introduction

L’intégrité de l’ADN cellulaire est constamment menacée par des agents endommageant l’ADN, principalement des sous-produits métaboliques comme les espèces réactives de l’oxygène, qui infligent des dizaines de milliers de lésions d’ADN par cellule chaque jour^. Le maintien persistant de la stabilité du génome est essentiel pour l’homéostasie cellulaire ^2,3. La pierre angulaire de cette maintenance est la réponse aux dommages de l’ADN (DDR) - un réseau de signalisation complexe et stratifié qui initie des voies de réparation spécifiques de l’ADN tout en ajustant soigneusement de nombreux autres processus cellulaires ^4,5. Les déficits en DDR se manifestent généralement par des « syndromes d’instabilité du génome », marqués par une instabilité chromosomique, une détérioration progressive des tissus, une croissance ou un développement altéré, une prédisposition au cancer et une sensibilité accrue à certains agents endommageant l’ADN ^6,7,8,9. Notamment, la neurodégénérescence, qui comprend souvent l’atrophie cérébelleuse, est une caractéristique distincte de nombreux syndromes d’instabilité du génome 7,10,11,12.

La maladie autosomique récessive, l’ataxie-télangiectasie (A-T), est un exemple bien documenté de trouble d’instabilité du génome 13,14,15. Cette condition résulte de mutations nulles dans le gène ATM (A-T, muté), responsable du codage de la protéine kinase pivot, ATM, qui est principalement connue comme un mobilisateur DDR en réponse aux cassures double brin de l’ADN (DSB)^16,17. L’A-T se manifeste par une maladie multisystémique, principalement caractérisée par une dégénérescence cérébelleuse progressive, entraînant des déficiences motrices aiguës, une immunodéficience, une atrophie gonadique, une prédisposition au cancer et une sensibilité extrême aux rayonnements ionisants. Les cellules cultivées d’individus atteints d’A-T présentent une instabilité chromosomique et une sensibilité accrue aux agents génotoxiques, en particulier ceux à l’origine des DSB 15,18,19. Il est important de noter que l’ATM joue également un rôle dans la réparation d’autres lésions de l’ADN, soulignant son importance générale dans le maintien de la stabilité du génome 20,21,22.

Malgré des recherches approfondies sur les nombreux rôles de l’ATM, le mécanisme spécifique conduisant à la dégénérescence cérébelleuse dans l’AT-T reste un sujet de débat actif, avec divers modèles proposés pour élucider ce processus 23,24,25,26,27,28,29,30. Notre modèle²⁸ suggère que la dégénérescence cérébelleuse chez les patients A-T commence par le dysfonctionnement et la perte éventuelle des cellules de Purkinje (PC). Compte tenu du rôle essentiel de l’ATM dans la préservation de la stabilité du génome face aux dommages continus à l’ADN, les PC sont particulièrement vulnérables à l’absence d’ATM. Nous attribuons cette vulnérabilité à la combinaison de leur activité métabolique élevée, de leur structure chromatinienne distinctive et de leur activité transcriptionnelle étendue. En fin de compte, il est suggéré que la perte de la fonction PC, et donc leur dégénérescence, est due à l’inactivation stochastique et fonctionnelle des gènes, une conséquence de la production de transcrits défectueux²⁸.

L’étude de la biologie des PC en laboratoire est entravée par les défis liés à la culture de PC isolés, car ces cellules dépendent fortement de leur milieu naturel et des cellules voisines pour leur survie et leur fonction, ce qui les rend incompatibles avec la croissance des cultures dissociées. Néanmoins, les PC peuvent rester viables pendant de longues périodes dans les cultures de coupes de tissus. Les cultures organotypiques cérébelleuses, qui sont des coupes de tissu généralement dérivées du cervelet de rongeur, maintiennent l’organisation structurelle du tissu et soutiennent diverses manipulations expérimentales analogues à celles possibles avec des cellules cultivées. Par conséquent, ces cultures permettent des études cérébelleuses dans un cadre contrôlé 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Plus précisément, dans le contexte de l’A-T, les cultures organotypiques cérébelleuses murines se sont avérées déterminantes dans l’exploration de la DDR dans les PC déficients en ATM 40,41,42,43. Alors que les souris déficientes en ATM ne présentent qu’un phénotype cérébelleux subtil 44,45,46,47, probablement dû à des différences entre la physiologie cérébelleuse humaine et celle de la souris, l’hypothèse est que les rôles d’ATM sont largement conservés chez ces espèces. Cette notion est étayée par nos observations selon lesquelles la réponse déficiente aux DSB d’ADN dans les PC murins Atm^-/- s’aligne sur celle observée dans d’autres types de cellules murines et humaines ATM/déficientes en ATM 40,41,42,43.

L’une des limites de l’analyse des réponses des PC à divers stimuli ou stress au sein des cultures organotypiques est la nécessité de s’appuyer sur l’imagerie microscopique pour les lectures. La DDR est généralement étudiée à l’aide de lectures biochimiques en vrac, bien que des marqueurs immunofluorescents courants soient également utilisés, tels que le suivi de la dynamique de formation et de résolution des foyers nucléaires de l’histone phosphorylée H2AX (γH2AX) et de la protéine 53BP1, qui sont considérés comme des indicateurs des DSB^48,49. Une mesure plus large est l’imagerie fluorescente de la formation de la chaîne poly(ADP-ribose) (PAR) sur les protéines, une réponse précoce rapide et robuste aux dommages de l’ADN, en particulier aux cassures de brins ^7,50. Nous avons modifié le protocole de Komulainen et ^al.51 pour la coloration PAR dans les cultures organotypiques cérébelleuses. Nous avons observé une réponse PAR prononcée dans les noyaux importants des CP. Nous présentons ici notre protocole affiné pour établir des cultures organotypiques cérébelleuses murines et pour visualiser la réponse PAR sous stress génotoxique.

Protocole

Voir la table des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, l’équipement et les anticorps. Les procédures sur les animaux ont été utilisées conformément aux directives éthiques du comité d’éthique de l’Université de Tel Aviv après approbation. La procédure est effectuée sur des bébés souris âgés de 10 jours, quel que soit leur sexe. Si nécessaire, le génotypage est effectué la veille à l’aide d’une biopsie de la queue et de méthodes standard. Les solutions sont stériles et conservées à 4 °C, sauf indication contraire ; voir tableau 1.

1. Préparation des cultures

REMARQUE : Effectuez la procédure dans un environnement stérile et désinfectez la surface de travail à l’avance avec de l’éthanol à 70%.

1. Ajouter 1 mL de BME dans chaque puits de plaques de 6 puits. À l’aide d’une pince stérile, placez un seul insert de culture cellulaire dans chaque puits et incubez les plaques dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO₂ pendant au moins 2 h avant la procédure de dissection.
2. Installez une zone de dissection à l’intérieur d’un capot biologique, contenant le hachoir à tissus, des plaques de culture de 30 mm, un microscope binoculaire et une source lumineuse.
3. Immergez les outils chirurgicaux dans de l’éthanol à 70 % tout au long du processus. Utilisez un gobelet urinaire rempli de 70% d’éthanol pour l’immersion, et un gobelet urinaire séparé avec 1x PBS pour laver l’éthanol avant utilisation.
4. Pour chaque dissection (c’est-à-dire pour chaque cervelet), préparez deux plaques de culture de 30 mm remplies de milieu de dissection froid et laissez-les sur de la glace.
5. Vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %.
6. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, décapitez rapidement l’animal. Pour exposer le cerveau, faites une petite incision avec des ciseaux en l’éloignant du cervelet. À l’aide d’une pince à épiler aux extrémités arrondies, décollez doucement le crâne. Retirez le crâne en petits morceaux pour éviter d’endommager le tissu cérébelleux.
7. Transférez immédiatement le cerveau dans un milieu de dissection à froid ou retirez directement le cervelet de l’intérieur du crâne. Pour ce faire, exposez le cervelet et séparez le cortex cérébelleux du tronc cérébral en déconnectant les trois paires de pédoncules, à l’aide d’une fine spatule à iris incurvée. Pour identifier les pédoncules, il faut voir du rostral au caudal : les pédoncules cérébelleux supérieurs appariés relient le mésencéphale de chaque côté du cervelet ; les pédoncules cérébelleux moyens appariés relient les boutons de chaque côté du cervelet ; et les pédoncules cérébelleux inférieurs appariés se connectent à la moelle de chaque côté du cervelet. Une fois que le cervelet est visible, séparez-le du cerveau à l’aide de la même spatule : glissez la spatule entre le cervelet, le colliculus supérieur et le tronc cérébral.
   REMARQUE : Ne faites pas d’effort particulier pour enlever les méninges car elles se détachent facilement après que le cervelet a été tranché.
8. Réglez le hachoir à tissus sur une épaisseur de tranche de 350 μm.
9. Avant de positionner le cervelet sur la base du hachoir, retirez l’excès de tampon de dissection du tissu. Cela améliorera l’adhérence du tissu à la base de l’hélicoptère.
10. Positionnez le cervelet sur la plate-forme de coupe dans une orientation verticale et effectuez un tranchage parasagittal à une épaisseur de tranche de 350 μm. Séparez délicatement les tranches à l’aide d’une spatule à iris fine et mettez-les dans un milieu de dissection froid.
11. Transférez le tissu tranché dans un tampon de dissection froid frais. À l’aide d’une pointe de 1 000 μL, guidez délicatement les tranches de tissu dans la boîte contenant un tampon de dissection à froid.
12. Sous les jumelles, utilisez deux spatules d’iris incurvées pour séparer soigneusement les tranches de tissu les unes des autres. Pour les cultures, utilisez des tranches dérivées du vermis cérébelleux situé dans la zone cortico-nucléaire médiale de l’organe.
13. Transférez chaque tranche de tissu sur un insert de culture à l’aide d’une spatule large et déplacez chaque insert en portant une tranche de tissu dans un puits dans les plaques à 6 puits contenant le milieu préchauffé. Laissez les plaques dans l’incubateur.
14. Remplacez le milieu tous les deux jours : aspirez le milieu utilisé à l’aide d’une pipette en verre stérile, et à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, ajoutez 1 ml de MBE frais avec l’extrémité de la pipette appuyée contre la paroi du puits. Assurez-vous de ne pas diriger le flux moyen sur le tissu.
    REMARQUE : La tranche de tissu présentera un aspect inflammatoire pendant les 5 à 7 premiers jours en culture et sera prête pour les expériences dès que ce phénomène disparaîtra et jusqu’à 2 semaines après l’établissement de la culture.

2. Traitement avec des agents endommageant l’ADN, fixation, coloration et imagerie microscopique

1. Ajouter les produits chimiques endommageant l’ADN directement dans le milieu de culture à des concentrations finales appropriées, pendant des durées prédéterminées. Après la période d’exposition, éliminez les produits chimiques en remplaçant le milieu par un milieu de culture frais.
2. Si la lecture DDR implique une coloration PAR, ajoutez un inhibiteur de la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) au milieu de culture à une concentration finale de 10 μM, 30 min avant la fixation.
   REMARQUE : Ce traitement est essentiel car la modification du PAR est de courte durée et continuellement dégradée par le PARG.
3. Immédiatement avant la fixation, aspirez le milieu et remplacez-le par 1 mL de tampon phosphate 0,1 M à température ambiante.
   REMARQUE : Le tampon froid peut provoquer le détachement des tranches de tissu de l’insert.
4. Fixez immédiatement les tranches en remplaçant le tampon par un mélange d’acétone :méthanol prérefroidi (-20 °C) (1:1) de sorte que la tranche de tissu soit immergée dans ce mélange et laissez reposer 20 min à -20 °C.
   REMARQUE : Il est possible d’arrêter à ce stade et de procéder à l’immunocoloration plus tard. Pour ce faire, lavez les mouchoirs 3 fois avec un tampon phosphate 0,1 M prérefroidi à 4 °C, en vous assurant que le mouchoir est immergé dans le tampon. Les mouchoirs peuvent maintenant être stockés dans un tampon phosphate de 0,1 M jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
5. Transférez la tranche de tissu dans un puits dans une assiette de 48 puits.
6. À l’aide d’un scalpel et d’une planche à découper, vous pouvez retirer les bords de l’insert, en coupant autour de la tranche de tissu. Placez chaque tranche dans le puits d’une assiette de 48 puits. Ajouter 100 μL de tampon phosphate 0,1 M.
7. Pour la perméabilisation, aspirer le tampon, ajouter dans le puits 100 μL de tampon phosphate 0,1 M contenant 1 % de Triton X-100, et laisser reposer 5 min à température ambiante.
8. Aspirer la solution et ajouter 100 μL de solution bloquante (voir tableau 1) par puits. Agiter doucement à température ambiante pendant 2 h.
9. Pendant l’étape de blocage, diluer l’anticorps primaire ou le réactif anti-PAR (1:800) dans la solution de blocage.
10. Retirez la solution bloquante (pas besoin de la laver) et ajoutez 100 μL de mélange d’anticorps primaires dans chaque puits. Agitez doucement pendant 2 h à température ambiante.
11. Diluer les anticorps secondaires dans un tampon phosphate 0,1 M contenant 0,2 % de Triton X-100 (1:500) tout en minimisant leur exposition à la lumière.
12. Aspirer la solution d’anticorps primaires et laver les tranches 3 x 5 min avec un tampon phosphate 0,1 M contenant 0,2 % de Triton X-100, à température ambiante, en agitant doucement.
13. Remplacer la solution de lavage par 100 μL de solution d’anticorps secondaires (dilution 1:500). Continuez à agiter doucement pendant 2 h à température ambiante dans l’obscurité (couvrez les plaques de papier d’aluminium).
14. Pour préparer une solution de DAPI, diluez la solution mère (2 mg/mL) à 1 μg/mL dans 1x PBS.
15. Vingt minutes avant la fin de l’incubation de 2 h avec l’anticorps secondaire, ajouter 20 μL de la solution finale de DAPI dans chaque puits et continuer à agiter pendant 20 min. Aspirez le liquide et lavez avec la solution de lavage pendant 3 x 5 min en secouant doucement.
16. Pour le montage, placez le tissu sur une lame de verre de microscope avec le tissu vers le haut, ajoutez un support de montage et couvrez avec un verre de protection. Placez les lames sur une surface plane et laissez-les sécher une nuit dans l’obscurité, à température ambiante (évitez d’utiliser un support de montage contenant du DAPI pour éviter le flou).
17. Conservez les lames à 4 °C dans une boîte étanche à la lumière.
18. Capturez des images microscopiques à l’aide d’un microscope confocal et de filtres appropriés.

Résultats

La figure 1 illustre l’aspect général des cultures organotypiques cérébelleuses. La rangée du haut de la figure 1A montre la foliation cérébelleuse, qui est maintenue en culture, tandis que la rangée du bas montre les PC colorés pour Calbindin D-28k (vert) et les noyaux neuronaux colorés pour NeuN (rouge). Sur la figure 1B, les astrocytes des PC (en rouge) sont colorés pour la GFAP (en ...

Discussion

Observations générales
L’avantage majeur du système de culture organotypique est qu’il facilite les études utilisant le tissu du cortex cérébelleux, en préservant son organisation structurelle pendant plusieurs semaines dans la configuration de la boîte de culture. Ce système est utile pour effectuer des analyses morphologiques approfondies des cellules de Purkinje (PC), y compris des examens détaillés des épines dendritiques et des caractéristiques

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature