JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يبحث هذا البروتوكول في توزيع الكروماتين المتغاير في ثمانية مجموعات من عشب Lycoris aurea (L′Her) ، باستخدام تلطيخ كروموسوم PI و DAPI المشترك ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) مع مناطق جين 18S-5.8-26S rRNA (مناطق 45S rDNA) ، ومجسات الحمض النووي الريبوزومي 5S.

Abstract

لفهم تباين النمط النووي في ثمانية مجموعات سكانية ، تم إنشاء أنماط نواة مفصلة بدقة باستخدام قياسات الكروموسومات ونطاقات التألق وإشارات rDNA FISH. يختلف عدد مواقع 45S rDNA من أزواج إلى خمسة أزواج لكل مجموعة سكانية ، مع الرقم الأكثر شيوعا لكل نمط النووي هو أربعة أزواج. يقع موضع 45S rDNA في الغالب في الأذرع القصيرة والمناطق الطرفية للكروموسومات ، بينما يوجد موضع 5S rDNA بشكل أساسي في الذراع القصيرة والمناطق الطرفية أو القريبة. أظهر السكان HBWF و HHNXN و HBBD و HNZX توزيعا مشابها لمواقع 45S rDNA ، كما فعلت GXTL و HBFC و SCLS ، مما يشير إلى وجود علاقة وثيقة بين السكان الذين لديهم توزيعات مواقع 45S rDNA مماثلة. الأنماط النووية لجميع المجموعات السكانية المدروسة متماثلة ، وتتألف من سنتروميرات مستقرة ومستقرة أو سنتروميرات مستقرة حصريا. تميز المخططات المبعثرة ل MCA و CVCL بشكل فعال هياكلها النمطية النووية. يتضمن التحليل ستة معلمات كمية (x ، 2n ، TCL ، MCA ، CVCL ، CVCI). بالإضافة إلى ذلك ، تشير النتائج إلى أن PCoA بناء على هذه المعلمات الستة هي طريقة قوية لتحديد علاقات النمط النووي البيولوجي بين المجموعات الثمانية. رقم الكروموسوم في مجموعات Lycoris هو x = 6-8. بناء على الدراسة والأدبيات الحالية ، تمت مناقشة التمايز الجيني لهذه المجموعات من حيث حجم الجينوم ، والكروماتين المتغاير ، ومواقع 45S و 5S rDNA ، وعدم تناسق النمط النووي.

Introduction

Lycoris هي عائلة تضم العديد من النباتات البستانية المهمة1. Lycoris aurea (L'Hér.) عشب. هو نبات طبي صيني تقليدي له تاريخ طويل. أظهر التحليل الكيميائي النباتي أن Lycoris aurea (L′Her.) عشب يحتوي على galantamine وغيرها من قلوانيات, التي يمكن أن تعزز حساسية الأستيل ولديها القدرة على علاج مرض الزهايمر كمثبطات الكولينستراز2.

في النباتات العليا ، يعد تحليل النمط النووي أمرا بالغ الأهمية لدمج الخرائط الجينية والفيزيائية ، مع آثار عملية كبيرة على بيولوجيا النبات. يسمح هذا التحليل بتوصيف الجينوم على مستوى الكروموسومات ، وتوضيح العلاقات التصنيفية الخلوية بين السكان ، وتحديد الانحرافات الجينية ، وفهم اتجاهات تطور الكروموسومات3،4،5. عادة ما يتضمن وصف النمط النووي عدد الكروموسوم ، وأطوال الكروموسومات المطلقة والنسبية ، ومواقع الانقباض الأولية والثانوية ، وتوزيع الشظايا غير المتجانسة ، وأرقام مواقع الحمض النووي ومواقعه ، وخصائص تسلسل الحمض النووي الأخرى ، بالإضافة إلى عدم تناسق النمط النووي6،7،8. من بين معلمات النمط النووي ، يتم تحديد عدم التناسق من خلال الاختلافات في طول الكروموسوم (عدم التناسق بين الكروموسومات) وموضع السنترومير (عدم التناسق داخل الكروموسومات). عدم تناسق النمط النووي هو ميزة مهمة تعكس مورفولوجيا الكروموسوم ويستخدم على نطاق واسع في تصنيف الخلاياالنباتية 9،10،11،12.

في كثير من الأحيان ، يحد عدم وجود علامات كروموسوم من تحليل النمط النووي ويعيق تحديد الكروموسومات الفردية. في السنوات الأخيرة ، أصبح تلطيخ Giemsa ، والنطاقات المضان ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) شائعا في تحليل كروموسوم النبات. تكشف طرق تلطيخ الفلورسنت المزدوج ، مثل تلطيخ CMA (كرومومايسين A3) / DAPI (4 ، 6-diamino-2-phenylindole) وتلوين PI (بروبيل يوديد) / DAPI (المعروف باسم تلطيخ CPD) ، عن مناطق غير متجانسة غنية ب GC وغنية ب AT على الكروموسومات4،13. أثناء الطور الطوري أو الباشيتين من الانقسام النباتي ، يمكن أن تولد تسلسلات الحمض النووي المتكررة أو مقاطع الحمض النووي الطويلة إشارات محددة في مجموعات النباتات من خلال تهجين الأسماك14،15،16.

توفر نطاقات الفلورسنت وإشارات FISH علامات مفيدة لتحديد الكروموسومات. من خلال قياس طول الكروموسوم ، وتحليل خصائص النطاقات الفلورية ، ومقارنة اختلافات إشارة FISH ، يمكن بناء الأنماط اللونية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لالأصول الوراثية النباتية المختلفة أو التجمعات. تعرض هذه الأنماط النووية بشكل فعال مورفولوجيا الكروموسوم في العديد من الأصول الوراثية أو المجموعات السكانية ، مما يتيح إجراء مقارنات بين توزيع الكروماتين غير المتجانس وتوطين تسلسل الحمض النووي ويشجع على إجراء مزيد من البحث4،8،17. يمكن أن تقدم مقارنات النمط النووي الخلوي الجزيئي رؤى قيمة حول العلاقات التطورية والتطور الكروموسومي للمجموعات السكانية ذات الصلة8،14،18،19.

يشتهر جنس Lycoris ، وهي مجموعة متنوعة ومثيرة للاهتمام ضمن عائلة Amaryllis ، بمصابيحها المعمرة. يتألف من ما يقرب من 20 نوعا ، 15 منها مستوطنة في الصين ، ويعرض التنوع البيولوجي الغني. تم العثور على هذا الجنس حصريا في المناطق المعتدلة وشبه الاستوائية الدافئة في شرق آسيا ، بما في ذلك جنوب غرب الصين وجنوب كوريا واليابان ، مع عدد قليل من السكان الممتد إلى شمال الهند ونيبال20. تضمنت الدراسات الوراثية الخلوية المبكرة في المقام الأول عد الكروموسومات لتحديد عدد الكروموسوم الأساسي للجنس ووصف مورفولوجيا الكروموسوم في مجموعات سكانية محددة ، مع التركيز بشكل كبير على Lycoris radiata21. تتراوح الأعداد الإجمالية للكروموسومات التي لوحظت في هذا الجنس من 12 إلى 33 أو 44 ، تمثل مستويات ثنائي الصبغيات ، ثنائي الصبغيات غير طبيعي ، ثلاثي الصبغيات ، رباعي الصبغيات ، واختلال الصيغة الصبغية ، على التوالي. أرقام الكروموسومات الأساسية ، x ، هي 6 و 7 و 8 و 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) يتم توزيع الأعشاب ، وهي نوع بارز ضمن جنس Lycoris ، على نطاق واسع في جميع أنحاء الصين22. يزدهر في البيئات المريحة والرطبة ويتكاثر من خلال المصابيح الصغيرة. تم استخدام هذه المصابيح ، التي تحتوي على الليكورين والجالانتامين - وهما مركبان طبيان رئيسيان - في الطب الصيني التقليدي لعدة قرون. يأسر Lycoris aurea أيضا علماء البستنة بأزهاره الحمراء المدهشة في الخريف وأوراقها دائمة الخضرة في الشتاء. ومع ذلك ، فإن التشابه المورفولوجي عبر جميع موارد Lycoris aurea التي تمت دراستها (L'Hér.) تمثل مجموعات الأعشاب تحديا كبيرا لتحديد الكروموسومات باستخدام الطرق الخلوية التقليدية.

تم استخدام استنساخ FISH أو fosmid أو BAC (الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية) مع تسلسل الحمض النووي المتكرر ومجسات قليل النوكليوتيدات على الطور الطور أو الكروموسومات المخادمة لتحليل النمط النووي23،24،25 ، والتحليل الوراثي الخلويالمقارن 26،27 ، وبناء الخريطة الوراثيةالخلوية 28،29 ، والمقايسات الخاصةبالكروموسوم 30. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق تقنية FISH على تحليل الكروموسوم لمجموعات Lycoris 31. على الرغم من أن عدد الكروموسوم والنمط النووي يختلفان في مجموعات Lycoris ، إلا أن إجمالي عدد الكروموسوم يظل ثابتا ، مع ملاحظة ثلاثة أنواع أساسية: كروموسوم السنترومير المركزي المركزي (M-) ، وكروموسوم السنترومير البعيد (T-) ، وكروموسوم السنترومير القريب (A-). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت أشكال وأحجام كروموسومات متنوعة في التجمعات الطبيعية32.

يعد مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموضعي (FISH) مفيدا للكشف عن التغيرات الكروموسومية ، مثل اندماج السنترومير ، والانعكاس ، وتضخيم الجينات ، وحذف الشظايا. تتيح تقنية التهجين الموضعي الفلوري (RNA-FISH) تحليلا بصريا عالي الدقة للكروموسومات لاكتشاف وتحديد العديد من التغييرات المعقدة ، بما في ذلك اندماج المناطق المركزية للكروموسومات ، وتكوين هياكل كروموسومات جديدة ، وانعكاس مناطق الكروموسومات ، وتضخيم الجينات أو شظايا الجينات ، وفقدان تسلسل الجينات في مناطق كروموسومات معينة33. أظهرت خمسة من 500 نسخة إشارات FISH قوية على منطقة السنترومير لكروموسوم السنترومير المركزي (M-) ولكن ليس على كروموسوم السنترومير البعيد (T-) 34. مكن نمط توزيع إشارة FISH الفريد على كل كروموسوم من تحديد الكروموسومات الفردية ، والتي كانت تمثل تحديا سابقا في مجموعات Lycoris باستخدام طرق التلوينالتقليدية 31. حاليا ، هناك عدد قليل من الدراسات حول علم الوراثة الخلوية الجزيئي ل Lycoris aurea (L'Hér.) Herb ، مؤكدا الحاجة الملحة لمزيد من البحث في هذا المجال.

في هذه الدراسة ، ثمانية كروموسومات متطورة جيدة التمايز من Lycoris aurea (L'Hér.) تم تحضير مجموعات الأعشاب باستخدام طرق الغمر بالإنزيم والتجفيف باللهب (EMF). تم استخدام تلطيخ CPD ومجسات 45S و 5S rDNA لتحديد FISH. تم إنشاء الأنماط النووية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لهذه المجموعات باستخدام بيانات مجمعة من قياسات الكروموسومات والنطاقات الفلورية وإشارات 45S و 5S rDNA FISH. تم حساب ستة مؤشرات مختلفة لعدم تناسق النمط النووي لكل مجموعة سكانية لتحديد العلاقات النمطية النووية فيما بينها. قدم تقييم بيانات النمط النووي الجزيئي الخلوي رؤى مهمة حول التمايز الجيني والعلاقات التطورية للمجموعات الثمانية ، مما قد يعيد تشكيل فهم كروموسومات Lycoris .

Protocol

تم تفصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد ، بينما يتم توفير المجسات المستخدمة في الملف التكميلي 1.

1. تحضير الكروموسومات القمية

  1. تتجذر عن طريق الزراعة المائية. بعد إزالة الجزء الموجود فوق سطح الأرض من المصباح ، ضعه في زجاجة مدببة مملوءة بالماء ، واستبدل الماء كل 3 أيام ، باتباع الطريقة التي وصفها Song et al.35.
  2. استئصال أطراف الجذور التي تنمو بنشاط عندما يصل طولها إلى حوالي 1.0-2.0 سم ومعالجتها في α-برومونافثالين المشبع عند 28 درجة مئوية لمدة 1.0 ساعة.
  3. اقطع أطراف الجذر إلى حوالي 1 سم وضعها في خليط طازج من الميثانول وحمض الخليك الجليدي بنسبة حجم 3: 1 في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية) لمدة 2-3 ساعات. بعد ذلك ، قم بتخزينها في ثلاجة عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح من قبل She et al.36.
  4. اغسل أطراف الجذر الثابتة (2-3 مم) جيدا في ماء مقطر مزدوج.
  5. تحضير خليط من السليولاز والبكتين هيدرولاز في 0.01 ملي مولار من حامض الستريك وسيترات الصوديوم عند درجة الحموضة 4.5 ، مع السليولاز والبكتين هيدرولاز لكل منهما بنسبة 1٪. ضع أطراف الجذر المعالجة مسبقا في الخليط وهضمها عند 28 درجة مئوية لمدة 1.0-1.5 ساعة.
  6. اغسل أطراف الجذر المهضومة بالماء المقطر المزدوج ، وانقلها إلى شريحة زجاجية ، واهرسها جيدا باستخدام المثبت باستخدام ملقط مدبب ناعم.
  7. جفف الشرائح على لهب مصباح الكحول حتى يختفي رذاذ الماء. تحت مجهر تباين الطور ، حدد الشرائح التي تحتوي على أكثر من خمس مراحل منقسمة ولا توجد كروموسومات متداخلة. قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

2. تلطيخ CPD

  1. قم بإعداد محلول CPD عن طريق إضافة PI و DAPI إلى مخفف مضاد للمضان بنسبة 30٪ (v / v) ، حيث يكون تركيز PI 0.6 ميكروغرام · مل لتر -1 وتركيز DAPI هو 3 ميكروغرام · مل لتر -1.
  2. جفف شريحة الكروموسوم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من مخفف RNase A (محلول تخزين RNase A مخفف 100 مرة باستخدام 2x SSC (سترات الصوديوم المالحة) ، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل) لكل شريحة كروموسوم. قم بتغطية الشريحة وتسخينها في حجرة رطبة 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  4. اغسل شريحة الكروموسوم ب 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث فترات مدة كل منها 5 دقائق.
  5. اغسل شريحة الكروموسوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
  6. أضف 200 ميكرولتر من مخفف البيبسين (محلول تخزين البيبسين المخفف 100 مرة مع 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل) لكل شريحة كروموسوم. قم بتغطية الشريحة واحتضانها في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-20 دقيقة.
  7. اغسل أقسام الكروموسوم بالماء فائق النقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، متبوعا بالغسيل ب 2 xSSC في درجة حرارة الغرفة لفترتين مدة كل منهما 5 دقائق.
  8. إصلاح الشرائح بالميثانول: محلول حمض الخليك الجليدي (3: 1) لمدة 10 دقائق.
  9. يغسل ب 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث فترات مدة كل منها 5 دقائق.
  10. عالجها بنسبة 70٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ثم جففها في درجة حرارة الغرفة.
  11. خذ شرائح الكروموسوم المعالجة والمجففة ، وأضف 30 ميكرولتر من محلول تلطيخ CPD إلى كل شريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء 24 مم × 50 مم ، وقم بالبقعة في الظلام لأكثر من 30 دقيقة. يجب تلطيخ مادة الكروموسوم الواسعة بين عشية وضحاها.
  12. راقب شرائح الكروموسوم تحت المجهر الفلوري ، باستخدام مرشح الإثارة الأخضر (WG) لتلوين PI ومرشح الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتلوين DAPI. التقط الصور باستخدام البرنامج المتوافق.
    1. اضبط وقت التعرض من خلال المرشحين لتحقيق شدة مضان متشابهة باللونين الأحمر والأزرق أثناء التقاط الصورة. يتم الحصول على صورة CPD من الصور ذات التدرج الرمادي الملطخة ب PI و DAPI. تم إجراء قياسات الكروموسوم ومعالجة الصور باستخدام برنامج Adobe Photoshop.

3. التهجين الفلوري في الموقع

  1. تحضير المحلول الهجين: FAD (10 ميكرولتر) ، ssDNA (2 ميكرولتر) ، 20× SSC (2 ميكرولتر) ، 5S rDNA (1 ميكرولتر) ، 45S rDNA (1 ميكرولتر) ، و 50٪ كبريتات جلوكان (4 ميكرولتر). بعد التحضير ، قم بالطرد المركزي للمحلول الهجين (2500 × جم ، 5-10 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة) وضعه على الجليد.
  2. ضع الشرائح الممسوحة ضوئيا في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  3. قم بإزالة الشرائح المخبوزة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول تمسخ FAD بنسبة 70٪ ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي ، وقم بتشويه في فرن تهجين جزيئي 85 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة.
  4. قم بإزالة زجاج الغطاء واغمر الشرائح على الفور في 70٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول البارد ، مع تجفيف التجفيف على التوالي لمدة 5 دقائق لكل منها.
  5. قم بإزالة الشرائح واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 30 دقيقة.
  6. أضف 20 ميكرولتر من المحلول الهجين إلى الشريحة ، ضع زجاج الغطاء برفق في الأعلى حتى ينتشر السائل تماما ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لترطيب المنطقة المغطاة من الشريحة.
  7. ضع الشرائح في طبق هجين مبلل ب 2× SSC (يجب أن يكون الطبق الهجين عبارة عن طبق بتري كبير بغطاء ملفوف بورق قصدير لتسهيل التشغيل بعيدا عن الضوء) واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل (لمدة 6 ساعات على الأقل).
  8. قم بمكافحة تلطيخ الكروموسومات عن طريق تركيبها باستخدام 3 ميكروغرام مللي -1 DAPI في محلول 30٪ (حجم حجم / حجم) من Vectashield H-100. التقط الصورة باستخدام برنامج متوافق ، مع التألق الأزرق ل DAPI متحمس للضوء الأرجواني للمرشح والتألق الأحمر ل PI المتحمس للضوء الأخضر ، على التوالي.
    ملاحظة: تم إجراء تهجين FISH باستخدام مجسات 45S و 5S rDNA على شرائح ملطخة سابقا ب CPD ، باتباع الطريقة التي وصفتها She et al.36.

4. تحليل النمط النووي

  1. حدد خمس خلايا انقسامية الطور لكل مجموعة تضم تكون فيها الكروموسومات مشتتة جيدا (بدون تداخل) ومكثفة بشكل معتدل (لا ينبغي تجميع الكروموسومات إلى أقصى حد ، ولكن لا ينبغي أن تتكتل الأطراف معا) ، باتباع المنهجية التي وصفتها She et al.4.
  2. حدد الطول المطلق لكل كروموسوم عن طريق اختيار خمسة كروموسومات ذات أعلى تركيز أثناء انقسام الخلية.
  3. قم بقياس طول الذراع الطويلة (L) والذراع القصيرة (S) لكل كروموسوم بدقة ودقة ، بالإضافة إلى حجم كل شريط صبغي فلوري على الكروموسوم.
  4. احسب المعلمات التالية: (1) طول الكروموسوم النسبي (RL ، النسبة المئوية أحادية الصيغة الصبغية) ؛ (2) نسبة الذراع (AR = L / S ، الذراع الطويلة / الذراع القصير) ؛ (3) إجمالي طول الكروموسوم أحادي الصيغة الصبغية (TCL ؛ طول النمط النووي) ؛ (4) متوسط طول الكروموسوم (C) ؛ (5) حجم الشريط الفلوري (النسبة المئوية لشريط التألق بالنسبة لطول الكروموسوم) ؛ (6) المسافة من السنترومير إلى موقع الحمض النووي الريبي. (7) متوسط مؤشر السنترومير (CI ، محسوبا على أنه طول الذراع القصير لكل كروموسوم مقسوما على الطول الإجمالي لهذا الكروموسوم ، ثم حساب متوسط هذه القيم) ؛ (8) أربعة مؤشرات مختلفة لعدم تناسق النمط النووي ، بما في ذلك مؤشر السنترومير (CVCI) ، ومعامل التباين (CV) ، ومعامل طول طول الكروموسوم (CVCL) ، ومتوسط معامل عدم تناسق السنترومير (MCA) ، وفئة عدم تناسق ستيبينز.
    ملاحظة: راجع طرق Paszko10 و Peruzzi et al.11 لحساب مؤشر عدم التناسق. تصنيف الكروموسومات بنسب ذراع مختلفة وفقا لطرق تصنيف ليفان الخمس. رتب كروموسومات Lycoris aurea (L'Hér.) عشب بترتيب تنازلي من الطول كما هو موضح في هان وآخرون بروتوكول37.
  5. تأكد من دقة ودقة المنهجية من خلال رسم أنماط النمط النووي للكروموسوم بناء على بيانات قياس الكروموسوم جنبا إلى جنب مع معلومات النطاق الفلوري وموضع وحجم rDNA-FISH.
  6. يعد تصور العلاقات غير المتكافئة للنمط النووي للمجموعات السكانية الثمانية خطوة أساسية توفر رؤى واضحة. يتم تحقيق ذلك من خلال مخططات مبعثرة ثنائية الأبعاد ، والتي تستخدم للحصول على MCA و CVCL.
  7. قم بإجراء تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) باستخدام معامل تشابه Gower ، وهو مكون حاسم ، باتباع طرق She et al.38.
  8. احسب ستة معلمات كمية (x ، 2n ، TCL ، MCA ، CVCL ، CVCI) لتحديد الأنماط النووية الوراثية الخلوية للمجموعات الثمانية.
  9. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج تحليل البيانات والتصور لإنشاء مخطط الشجيرات المستند إلى UPGMA ومخطط مبعثر PCoA.

النتائج

من خلال استخدام طريقة الغمر الدقيق بالإنزيم وتجفيف اللهب (EMF) ، فإن كروموسومات الطور المتناثرة والمتمايزة جيدا من Lycoris aurea (L'Hér.) تم الحصول على العشب ، وتم بناء النمط النووي للكروموسوم الوراثي الخلوي ل Lycoris aurea (الشكل 1). كروموسومات الطور الحاد ذات أ...

Discussion

تحضير Lycoris aurea (L'Hér.) تتضمن كروموسومات جذر الأعشاب عدة خطوات حاسمة: (1) زراعة الجذور عن طريق الزراعة المائية ، (2) معالجة أطراف الجذر ب α-bromonaphthalene المشبع ، (3) تثبيت الجذور باستخدام محلول حمض الكحول الخليك ، (4) إجراء التحلل المائي الأنزيمي على أطراف الجذر بمحلول إنزيمي ، و ...

Disclosures

وأعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (32070367).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

References

  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729 (2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508 (2021).
  6. Levin, D. A. . The role of chromosomal change in plant evolution. , 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. . Chromosomal evolution in higher plants. , (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85 (2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795 (2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18 (2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028 (2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Lycoris Aurea RDNA FISH 45S RDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved