A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يبحث هذا البروتوكول في توزيع الكروماتين المتغاير في ثمانية مجموعات من عشب Lycoris aurea (L′Her) ، باستخدام تلطيخ كروموسوم PI و DAPI المشترك ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) مع مناطق جين 18S-5.8-26S rRNA (مناطق 45S rDNA) ، ومجسات الحمض النووي الريبوزومي 5S.
لفهم تباين النمط النووي في ثمانية مجموعات سكانية ، تم إنشاء أنماط نواة مفصلة بدقة باستخدام قياسات الكروموسومات ونطاقات التألق وإشارات rDNA FISH. يختلف عدد مواقع 45S rDNA من أزواج إلى خمسة أزواج لكل مجموعة سكانية ، مع الرقم الأكثر شيوعا لكل نمط النووي هو أربعة أزواج. يقع موضع 45S rDNA في الغالب في الأذرع القصيرة والمناطق الطرفية للكروموسومات ، بينما يوجد موضع 5S rDNA بشكل أساسي في الذراع القصيرة والمناطق الطرفية أو القريبة. أظهر السكان HBWF و HHNXN و HBBD و HNZX توزيعا مشابها لمواقع 45S rDNA ، كما فعلت GXTL و HBFC و SCLS ، مما يشير إلى وجود علاقة وثيقة بين السكان الذين لديهم توزيعات مواقع 45S rDNA مماثلة. الأنماط النووية لجميع المجموعات السكانية المدروسة متماثلة ، وتتألف من سنتروميرات مستقرة ومستقرة أو سنتروميرات مستقرة حصريا. تميز المخططات المبعثرة ل MCA و CVCL بشكل فعال هياكلها النمطية النووية. يتضمن التحليل ستة معلمات كمية (x ، 2n ، TCL ، MCA ، CVCL ، CVCI). بالإضافة إلى ذلك ، تشير النتائج إلى أن PCoA بناء على هذه المعلمات الستة هي طريقة قوية لتحديد علاقات النمط النووي البيولوجي بين المجموعات الثمانية. رقم الكروموسوم في مجموعات Lycoris هو x = 6-8. بناء على الدراسة والأدبيات الحالية ، تمت مناقشة التمايز الجيني لهذه المجموعات من حيث حجم الجينوم ، والكروماتين المتغاير ، ومواقع 45S و 5S rDNA ، وعدم تناسق النمط النووي.
Lycoris هي عائلة تضم العديد من النباتات البستانية المهمة1. Lycoris aurea (L'Hér.) عشب. هو نبات طبي صيني تقليدي له تاريخ طويل. أظهر التحليل الكيميائي النباتي أن Lycoris aurea (L′Her.) عشب يحتوي على galantamine وغيرها من قلوانيات, التي يمكن أن تعزز حساسية الأستيل ولديها القدرة على علاج مرض الزهايمر كمثبطات الكولينستراز2.
في النباتات العليا ، يعد تحليل النمط النووي أمرا بالغ الأهمية لدمج الخرائط الجينية والفيزيائية ، مع آثار عملية كبيرة على بيولوجيا النبات. يسمح هذا التحليل بتوصيف الجينوم على مستوى الكروموسومات ، وتوضيح العلاقات التصنيفية الخلوية بين السكان ، وتحديد الانحرافات الجينية ، وفهم اتجاهات تطور الكروموسومات3،4،5. عادة ما يتضمن وصف النمط النووي عدد الكروموسوم ، وأطوال الكروموسومات المطلقة والنسبية ، ومواقع الانقباض الأولية والثانوية ، وتوزيع الشظايا غير المتجانسة ، وأرقام مواقع الحمض النووي ومواقعه ، وخصائص تسلسل الحمض النووي الأخرى ، بالإضافة إلى عدم تناسق النمط النووي6،7،8. من بين معلمات النمط النووي ، يتم تحديد عدم التناسق من خلال الاختلافات في طول الكروموسوم (عدم التناسق بين الكروموسومات) وموضع السنترومير (عدم التناسق داخل الكروموسومات). عدم تناسق النمط النووي هو ميزة مهمة تعكس مورفولوجيا الكروموسوم ويستخدم على نطاق واسع في تصنيف الخلاياالنباتية 9،10،11،12.
في كثير من الأحيان ، يحد عدم وجود علامات كروموسوم من تحليل النمط النووي ويعيق تحديد الكروموسومات الفردية. في السنوات الأخيرة ، أصبح تلطيخ Giemsa ، والنطاقات المضان ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) شائعا في تحليل كروموسوم النبات. تكشف طرق تلطيخ الفلورسنت المزدوج ، مثل تلطيخ CMA (كرومومايسين A3) / DAPI (4 ، 6-diamino-2-phenylindole) وتلوين PI (بروبيل يوديد) / DAPI (المعروف باسم تلطيخ CPD) ، عن مناطق غير متجانسة غنية ب GC وغنية ب AT على الكروموسومات4،13. أثناء الطور الطوري أو الباشيتين من الانقسام النباتي ، يمكن أن تولد تسلسلات الحمض النووي المتكررة أو مقاطع الحمض النووي الطويلة إشارات محددة في مجموعات النباتات من خلال تهجين الأسماك14،15،16.
توفر نطاقات الفلورسنت وإشارات FISH علامات مفيدة لتحديد الكروموسومات. من خلال قياس طول الكروموسوم ، وتحليل خصائص النطاقات الفلورية ، ومقارنة اختلافات إشارة FISH ، يمكن بناء الأنماط اللونية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لالأصول الوراثية النباتية المختلفة أو التجمعات. تعرض هذه الأنماط النووية بشكل فعال مورفولوجيا الكروموسوم في العديد من الأصول الوراثية أو المجموعات السكانية ، مما يتيح إجراء مقارنات بين توزيع الكروماتين غير المتجانس وتوطين تسلسل الحمض النووي ويشجع على إجراء مزيد من البحث4،8،17. يمكن أن تقدم مقارنات النمط النووي الخلوي الجزيئي رؤى قيمة حول العلاقات التطورية والتطور الكروموسومي للمجموعات السكانية ذات الصلة8،14،18،19.
يشتهر جنس Lycoris ، وهي مجموعة متنوعة ومثيرة للاهتمام ضمن عائلة Amaryllis ، بمصابيحها المعمرة. يتألف من ما يقرب من 20 نوعا ، 15 منها مستوطنة في الصين ، ويعرض التنوع البيولوجي الغني. تم العثور على هذا الجنس حصريا في المناطق المعتدلة وشبه الاستوائية الدافئة في شرق آسيا ، بما في ذلك جنوب غرب الصين وجنوب كوريا واليابان ، مع عدد قليل من السكان الممتد إلى شمال الهند ونيبال20. تضمنت الدراسات الوراثية الخلوية المبكرة في المقام الأول عد الكروموسومات لتحديد عدد الكروموسوم الأساسي للجنس ووصف مورفولوجيا الكروموسوم في مجموعات سكانية محددة ، مع التركيز بشكل كبير على Lycoris radiata21. تتراوح الأعداد الإجمالية للكروموسومات التي لوحظت في هذا الجنس من 12 إلى 33 أو 44 ، تمثل مستويات ثنائي الصبغيات ، ثنائي الصبغيات غير طبيعي ، ثلاثي الصبغيات ، رباعي الصبغيات ، واختلال الصيغة الصبغية ، على التوالي. أرقام الكروموسومات الأساسية ، x ، هي 6 و 7 و 8 و 11.
Lycoris aurea (L'Hér.) يتم توزيع الأعشاب ، وهي نوع بارز ضمن جنس Lycoris ، على نطاق واسع في جميع أنحاء الصين22. يزدهر في البيئات المريحة والرطبة ويتكاثر من خلال المصابيح الصغيرة. تم استخدام هذه المصابيح ، التي تحتوي على الليكورين والجالانتامين - وهما مركبان طبيان رئيسيان - في الطب الصيني التقليدي لعدة قرون. يأسر Lycoris aurea أيضا علماء البستنة بأزهاره الحمراء المدهشة في الخريف وأوراقها دائمة الخضرة في الشتاء. ومع ذلك ، فإن التشابه المورفولوجي عبر جميع موارد Lycoris aurea التي تمت دراستها (L'Hér.) تمثل مجموعات الأعشاب تحديا كبيرا لتحديد الكروموسومات باستخدام الطرق الخلوية التقليدية.
تم استخدام استنساخ FISH أو fosmid أو BAC (الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية) مع تسلسل الحمض النووي المتكرر ومجسات قليل النوكليوتيدات على الطور الطور أو الكروموسومات المخادمة لتحليل النمط النووي23،24،25 ، والتحليل الوراثي الخلويالمقارن 26،27 ، وبناء الخريطة الوراثيةالخلوية 28،29 ، والمقايسات الخاصةبالكروموسوم 30. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق تقنية FISH على تحليل الكروموسوم لمجموعات Lycoris 31. على الرغم من أن عدد الكروموسوم والنمط النووي يختلفان في مجموعات Lycoris ، إلا أن إجمالي عدد الكروموسوم يظل ثابتا ، مع ملاحظة ثلاثة أنواع أساسية: كروموسوم السنترومير المركزي المركزي (M-) ، وكروموسوم السنترومير البعيد (T-) ، وكروموسوم السنترومير القريب (A-). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت أشكال وأحجام كروموسومات متنوعة في التجمعات الطبيعية32.
يعد مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموضعي (FISH) مفيدا للكشف عن التغيرات الكروموسومية ، مثل اندماج السنترومير ، والانعكاس ، وتضخيم الجينات ، وحذف الشظايا. تتيح تقنية التهجين الموضعي الفلوري (RNA-FISH) تحليلا بصريا عالي الدقة للكروموسومات لاكتشاف وتحديد العديد من التغييرات المعقدة ، بما في ذلك اندماج المناطق المركزية للكروموسومات ، وتكوين هياكل كروموسومات جديدة ، وانعكاس مناطق الكروموسومات ، وتضخيم الجينات أو شظايا الجينات ، وفقدان تسلسل الجينات في مناطق كروموسومات معينة33. أظهرت خمسة من 500 نسخة إشارات FISH قوية على منطقة السنترومير لكروموسوم السنترومير المركزي (M-) ولكن ليس على كروموسوم السنترومير البعيد (T-) 34. مكن نمط توزيع إشارة FISH الفريد على كل كروموسوم من تحديد الكروموسومات الفردية ، والتي كانت تمثل تحديا سابقا في مجموعات Lycoris باستخدام طرق التلوينالتقليدية 31. حاليا ، هناك عدد قليل من الدراسات حول علم الوراثة الخلوية الجزيئي ل Lycoris aurea (L'Hér.) Herb ، مؤكدا الحاجة الملحة لمزيد من البحث في هذا المجال.
في هذه الدراسة ، ثمانية كروموسومات متطورة جيدة التمايز من Lycoris aurea (L'Hér.) تم تحضير مجموعات الأعشاب باستخدام طرق الغمر بالإنزيم والتجفيف باللهب (EMF). تم استخدام تلطيخ CPD ومجسات 45S و 5S rDNA لتحديد FISH. تم إنشاء الأنماط النووية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لهذه المجموعات باستخدام بيانات مجمعة من قياسات الكروموسومات والنطاقات الفلورية وإشارات 45S و 5S rDNA FISH. تم حساب ستة مؤشرات مختلفة لعدم تناسق النمط النووي لكل مجموعة سكانية لتحديد العلاقات النمطية النووية فيما بينها. قدم تقييم بيانات النمط النووي الجزيئي الخلوي رؤى مهمة حول التمايز الجيني والعلاقات التطورية للمجموعات الثمانية ، مما قد يعيد تشكيل فهم كروموسومات Lycoris .
تم تفصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد ، بينما يتم توفير المجسات المستخدمة في الملف التكميلي 1.
1. تحضير الكروموسومات القمية
2. تلطيخ CPD
3. التهجين الفلوري في الموقع
4. تحليل النمط النووي
من خلال استخدام طريقة الغمر الدقيق بالإنزيم وتجفيف اللهب (EMF) ، فإن كروموسومات الطور المتناثرة والمتمايزة جيدا من Lycoris aurea (L'Hér.) تم الحصول على العشب ، وتم بناء النمط النووي للكروموسوم الوراثي الخلوي ل Lycoris aurea (الشكل 1). كروموسومات الطور الحاد ذات أ...
تحضير Lycoris aurea (L'Hér.) تتضمن كروموسومات جذر الأعشاب عدة خطوات حاسمة: (1) زراعة الجذور عن طريق الزراعة المائية ، (2) معالجة أطراف الجذر ب α-bromonaphthalene المشبع ، (3) تثبيت الجذور باستخدام محلول حمض الكحول الخليك ، (4) إجراء التحلل المائي الأنزيمي على أطراف الجذر بمحلول إنزيمي ، و ...
وأعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (32070367).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737-0005 | (70%, 90%, 100%) |
1× TNT | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B548108 | 1×, 10× |
2× SSC | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B548109 | 2×, 20× |
45S rDNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends) | |
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607303 | 20ml |
5S rDNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 5 'end plus 6-FAM(FITC) | |
Adobe Photoshop software | Adobe Systems Incorporated | CS6 | |
Alpha bromo-naphthalene | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A602718 | Saturation |
Anti-burnout agent | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Vectashield H-1000 | 10 mL |
Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | LRH-70 | |
Cellulase | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A426068 | 10 g |
Citric acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501702 | 10 g |
Deionized formamide (FAD) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600211-0500 | 0.7 |
Dextran sulfate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A428229 | 10 mL |
Fluorescence in situ hybridization instrument | USA/Abbott ThermoBrite | S500-24 | |
Fluorescence microscope | Olympus China Co.ltd | BX60 | |
Glacial acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | 500 mL |
HCl | Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai) | H399657 | 500 mL |
Ice machine | Dan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd. | ST-70 | |
Leica biological microscope | Germany Leica Instrument Co., LTD | DM6000B | |
Methyl alcohol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A601617 | 500 mL |
MetMorph software | Molecular Devices | Version 7.35 | |
Oven | Thermo Scientific™ Heratherm™ | THM#51028152 | |
Pectinase | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A004297 | 10 g |
Pepsin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 1.07185 | 100 g |
Propidium iodide(PI) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A425259 | 1 g |
RNaseA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | R4642 | 10 mg |
Salmon sperm DNA(ssDNA) | Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai) | D119871 | 1 g |
Sodium citrate | Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai) | S189183 | 10 g |
Statistica for Windows 10.0 | for statistical analysis |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved