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Resumen

Este protocolo investiga la distribución de heterocromatina en ocho poblaciones de hierba Lycoris aurea (L'Her), utilizando tinción combinada de cromosomas PI y DAPI, hibridación fluorescente in situ (FISH) con regiones del gen 18S-5.8-26S rRNA (regiones 45S rDNA) y sondas de ADN ribosómico 5S.

Resumen

Para comprender la variación del cariotipo en ocho poblaciones, se establecieron meticulosamente cariotipos detallados utilizando mediciones cromosómicas, bandas de fluorescencia y señales FISH de ADNr. El número de sitios de ADNr 45S varía de uno a cinco pares por población, siendo el número más común por cariotipo cuatro pares. El locus de ADNr 45S se localiza predominantemente en los brazos cortos y las regiones terminales de los cromosomas, mientras que el locus de ADNr 5S se encuentra principalmente en el brazo corto y en las regiones terminales o proximales. Las poblaciones HBWF, HNXN, HBBD y HNZX mostraron una distribución similar de sitios de ADNr 45S, al igual que GXTL, HBFC y SCLS, lo que indica una estrecha relación entre poblaciones con distribuciones similares de sitios de ADNr 45S. Los cariotipos de todas las poblaciones estudiadas son simétricos, comprendiendo centrómeros estables y metaestables o centrómeros exclusivamente estables. Los diagramas de dispersión de MCA y CVCL distinguen eficazmente sus estructuras cariotípicas. El análisis incluye seis parámetros cuantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Además, los resultados indican que el PCoA basado en estos seis parámetros es un método robusto para determinar las relaciones del cariotipo biológico entre las ocho poblaciones. El número de cromosomas en las poblaciones de Lycoris es x = 6-8. Con base en el estudio y la literatura actuales, la diferenciación genómica de estas poblaciones se discute en términos de tamaño del genoma, heterocromatina, sitios de ADNr 45S y 5S y asimetría del cariotipo.

Introducción

Lycoris es una familia que incluye varias plantas hortícolas importantes1. Lycoris aurea (L'Hér.) Hierba. es una planta medicinal tradicional china con una larga historia. El análisis fitoquímico ha demostrado que Lycoris aurea (L'Her.) La hierba contiene galantamina y otros alcaloides, que pueden mejorar la sensibilidad a la acetilcolina y tienen el potencial de tratar la enfermedad de Alzheimer comoinhibidores de la colinesterasa.

En las plantas superiores, el análisis del cariotipo es crucial para integrar los mapas genéticos y físicos, con importantes implicaciones prácticas para la biología de las plantas. Este análisis permite la caracterización del genoma a nivel cromosómico, la clarificación de las relaciones taxonómicas celulares entre poblaciones, la identificación de aberraciones genéticas y la comprensión de las tendencias de la evolución cromosómica 3,4,5. Por lo general, la descripción de un cariotipo incluye el número de cromosomas, las longitudes absolutas y relativas de los cromosomas, las ubicaciones de constricción primaria y secundaria, la distribución de fragmentos heterocromáticos, los números y ubicaciones de los sitios de ADNr y otras características de la secuencia de ADN, así como la asimetría del cariotipo 6,7,8. Entre los parámetros del cariotipo, la asimetría está determinada por variaciones en la longitud del cromosoma (asimetría intercromosómica) y la posición del centrómero (asimetría intracromosómica). La asimetría del cariotipo es una característica importante que refleja la morfología cromosómica y es ampliamente utilizada en la taxonomía de células vegetales 9,10,11,12.

A menudo, la ausencia de marcadores cromosómicos limita el análisis del cariotipo e impide la identificación de los cromosomas individuales. En los últimos años, la tinción de Giemsa, las bandas de fluorescencia y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se han vuelto populares en el análisis de cromosomas de plantas. Los métodos de tinción fluorescente dual, como la tinción CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenilindol) y la tinción PI (yoduro de propilo) / DAPI (conocida como tinción CPD), revelan regiones heterocromáticas ricas en GC y AT en los cromosomas 4,13. Durante la metafase o paquiteno de la mitosis de la planta, secuencias repetidas de ADN o segmentos largos de ADN pueden generar señales específicas en las poblaciones de plantas a través de la hibridación FISH 14,15,16.

Las bandas fluorescentes y las señales FISH proporcionan marcadores útiles para la identificación de cromosomas. Mediante la medición de la longitud de los cromosomas, el análisis de las características de las bandas de fluorescencia y la comparación de las diferencias de señal FISH, se pueden construir cariotipos citogenéticos moleculares detallados de diferentes germoplasmas o poblaciones de plantas. Estos cariotipos muestran efectivamente la morfología cromosómica en varios germoplasmas o poblaciones, lo que permite comparaciones de la distribución de la heterocromatina y la localización de la secuencia de ADN y fomenta futuras investigaciones 4,8,17. Las comparaciones de cariotipos citogenéticos moleculares pueden ofrecer información valiosa sobre las relaciones filogenéticas y la evolución cromosómica de poblaciones relacionadas 8,14,18,19.

El género Lycoris , un grupo diverso e intrigante dentro de la familia Amarilis, es conocido por sus bulbos perennes. Con aproximadamente 20 especies, 15 de las cuales son endémicas de China, muestra una rica biodiversidad. Este género se encuentra exclusivamente en las regiones templadas cálidas y subtropicales del este de Asia, incluido el suroeste de China, el sur de Corea y Japón, con algunas poblaciones que se extienden hasta el norte de la India y Nepal20. Los primeros estudios citogenéticos se centraron principalmente en el recuento de cromosomas para establecer el número cromosómico básico del género y describir la morfología de los cromosomas en poblaciones específicas, centrándose en gran medida en Lycoris radiata21. El número total de cromosomas observado en este género oscila entre 12 y 33 o 44, lo que representa los niveles diploide, diploide anormal, triploide, tetraploide y aneuploide, respectivamente. Los números básicos de los cromosomas, x, son 6, 7, 8 y 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) La hierba, una especie notable dentro del género Lycoris , está ampliamente distribuida en toda China22. Prospera en ambientes relajados y húmedos y se reproduce a través de pequeños bulbos. Estos bulbos, que contienen licorina y galantamina, dos compuestos medicinales clave, se han utilizado en la medicina tradicional china durante siglos. La Lycoris aurea también cautiva a los horticultores con sus llamativas flores rojas en otoño y sus hojas de hoja perenne en invierno. Sin embargo, la similitud morfológica entre todos los Lycoris aurea estudiados (L'Hér.) Las poblaciones de hierbas presentan un desafío significativo para la identificación cromosómica utilizando métodos citológicos convencionales.

La clonación de FISH, fosmid o BAC (cromosomas artificiales bacterianos) con secuencias repetitivas de ADN y sondas de oligonucleótidos en cromosomas metafásicos o paquidermales se ha utilizado para el análisis de cariotipo 23,24,25, el análisis citogenético comparativo 26,27, la construcción de mapas citogenéticos28,29 y ensayos específicos de cromosomas30. Recientemente, la técnica FISH se ha aplicado al análisis cromosómico de poblaciones de Lycoris 31. Aunque el número de cromosomas y el cariotipo varían en las poblaciones de Lycoris, el número total de cromosomas permanece constante, observándose tres tipos básicos: el cromosoma del centrómero central (M-), el cromosoma del centrómero distal (T-) y el cromosoma del centrómero proximal (A-). Además, se observan diversas formas y tamaños de cromosomas en las poblaciones naturales32.

La hibridación in situ con fluorescencia de ARN (FISH) es útil para detectar cambios cromosómicos, como la fusión de centrómeros, la inversión, la amplificación de genes y la deleción de fragmentos. La tecnología de hibridación fluorescente in situ (RNA-FISH) permite el análisis visual de alta resolución de los cromosomas para detectar e identificar múltiples cambios complejos, incluida la fusión de las regiones centrales de los cromosomas, la formación de nuevas estructuras cromosómicas, la inversión de regiones cromosómicas, la amplificación de genes o fragmentos de genes y la pérdida de secuencias de genes en regiones cromosómicas específicas33. Cinco de los 500 clones mostraron fuertes señales FISH en la región del centrómero del cromosoma central (M-), pero no en el cromosoma (T-)34 del centrómero distal. El patrón único de distribución de la señal FISH en cada cromosoma permitió la identificación de cromosomas individuales, lo que anteriormente había sido un desafío en las poblaciones de Lycoris utilizando métodos de tinción tradicionales31. En la actualidad, existen pocos estudios sobre la citogenética molecular de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, haciendo hincapié en la urgente necesidad de más investigación en este campo.

En este estudio, ocho cromosomas metafásicos bien diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Las poblaciones de hierbas se prepararon utilizando métodos de inmersión enzimática y secado con llama (EMF). Para la identificación de FISH se utilizó tinción CPD y sondas de ADNr 45S y 5S. Se construyeron cariotipos citogenéticos moleculares detallados de estas poblaciones utilizando datos combinados de mediciones cromosómicas, bandas fluorescentes y señales FISH de ADNr 45S y 5S. Se calcularon seis índices de asimetría cariotípica diferentes para cada población con el fin de identificar las relaciones cariotípicas entre ellas. La evaluación de los datos del cariotipo citogenético molecular proporcionó información significativa sobre la diferenciación genómica y las relaciones evolutivas de las ocho poblaciones, lo que podría remodelar la comprensión de los cromosomas Lycoris .

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Protocolo

Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales, mientras que las sondas empleadas se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

1. Preparación de los cromosomas apicales

  1. Enraíza por hidroponía. Después de retirar la parte aérea del bulbo, colóquelo en una botella cónica llena de agua, reemplazando el agua cada 3 días, siguiendo el método descrito por Song et al.35.
  2. Extirpar las puntas de las raíces en crecimiento activo cuando alcancen aproximadamente 1,0-2,0 cm de longitud y tratarlas en α-bromonaftaleno saturado a 28 °C durante 1,0 h.
  3. Cortar las puntas de las raíces a aproximadamente 1 cm y colocarlas en una mezcla recién preparada de metanol y ácido acético glacial en una proporción de volumen de 3:1 a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C) durante 2-3 h. Luego, almacenarlos en un refrigerador a 4 °C, según lo descrito por She et al.36.
  4. Lave bien las puntas fijas de las raíces (2-3 mm) con agua bidestilada.
  5. Prepare una mezcla de celulasa y pectina hidrolasa en 0,01 mM de tampón de ácido cítrico-citrato de sodio a pH 4,5, con celulasa y pectina hidrolasa al 1% cada una. Coloque las puntas de las raíces pretratadas en la mezcla y digiera a 28 °C durante 1,0-1,5 h.
  6. Lave las puntas de las raíces digeridas con agua destilada dos veces, transfiéralas a un portaobjetos de vidrio y triture bien con el fijador con pinzas de punta fina.
  7. Seque los portaobjetos sobre la llama de una lámpara de alcohol hasta que el agua nebulizada desaparezca. Bajo un microscopio de contraste de fase, seleccione portaobjetos con más de cinco fases divididas y sin cromosomas superpuestos. Guarde los portaobjetos a -20 °C para su uso futuro.

2. Tinción de CPD

  1. Prepare una solución de CPD agregando PI y DAPI a un atenuador antifluorescente al 30% (v/v), donde la concentración de PI es de 0,6 μg·mL-1 y la concentración de DAPI es de 3 μg·mL-1.
  2. Secar el portaobjetos cromosómico a 65 °C durante 30 min.
  3. Añadir 100 μL de diluyente de RNasa A (la solución de almacenamiento de RNasa A diluida 100 veces con 2x SSC (citrato de sodio salino), lo que da como resultado una concentración final de 100 μg/mL) por portaobjetos de cromosoma. Cubra el portaobjetos y caliéntelo en una cámara húmeda a 37 °C durante 30-60 min.
  4. Lave el portaobjetos cromosómico con 2x SSC a temperatura ambiente durante tres intervalos de 5 minutos cada uno.
  5. Lave el portaobjetos cromosómico a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
  6. Añadir 200 μL de diluyente de pepsina (la solución de almacenamiento de pepsina se diluye 100 veces con 0,01 N HCl para lograr una concentración final de 5 μg/mL) por portaobjetos de cromosoma. Cubra el portaobjetos e incube en una cámara húmeda a 37 °C durante 5-20 min.
  7. Lave las secciones de los cromosomas con agua ultrapura a temperatura ambiente durante 2 minutos, seguido de un lavado con 2 xSSC a temperatura ambiente durante dos intervalos de 5 minutos cada uno.
  8. Fije los portaobjetos con una solución de metanol: ácido acético glacial (3:1) durante 10 min.
  9. Lavar con 2x SSC a temperatura ambiente durante tres intervalos de 5 min cada uno.
  10. Tratar con etanol al 70%, 95% y 100% a -20 °C durante 5 minutos cada uno, luego secar a temperatura ambiente.
  11. Tome los portaobjetos cromosómicos tratados y secos, agregue 30 μL de solución de tinción CPD a cada portaobjetos, cúbralos con un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm y tiña en la oscuridad durante más de 30 minutos. El material cromosómico extenso debe teñirse durante la noche.
  12. Observe los portaobjetos cromosómicos bajo un microscopio de fluorescencia, utilizando un filtro de excitación verde (WG) para la tinción PI y un filtro ultravioleta (UV) para la tinción DAPI. Captura imágenes con el software compatible.
    1. Ajuste el tiempo de exposición a través de los dos filtros para lograr intensidades de fluorescencia roja y azul similares durante la captura de imágenes. La imagen CPD se obtiene a partir de las imágenes en escala de grises teñidas con PI y DAPI. Las mediciones cromosómicas y el procesamiento de imágenes se realizaron con el software Adobe Photoshop.

3. Hibridación fluorescente in situ

  1. Prepare la solución híbrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) y 50% sulfato de glucano (4 μL). Después de la preparación, centrifugar la solución híbrida (2500 x g, 5-10 min, a temperatura ambiente) y colocarla en hielo.
  2. Coloque las diapositivas escaneadas en el horno a 65 °C durante 30-60 min.
  3. Retire los portaobjetos horneados, agregue 100 μL de solución de desnaturalización de FAD al 70%, cubra con un cubreobjetos y desnaturalice en un horno de hibridación molecular a 85 °C durante 2,5 min.
  4. Retire el cubreobjetos e inmediatamente sumerja los portaobjetos en etanol frío al 70%, 90% y 100%, deshidratando sucesivamente durante 5 minutos cada uno.
  5. Retire los portaobjetos y déjelos secar a temperatura ambiente durante más de 30 minutos.
  6. Agregue 20 μL de solución híbrida al portaobjetos, coloque suavemente el cubreobjetos encima hasta que el líquido se difunda por completo y déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos para humedecer el área cubierta del portaobjetos.
  7. Coloque los portaobjetos en una placa híbrida empapada con 2× SSC (la placa híbrida debe ser una placa de Petri grande con una tapa envuelta en papel de aluminio para facilitar la operación lejos de la luz) e incube a 37 °C durante la noche (durante al menos 6 h).
  8. Contratiñir los cromosomas montándolos con 3 μg·mL-1 DAPI en una solución al 30% (v/v) de Vectashield H-100. Capture la imagen utilizando software compatible, con la fluorescencia azul de DAPI excitada por la luz púrpura del filtro y la fluorescencia roja de PI excitada por la luz verde, respectivamente.
    NOTA: La hibridación de FISH se realizó utilizando sondas de ADNr 45S y 5S en portaobjetos previamente teñidos con CPD, siguiendo el método descrito por She et al.36.

4. Análisis del cariotipo

  1. Seleccionar cinco células mitóticas en metafase para cada población en las que los cromosomas estén bien dispersos (sin solapamientos) y moderadamente condensados (los cromosomas no deben estar agregados al máximo, pero los extremos no deben estar agrupados), siguiendo la metodología descrita por She et al.4.
  2. Determine la longitud absoluta de cada cromosoma seleccionando cinco cromosomas con la concentración más alta durante la división celular.
  3. Mida meticulosa y precisamente la longitud del brazo largo (L) y el brazo corto (S) de cada cromosoma, así como el tamaño de cada banda de pigmento fluorescente en el cromosoma.
  4. Calcule los siguientes parámetros: (1) longitud relativa de los cromosomas (RL, porcentaje haploide); (2) relación de brazo (AR = L/S, brazo largo/brazo corto); (3) longitud total del cromosoma haploide (TCL; longitud del cariotipo); (4) longitud promedio de los cromosomas (C); (5) tamaño de la banda de fluorescencia (el porcentaje de la banda de fluorescencia en relación con la longitud del cromosoma); (6) distancia desde el centrómero hasta el sitio de ADNr; (7) índice de centrómero promedio (IC, calculado como la longitud corta del brazo de cada cromosoma dividida por la longitud total de ese cromosoma, y luego promediando estos valores); (8) cuatro indicadores diferentes de asimetría del cariotipo, incluyendo el índice de centrómero (CVCI), el coeficiente de variación (CV), el coeficiente de variación de la longitud del cromosoma (CVCL), el coeficiente de asimetría media del centrómero (MCA) y la categoría de asimetría de Stebbins.
    NOTA: Consulte los métodos de Paszko10 y Peruzzi et al.11 para calcular el índice de asimetría. Clasifique los cromosomas con diferentes proporciones de brazo de acuerdo con los cinco métodos de clasificación de Levan. Organizar los cromosomas de Lycoris aurea (L'Hér.) Hierba en orden descendente de longitud como se describe en el protocolo de Han et al.37.
  5. Asegure la precisión y exactitud de la metodología mediante el dibujo de patrones de cariotipo cromosómico basados en los datos de medición cromosómica combinados con la información de la banda de fluorescencia y la posición y el tamaño del rDNA-FISH.
  6. La visualización de las relaciones asimétricas del cariotipo de las ocho poblaciones es un paso clave que proporciona información clara. Esto se logra a través de diagramas de dispersión bidimensionales, que se utilizan para obtener su MCA y CVCL.
  7. Realizar un análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizando el coeficiente de similitud de Gower, un componente crucial, siguiendo los métodos de She et al.38.
  8. Calcular seis parámetros cuantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) para determinar los cariotipos citogenéticos de las ocho poblaciones.
  9. Realizar análisis estadísticos utilizando un programa de análisis y visualización de datos para generar el dendrograma basado en UPGMA y el diagrama de dispersión de PCoA.

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Resultados

Mediante el empleo del meticuloso método de inmersión enzimática y secado con llama (EMF), los cromosomas de metafase dispersos y bien diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Se obtuvo la hierba y se construyó el cariotipo cromosómico citogenético de Lycoris aurea (Figura 1). Los cromosomas metafásicos con el mayor grado de condensación no son adecuados para el análisis del cariotipo debido a las reducidas diferencias morfológica...

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Discusión

La preparación de Lycoris aurea (L'Hér.) Los cromosomas de las raíces de las hierbas implican varios pasos críticos: (1) cultivar las raíces mediante hidroponía, (2) tratar las puntas de las raíces con α-bromonaftaleno saturado, (3) fijar las raíces con una solución de alcohol-ácido acético, (4) realizar una hidrólisis enzimática en las puntas de las raíces con una solución enzimática y (5) aplastar completamente las raíces digeridas y secar los portaobjetos so...

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Divulgaciones

Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de China (32070367).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

Referencias

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