JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה חוקר את התפלגות ההטרוכרומטין בשמונה אוכלוסיות של עשב Lycoris aurea (L′Her), תוך שימוש בצביעה משולבת של כרומוזום PI ו-DAPI, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) עם אזורי גן 18S-5.8-26S rRNA (אזורי 45S rDNA), ובדיקות DNA ריבוזומלי 5S.

Abstract

כדי להבין את השונות בקריוטיפ בשמונה אוכלוסיות, קריוטיפים מפורטים נקבעו בקפידה באמצעות מדידות כרומוזומליות, רצועות פלואורסצנטיות ואותות rDNA FISH. מספר אתרי 45S rDNA נע בין זוג אחד לחמישה זוגות לאוכלוסייה, כאשר המספר הנפוץ ביותר לכל קריוטיפ הוא ארבעה זוגות. לוקוס 45S rDNA ממוקם בעיקר בזרועות הקצרות ובאזורים הסופיים של הכרומוזומים, בעוד שלוקוס 5S rDNA נמצא בעיקר בזרוע הקצרה ובאזורים הסופיים או הפרוקסימליים. אוכלוסיות HBWF, HNXN, HBBD ו-HNZX הראו התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA, וכך גם GXTL, HBFC ו-SCLS, מה שמצביע על קשר הדוק בין אוכלוסיות עם התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA. הקריוטיפים של כל האוכלוסיות שנחקרו הם סימטריים, הכוללים צנטרומרים יציבים ויציבים או צנטרומרים יציבים בלבד. עלילות פיזור של MCA ו-CVCL מבחינות ביעילות את המבנים הקריוטיפיים שלהם. הניתוח כולל שישה פרמטרים כמותיים (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). בנוסף, התוצאות מצביעות על כך ש-PCoA המבוסס על ששת הפרמטרים הללו הוא שיטה חזקה לקביעת קשרי קריוטיפ ביולוגיים בין שמונה האוכלוסיות. מספר הכרומוזומים באוכלוסיות ליקוריס הוא x = 6-8. בהתבסס על המחקר והספרות הנוכחיים, התמיינות גנומית של אוכלוסיות אלה נדונה במונחים של גודל הגנום, הטרוכרומטין, אתרי 45S ו-5S rDNA ואסימטריה של קריוטיפ.

Introduction

ליקוריס היא משפחה הכוללת מספר צמחי גננות חשובים1. Lycoris aurea (L'Hér.) עשב. הוא צמח מרפא סיני מסורתי עם היסטוריה ארוכה. ניתוח פיטוכימי הראה כי Lycoris aurea (L′Her.) הצמח מכיל גלנטמין ואלקלואידים אחרים, שיכולים להגביר את הרגישות לאצטילכולין ויש להם פוטנציאל לטפל במחלת אלצהיימר כמעכבי כולינאסטראז2.

בצמחים גבוהים יותר, ניתוח קריוטיפ חיוני לשילוב מפות גנטיות ופיזיות, עם השלכות מעשיות משמעותיות על הביולוגיה של הצמח. ניתוח זה מאפשר אפיון גנום ברמה כרומוזומלית , הבהרת קשרים טקסונומיים תאיים בין אוכלוסיות, זיהוי סטיות גנטיות והבנת מגמות האבולוציה הכרומוזומלית 3,4,5. בדרך כלל, תיאור קריוטיפ כולל מספר כרומוזומים, אורכי כרומוזומים מוחלטים ויחסיים, מיקומי התכווצות ראשוניים ומשניים, התפלגות שברים הטרוכרומטיים, מספרים ומיקומים של אתרי rDNA ומאפיינים אחרים של רצף DNA, כמו גם אסימטריה של קריוטיפ 6,7,8. בין הפרמטרים הקריוטיפיים, אסימטריה נקבעת על ידי וריאציות באורך הכרומוזום (אסימטריה בין-כרומוזומלית) ומיקום הצנטרומר (אסימטריה תוך-כרומוזומלית). אסימטריית קריוטיפ היא תכונה משמעותית המשקפת מורפולוגיה של כרומוזומים ונמצאת בשימוש נרחב בטקסונומיה של תאי צמחים 9,10,11,12.

לעתים קרובות, היעדר סמני כרומוזומים מגביל את ניתוח הקריוטיפ ומעכב את הזיהוי של כרומוזומים בודדים. בשנים האחרונות, צביעת גימסה, רצועות פלואורסצנטיות והכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) הפכו פופולריים בניתוח כרומוזומי צמחים. שיטות צביעה פלואורסצנטיות כפולות, כגון צביעת CMA (כרומיצין A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-phenylindole) וצביעה PI (פרופיל יודיד) / DAPI (המכונה צביעת CPD), חושפות אזורים הטרוכרומטיים עשירים ב- GC ו- AT, על כרומוזומים 4,13. במהלך מטפאזה או פצ'יטן של מיטוזה של צמחים, רצפי DNA חוזרים או מקטעי DNA ארוכים יכולים ליצור אותות ספציפיים באוכלוסיות צמחים באמצעות הכלאה של FISH 14,15,16.

רצועות פלואורסצנטיות ואותות FISH מספקים סמנים שימושיים לזיהוי כרומוזומים. על ידי מדידת אורך הכרומוזום, ניתוח מאפייני רצועות פלואורסצנטיות והשוואת הבדלי אותות FISH, ניתן לבנות קריוטיפים ציטוגנטיים מולקולריים מפורטים של נבטפלזמות או אוכלוסיות צמחים שונות. קריוטיפים אלה מציגים ביעילות מורפולוגיה של כרומוזומים בג'רמפלזמות או אוכלוסיות שונות, מה שמאפשר השוואות של התפלגות הטרוכרומטין ולוקליזציה של רצף ה-DNA ומעודד מחקר נוסף 4,8,17. השוואות קריוטיפ ציטוגנטיות מולקולריות יכולות להציע תובנות חשובות לגבי הקשרים הפילוגנטיים והאבולוציה הכרומוזומלית של אוכלוסיות קשורות 8,14,18,19.

הסוג Lycoris , קבוצה מגוונת ומסקרנת במשפחת האמריליס, ידוע בפקעות הרב שנתיות שלו. הוא כולל כ-20 מינים, 15 מהם אנדמיים לסין, ומציג מגוון ביולוגי עשיר. סוג זה נמצא אך ורק באזורים ממוזגים וסובטרופיים חמים של מזרח אסיה, כולל דרום מערב סין, דרום קוריאה ויפן, עם אוכלוסיות מעטות המשתרעות עד צפון הודו ונפאל. מחקרים ציטוגנטיים מוקדמים כללו בעיקר ספירת כרומוזומים כדי לקבוע את מספר הכרומוזומים הבסיסי של הסוג ולתיאור מורפולוגיה של כרומוזומים באוכלוסיות ספציפיות, תוך התמקדות בעיקר ב-Lycoris radiata21. מספרי הכרומוזומים הכוללים שנצפו בסוג זה נעים בין 12 ל-33 או 44, המייצגים רמות דיפלואידיות, דיפלואידיות חריגות, טריפלואידים, טטרפלואידים ואנופלואידים, בהתאמה. מספרי הכרומוזומים הבסיסיים, x, הם 6, 7, 8 ו-11.

Lycoris aurea (L'Hér.) עשב, מין בולט בסוג Lycoris , נפוץ ברחבי סין22. הוא משגשג בסביבות רגועות ולחות ומתרבה באמצעות נורות קטנות. פקעות אלה, המכילות ליקורין וגלנטמין - שתי תרכובות רפואיות מרכזיות - שימשו ברפואה הסינית המסורתית במשך מאות שנים. Lycoris aurea שובה את לב הגננים עם הפרחים האדומים הבולטים שלו בסתיו והעלים ירוקי עד בחורף. עם זאת, הדמיון המורפולוגי בין כל ה-Lycoris aurea (L'Hér.) שנחקר אוכלוסיות צמחים מהוות אתגר משמעותי לזיהוי כרומוזומלי בשיטות ציטולוגיות קונבנציונליות.

שיבוט של FISH, פוסמיד או BAC (כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים) עם רצפי DNA חוזרים ובדיקות אוליגונוקלאוטידים על כרומוזומים מטפאזיים או פצ'ידרמטיים שימש לניתוח קריוטיפ23,24,25, ניתוח ציטוגנטי השוואתי26,27, בניית מפה ציטוגנטית28,29 ובדיקות ספציפיות לכרומוזום30. לאחרונה, טכניקת FISH יושמה לניתוח כרומוזומים של אוכלוסיות ליקוריס 31. למרות שמספר הכרומוזומים והקריוטיפ משתנים באוכלוסיות ליקוריס, מספר הכרומוזומים הכולל נשאר קבוע, עם שלושה סוגים בסיסיים שנצפו: כרומוזום הצנטרומר המרכזי (M-), כרומוזום הצנטרומר הדיסטלי (T-) וכרומוזום הצנטרומר הפרוקסימלי (A-). בנוסף, צורות וגדלים מגוונים של כרומוזומים נצפים באוכלוסיות טבעיות32.

פלואורסצנטיות RNA בהכלאה באתרה (FISH) שימושית לאיתור שינויים כרומוזומליים, כגון היתוך צנטרומר, היפוך, הגברת גנים ומחיקת שבר. טכנולוגיית Fluorescence In Situ Hybridization (RNA-FISH) מאפשרת ניתוח חזותי ברזולוציה גבוהה של כרומוזומים כדי לזהות ולזהות שינויים מורכבים מרובים, כולל היתוך של אזורים מרכזיים של כרומוזומים, היווצרות מבני כרומוזומים חדשים, היפוך אזורים כרומוזומליים, הגברה של גנים או שברי גנים ואובדן רצף גנים באזורי כרומוזומים ספציפיים33. חמישה מתוך 500 השיבוטים הראו אותות FISH חזקים באזור הצנטרומר של כרומוזום הצנטרומר המרכזי (M-) אך לא על כרומוזום הצנטרומר הדיסטלי (T-)34. דפוס התפלגות אותות ה-FISH הייחודי על כל כרומוזום איפשר זיהוי של כרומוזומים בודדים, מה שבעבר היה מאתגר באוכלוסיות ליקוריס באמצעות שיטות צביעה מסורתיות31. נכון לעכשיו, ישנם מעט מחקרים על הציטוגנטיקה המולקולרית של Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, תוך הדגשת הצורך הדחוף במחקר נוסף בתחום זה.

במחקר זה, שמונה כרומוזומי מטפאזה מובחנים היטב של Lycoris aurea (L'Hér.) אוכלוסיות הצמחים הוכנו בשיטות טבילה באנזים וייבוש להבה (EMF). צביעת CPD ובדיקות 45S ו-5S rDNA שימשו לזיהוי FISH. קריוטיפים ציטוגנטיים מולקולריים מפורטים של אוכלוסיות אלה נבנו באמצעות נתונים משולבים ממדידות כרומוזומליות, רצועות פלואורסצנטיות ואותות 45S ו-5S rDNA FISH. שישה מדדי אסימטריה קריוטיפיים שונים חושבו עבור כל אוכלוסייה כדי לזהות קשרים קריוטיפיים ביניהם. הערכת נתוני הקריוטיפ הציטוגנטי המולקולרי סיפקה תובנות משמעותיות לגבי ההתמיינות הגנומית והיחסים האבולוציוניים של שמונה האוכלוסיות, מה שעשוי לעצב מחדש את ההבנה של כרומוזומי ליקוריס .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים, בעוד שהבדיקות ששימשו מסופקות בתיק משלים 1.

1. הכנת כרומוזומים אפיקליים

  1. השתרש על ידי הידרופוניקה. לאחר הסרת החלק מעל הקרקע של הנורה, הניחו אותה בבקבוק מחודד מלא במים, והחליפו את המים כל 3 ימים, לפי השיטה שתוארה על ידי סונג ואחרים.35.
  2. כרתו את קצות השורשים הגדלים באופן פעיל כאשר הם מגיעים לאורך של כ-1.0-2.0 ס"מ וטפלו בהם ב-α-ברומונפתלין רווי בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 1.0 שעות.
  3. חותכים את קצות השורש לכ -1 ס"מ ומניחים אותם בתערובת טרייה שהוכנה של מתנול וחומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3: 1 בטמפרטורת החדר (כ 20-25 מעלות צלזיוס) למשך 2-3 שעות. לאחר מכן, אחסן אותם במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כפי שמתואר על ידי She et al.36.
  4. שוטפים היטב את קצות השורש הקבועים (2-3 מ"מ) במים מזוקקים כפולים.
  5. הכינו תערובת של צלולאז ופקטין הידרולאז במאגר חומצת לימון-נתרן ציטראט של 0.01 מ"מ ב-pH 4.5, עם צלולאז ופקטין הידרולאז כל אחד ב-1%. מניחים את קצות השורש שטופלו מראש בתערובת ומעכלים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 1.0-1.5 שעות.
  6. שוטפים את קצות השורש המעוכלים במים מזוקקים כפולים, מעבירים אותם על שקופית זכוכית ומועכים היטב עם הקיבוע בעזרת מלקחיים מחודדים.
  7. יבש את המגלשות מעל להבת מנורת אלכוהול עד שערפל המים פשוט נעלם. תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, בחר שקופיות עם יותר מחמישה שלבים מפוצלים וללא כרומוזומים חופפים. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

2. מכתים CPD

  1. הכן תמיסת CPD על ידי הוספת PI ו-DAPI למנחת אנטי-פלואורסצנטי של 30% (v/v), כאשר ריכוז ה-PI הוא 0.6 מיקרוגרם·מ"ל-1 וריכוז ה-DAPI הוא 3 מיקרוגרם·מ"ל-1.
  2. יבש את שקופית הכרומוזום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של מדלל RNase A (תמיסת האחסון RNase A מדוללת 100 פעמים עם 2x SSC (נתרן ציטראט מלוח), וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל) לכל שקופית כרומוזום. מכסים את השקופית ומחממים אותה בתא לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  4. שטפו את שקופית הכרומוזום עם 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך שלושה מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  5. שטפו את שקופית הכרומוזום בטמפרטורת החדר למשך 1-2 דקות.
  6. הוסף 200 מיקרוליטר של מדלל פפסין (תמיסת אחסון הפפסין מדוללת 100 פעמים עם 0.01 N HCl כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל) לכל שקופית כרומוזום. מכסים את השקופית ומדגרים אותה בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-20 דקות.
  7. שטפו את חלקי הכרומוזום במים טהורים במיוחד בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ולאחר מכן שטפו עם 2 xSSC בטמפרטורת החדר למשך שני מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  8. תקן את השקופיות עם מתנול: תמיסת חומצה אצטית קרחונית (3: 1) למשך 10 דקות.
  9. יש לשטוף עם 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך שלושה מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  10. טפל ב-70%, 95% ו-100% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן יבש בטמפרטורת החדר.
  11. קח את שקופיות הכרומוזום המטופלות והמיובשות, הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת צביעה CPD לכל שקופית, כסה בכיסוי 24 מ"מ על 50 מ"מ והכתים בחושך במשך יותר מ-30 דקות. יש להכתים חומר כרומוזומי נרחב בן לילה.
  12. התבונן בשקופיות הכרומוזום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות מסנן עירור ירוק (WG) לצביעה PI ומסנן אולטרה סגול (UV) לצביעה DAPI. צלם תמונות עם התוכנה התואמת.
    1. כוונן את זמן החשיפה דרך שני המסננים כדי להשיג עוצמות פלואורסצנטיות דומות של אדום וכחול במהלך לכידת תמונה. תמונת ה-CPD מתקבלת מהתמונות בגווני אפור המוכתמות ב-PI ו-DAPI. מדידות כרומוזומים ועיבוד תמונה בוצעו באמצעות תוכנת Adobe Photoshop.

3. פלואורסצנציה בהכלאה באתרה

  1. הכן את התמיסה ההיברידית: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) ו-50% גלוקן סולפט (4 μL). לאחר ההכנה, צנטריפוגה את התמיסה ההיברידית (2500 x גרם, 5-10 דקות, בטמפרטורת החדר) והניחו אותה על קרח.
  2. מכניסים את השקופיות הסרוקות לתנור בחום של 65 מעלות למשך 30-60 דקות.
  3. מסירים את השקופיות האפויות, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת דנטורציה של 70% FAD, מכסים בכוס כיסוי ומנטרלים בתנור הכלאה מולקולרי של 85 מעלות צלזיוס למשך 2.5 דקות.
  4. הסר את זכוכית הכיסוי וטבל מיד את השקופיות באתנול קר של 70%, 90% ו-100%, תוך התייבשות ברציפות למשך 5 דקות כל אחת.
  5. הסר את השקופיות ואפשר להן להתייבש בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-30 דקות.
  6. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסה היברידית לשקופית, הניח בעדינות את זכוכית הכיסוי מעל עד שהנוזל מתפזר לחלוטין, והשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להרטיב את האזור המכוסה של השקופית.
  7. מניחים את השקופיות בכלי היברידי ספוג ב-2× SSC (המנה ההיברידית צריכה להיות צלחת פטרי גדולה עם מכסה עטוף בנייר כסף כדי להקל על הפעולה הרחק מאור) ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (למשך 6 שעות לפחות).
  8. כתם את הכרומוזומים על ידי הרכבתם עם 3 μg·mL-1 DAPI בתמיסה של 30% (v/v) של Vectashield H-100. צלם את התמונה באמצעות תוכנה תואמת, כאשר הקרינה הכחולה של DAPI נרגשת על ידי האור הסגול של המסנן והפלואורסצנטיות האדומה של PI נרגשת על ידי האור הירוק, בהתאמה.
    הערה: הכלאת FISH בוצעה באמצעות בדיקות 45S ו-5S rDNA בשקופיות מוכתמות בעבר ב-CPD, בהתאם לשיטה שתוארה על ידי She et al.36.

4. ניתוח קריוטיפ

  1. בחר חמישה תאים מיטוטיים מטפאזיים עבור כל אוכלוסייה שבה הכרומוזומים מפוזרים היטב (ללא חפיפה) ומעובים בצורה בינונית (אין לצבור את הכרומוזומים בצורה מקסימלית, אך אין להצמיד את הקצוות יחד), בהתאם למתודולוגיה המתוארת על ידי She et al.4.
  2. קבע את האורך המוחלט של כל כרומוזום על ידי בחירת חמישה כרומוזומים עם הריכוז הגבוה ביותר במהלך חלוקת התא.
  3. יש למדוד בקפדנות ובדייקנות את אורך הזרוע הארוכה (L) והזרוע הקצרה (S) של כל כרומוזום, כמו גם את הגודל של כל רצועת פיגמנט פלואורסצנטי על הכרומוזום.
  4. חשב את הפרמטרים הבאים: (1) אורך כרומוזום יחסי (RL, אחוז הפלואיד); (2) יחס זרועות (AR = L/S, זרוע ארוכה/זרוע קצרה); (3) אורך כרומוזום הפלואיד כולל (TCL; אורך קריוטיפ); (4) אורך כרומוזום ממוצע (C); (5) גודל פס הקרינה (אחוז פס הקרינה ביחס לאורך הכרומוזום); (6) מרחק מהצנטרומר לאתר ה-rDNA; (7) אינדקס צנטרומר ממוצע (CI, מחושב כאורך הזרוע הקצר של כל כרומוזום חלקי האורך הכולל של אותו כרומוזום, ואז ממוצע ערכים אלה); (8) ארבעה אינדיקטורים שונים לאסימטריה של קריוטיפ, כולל אינדקס הצנטרומר (CVCI), מקדם השונות (CV), מקדם השונות של אורך הכרומוזום (CVCL), מקדם אסימטריה צנטרומר ממוצע (MCA) וקטגוריית אסימטריית סטבינס.
    הערה: עיין בשיטות של Paszko10 ו-Peruzzi et al.11 כדי לחשב את מדד האסימטריה. סווג כרומוזומים עם יחסי זרוע שונים לפי חמש שיטות הסיווג של לבן. סדר את הכרומוזומים של Lycoris aurea (L'Hér.) עשב בסדר אורך יורד כמתואר בפרוטוקולהאן ואחרים 37.
  5. ודא את הדיוק והדיוק של המתודולוגיה על ידי ציור דפוסי קריוטיפ כרומוזומים המבוססים על נתוני מדידת כרומוזומים בשילוב עם מידע על פס הקרינה והמיקום והגודל של ה-rDNA-FISH.
  6. המחשת היחסים הא-סימטריים של הקריוטיפ בין שמונה האוכלוסיות היא צעד מפתח המספק תובנות ברורות. זה מושג באמצעות עלילות פיזור דו מימדיות, המשמשות להשגת ה-MCA וה-CVCL שלהם.
  7. בצע ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA) באמצעות מקדם הדמיון של גאוור, מרכיב מכריע, בהתאם לשיטות של She et al.38.
  8. חשב שישה פרמטרים כמותיים (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) כדי לקבוע את הקריוטיפים הציטוגנטיים של שמונה האוכלוסיות.
  9. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנית ניתוח נתונים והדמיה ליצירת דנדרוגרמה מבוססת UPGMA ותרשים פיזור PCoA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על ידי שימוש בשיטת טבילת אנזימים וייבוש להבה (EMF) קפדנית, כרומוזומי מטפאזה מפוזרים ומובחנים היטב של Lycoris aurea (L'Hér.) הושגו עשבים, ונבנה הקריוטיפ הכרומוזומי הציטוגנטי של Lycoris aurea (איור 1). כרומוזומי המטפאזה עם דרגת העיבוי הגבוהה ביותר אינם מתאימים לני?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הכנת Lycoris aurea (L'Hér.) כרומוזומי שורש עשבים כוללים מספר שלבים קריטיים: (1) טיפוח שורשים באמצעות הידרופוניקה, (2) טיפול בקצות השורשים עם α-ברומונפתלין רווי, (3) קיבוע שורשים באמצעות תמיסת אלכוהול-חומצה אצטית, (4) ביצוע הידרוליזה אנזימטית בקצות השורשים עם תמיסת אנזים, ו-(5) ריסו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

העבודה הזו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32070367).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

References

  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Lycoris AureaRDNA FISHRDNA 45S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved