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요약

이 프로토콜은 결합된 PI 및 DAPI 염색체 염색, 18S-5.8-26S rRNA 유전자 영역(45S rDNA 영역)을 사용한 형광 제자리 혼성화(FISH) 및 5S 리보솜 DNA 프로브를 사용하여 Lycoris aurea (L'Her) 허브의 8개 개체군에서 헤테로크로마틴 분포를 조사합니다.

초록

8개 집단의 핵형 변이를 이해하기 위해 염색체 측정, 형광 밴드 및 rDNA FISH 신호를 사용하여 상세한 핵형을 세심하게 설정했습니다. 45S rDNA 부위의 수는 개체군당 1쌍에서 5쌍까지 다양하며, 핵형당 가장 일반적인 수는 4쌍입니다. 45S rDNA 자리는 주로 염색체의 짧은 팔과 말단 영역에 위치한 반면, 5S rDNA 자리는 주로 짧은 팔과 말단 또는 근위 영역에서 발견됩니다. HBWF, HNXN, HBBD 및 HNZX 집단은 GXTL, HBFC 및 SCLS와 마찬가지로 45S rDNA 부위의 유사한 분포를 보였으며, 이는 유사한 45S rDNA 부위 분포를 가진 집단 간의 밀접한 관계를 나타냅니다. 연구된 모든 집단의 핵형은 대칭이며 안정 및 준안정 중심체 또는 배타적으로 안정적인 중심체로 구성됩니다. MCA 및 CVCL의 산점도는 핵형 구조를 효과적으로 구별합니다. 분석에는 6개의 정량적 매개변수(x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI)가 포함됩니다. 또한, 이 6가지 매개변수를 기반으로 하는 PCoA가 8개 집단 간의 생물학적 핵형 관계를 결정하는 강력한 방법임을 나타냅니다. Lycoris 집단의 염색체 수는 x = 6-8입니다. 현재 연구 및 문헌을 기반으로 이러한 개체군의 게놈 분화는 게놈 크기, 이염색질, 45S 및 5S rDNA 부위, 핵형 비대칭 측면에서 논의됩니다.

서문

Lycoris 는 몇 가지 중요한 원예 식물을 포함하는 가족입니다1. Lycoris aurea (L' Hér.) 향초. 오랜 역사를 가진 중국 전통 약용 식물입니다. 식물 화학 분석은 Lycoris aurea (L'Her.) 허브에는 갈란타민 및 기타 알칼로이드가 함유되어 있어 아세틸콜린 감수성을 향상시키고 콜린에스테라아제 억제제로 알츠하이머병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다2.

고등 식물에서 핵형 분석은 유전 및 물리적 지도를 통합하는 데 중요하며 식물 생물학에 중요한 실질적 영향을 미칩니다. 이 분석을 통해 염색체 수준의 게놈 특성화, 집단 간의 세포 분류학적 관계 규명, 유전적 이상 식별, 염색체 진화 추세에 대한 이해 3,4,5를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 핵형 설명에는 염색체 수, 절대 및 상대 염색체 길이, 1차 및 2차 수축 위치, 이색성 단편 분포, rDNA 부위 번호 및 위치, 기타 DNA 서열 특성, 핵형 비대칭 6,7,8이 포함됩니다. 핵형 매개변수 중 비대칭은 염색체 길이(염색체 간 비대칭)와 중심체 위치(염색체 내 비대칭)의 변화에 의해 결정됩니다. 핵형 비대칭은 염색체 형태를 반영하는 중요한 특징이며 식물 세포 분류학에 널리 사용됩니다 9,10,11,12.

종종 염색체 마커가 없으면 핵형 분석이 제한되고 개별 염색체의 식별이 방해됩니다. 최근 몇 년 동안 Giemsa 염색, 형광 밴딩 및 FISH(Fluorescence in situ hybridization)가 식물 염색체 분석에서 인기를 얻고 있습니다. CMA (chromomycin A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-phenylindole) 염색 및 PI (요오드 프로필) / DAPI 염색 (CPD 염색이라고 함)과 같은 이중 형광 염색 방법은 염색체 4,13에서 GC가 풍부하고 AT가 풍부한 이색 영역을 나타냅니다. 식물 유사분열의 중기 또는 파키텐 동안, 반복되는 DNA 염기서열 또는 긴 DNA 분절은 FISH 혼성화를 통해 식물 개체군에서 특정 신호를 생성할 수 있습니다 14,15,16.

형광 밴드와 FISH 신호는 염색체 식별에 유용한 마커를 제공합니다. 염색체 길이를 측정하고, 형광 밴딩 특성을 분석하고, FISH 신호 차이를 비교함으로써 다양한 식물 생식질 또는 개체군의 상세한 분자 세포유전학적 핵형을 구성할 수 있습니다. 이러한 핵형은 다양한 생식질 또는 집단에서 염색체 형태를 효과적으로 표시하여 헤테로크로마틴 분포 및 DNA 염기서열 국소화를 비교하고 추가 연구를 장려할 수 있습니다 4,8,17. 분자 세포유전학적 핵형 비교는 관련 집단의 계통발생학적 관계와 염색체 진화에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다 8,14,18,19.

Amaryllis 계통의 다양하고 흥미로운 그룹 인 Lycoris 속은 다년생 구근으로 유명합니다. 약 20종으로 구성되어 있으며 그 중 15종은 중국 고유종으로 풍부한 생물 다양성을 보여줍니다. 이 속은 중국 남서부, 한국 남부, 일본을 포함한 동아시아의 따뜻한 온대 및 아열대 지역에서만 발견되며 일부 개체군은 인도 북부와 네팔까지 확장됩니다20. 초기 세포유전학 연구는 주로 Lycoris radiata21에 초점을 맞춰 속의 기본 염색체 번호를 확립하고 특정 집단의 염색체 형태를 설명하기 위해 염색체 계수를 포함했습니다. 이 속에서 관찰되는 총 염색체 수는 12에서 33 또는 44 사이이며 각각 이배체, 비정상 이배체, 삼배체, 사배체 및 이수체 수준을 나타냅니다. 기본 염색체 번호 x는 6, 7, 8, 11입니다.

Lycoris aurea (L' Hér.) Lycoris 속의 주목할만한 종인 허브는 중국 전역에 널리 분포합니다22. 편안하고 습한 환경에서 번성하며 작은 구근을 통해 번식합니다. 리코린(lycorine)과 갈란타민(galantamine)을 함유한 이 구근은 두 가지 주요 의약 화합물로, 수 세기 동안 중국 전통 의학에서 사용되어 왔습니다. Lycoris aurea 는 또한 가을에는 눈에 띄는 붉은 꽃, 겨울에는 상록수 잎으로 원예가를 사로 잡습니다. 그러나 연구된 모든 Lycoris aurea (L'Hér.) 허브 개체군은 기존의 세포학적 방법을 사용하여 염색체를 식별하는 데 중요한 문제를 제기합니다.

핵형 분석(metaphase analysis) 23,24,25, 비교 세포유전학적 분석(comparative cytogenetic analysis) 26,27, 세포유전학적 맵 구성(cytogenetic map construction)28,29, 염색체 특이적 분석(chromosome-specific assay) 30에 반복적인 DNA 염기서열 및 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 FISH, fosmid 또는 BAC(박테리아 인공 염색체)의 클로닝이 사용되었다. 최근에는 FISH 기법이 Lycoris 집단31의 염색체 분석에 적용되었습니다. 염색체 수와 핵형은 Lycoris 집단에서 다양하지만 총 염색체 수는 일정하게 유지되며 중앙 중심체 염색체(M-), 원위 중심체 염색체(T-) 및 근위 중심체 염색체(A-)의 세 가지 기본 유형이 관찰됩니다. 또한, 자연 개체군에서 다양한 염색체 모양과 크기가 관찰됩니다32.

RNA 형광 in situ hybridization(FISH)은 중심체 융합, 반전, 유전자 증폭 및 단편 삭제와 같은 염색체 변화를 감지하는 데 유용합니다. RNA-FISH(Fluorescence In Situ Hybridization) 기술을 통해 염색체의 고해상도 시각적 분석을 통해 염색체 중심 영역의 융합, 새로운 염색체 구조의 형성, 염색체 영역의 역전, 유전자 또는 유전자 단편의 증폭, 특정 염색체 영역의 유전자 서열 손실을 포함한 여러 복잡한 변화를 감지하고 식별할 수 있습니다33. 500개의 클론 중 5개는 중심 중심체 염색체(M-)의 중심체 영역에서는 강한 FISH 신호를 보였지만 원위 중심체 염색체(T-)에서는 그렇지 않았습니다 34. 각 염색체의 고유한 FISH 신호 분포 패턴으로 인해 이전에는 전통적인 염색 방법을 사용하여 Lycoris 집단에서 어려웠던 개별 염색체를 식별할 수 있었습니다31. 현재 Lycoris aurea (L'Hér.)의 분자 세포 유전학에 대한 연구는 거의 없습니다. Herb는 이 분야에 대한 추가 연구가 시급히 필요하다고 강조했습니다.

이 연구에서는 Lycoris aurea (L'Hér.)의 8개의 잘 분화된 중기 염색체를 발견했습니다. 허브 개체군은 효소 침지 및 화염 건조(EMF) 방법을 사용하여 준비되었습니다. FISH 식별을 위해 CPD 염색과 45S 및 5S rDNA 프로브를 사용했습니다. 이러한 집단의 상세한 분자 세포유전학적 핵형은 염색체 측정, 형광 띠, 45S 및 5S rDNA FISH 신호의 결합된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이들 간의 핵형 관계를 식별하기 위해 각 모집단에 대해 6개의 서로 다른 핵형 비대칭 지수를 계산했습니다. 분자 세포유전학적 핵형 데이터의 평가는 8개 집단의 게놈 분화 및 진화 관계에 대한 중요한 통찰력을 제공하여 잠재적으로 Lycoris 염색체에 대한 이해를 재구성할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 자세히 설명되어 있으며, 사용된 프로브는 보충 파일 1에 제공됩니다.

1. 정점 염색체의 준비

  1. 수경법으로 뿌리를 내리십시오. 전구의 지상 부분을 제거한 후 물을 채운 테이퍼 형 병에 넣고 Song et al.35에 설명 된 방법에 따라 3 일마다 물을 교체합니다.
  2. 활발하게 성장하는 뿌리 끝은 길이가 약 1.0-2.0cm에 도달 할 때 절제하고 포화 α-브로 모나 프탈렌에서 처리하십시오 28 ° C에서 1.0 시간 동안.
  3. 뿌리 끝을 약 1cm로 자르고 갓 준비한 메탄올과 빙초산의 혼합물에 실온(약 20-25°C)에서 2-3시간 동안 3:1 부피 비율로 놓습니다. 그런 다음 She et al.36에 설명된 대로 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
  4. 고정된 뿌리 끝(2-3mm)을 이중 증류수로 철저히 씻으십시오.
  5. pH 4.5에서 0.01mM 구연산-구연산나트륨 완충액에 셀룰라아제와 펙틴 가수분해효소의 혼합물을 준비하고 셀룰라아제와 펙틴 가수분해효소는 각각 1%입니다. 사전 처리된 뿌리 끝을 혼합물에 넣고 28°C에서 1.0-1.5시간 동안 분해합니다.
  6. 소화된 뿌리 끝을 이중 증류수로 씻고 유리 슬라이드에 옮기고 가늘고 뾰족한 집게를 사용하여 정착물로 철저히 으깬다.
  7. 물 안개가 사라질 때까지 알코올 램프의 불꽃 위에서 슬라이드를 건조시킵니다. 위상차 현미경에서 5개 이상의 분할 위상이 있고 겹치는 염색체가 없는 슬라이드를 선택합니다. 나중에 사용할 수 있도록 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.

2. CPD 염색

  1. PI 농도가 0.6 μg·mL-1 이고 DAPI 농도가 3 μg·mL-1인 30%(v/v) 항형광 감쇠기에 PI 및 DAPI를 첨가하여 CPD 용액을 준비합니다.
  2. 염색체 슬라이드를 65°C에서 30분 동안 건조시킵니다.
  3. 염색체 슬라이드당 100μL의 RNase A 희석제(2x SSC(구연산식염수 나트륨)로 100배 희석된 RNase A 저장 용액을 추가하여 최종 농도 100μg/mL를 생성합니다. 슬라이드를 덮고 37°C의 습한 챔버에서 30-60분 동안 데웁니다.
  4. 염색체 슬라이드를 실온에서 각각 5분씩 3회 간격으로 2x SSC로 세척합니다.
  5. 염색체 슬라이드를 실온에서 1-2분 동안 세척합니다.
  6. 염색체 슬라이드당 200μL의 펩신 희석제(0.01N HCl로 100배 희석하여 최종 농도 5μg/mL를 달성한 펩신 저장 용액)를 추가합니다. 슬라이드를 덮고 37°C의 습한 챔버에서 5-20분 동안 배양합니다.
  7. 염색체 단면을 실온에서 초순수로 2분 동안 세척한 다음 실온에서 각각 5분씩 2회 간격으로 2 xSSC로 세척합니다.
  8. 슬라이드를 메탄올: 빙초산(3:1) 용액으로 10분 동안 고정합니다.
  9. 실온에서 2x SSC로 각각 5분씩 3회 간격으로 세탁합니다.
  10. -20°C에서 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 5분씩 처리한 후 실온에서 건조시킵니다.
  11. 처리 및 건조된 염색체 슬라이드를 가져와서 각 슬라이드에 30μL의 CPD 염색 용액을 추가하고 24mm x 50mm 커버슬립으로 덮고 어둠 속에서 30분 이상 염색합니다. 광범위한 염색체 물질은 밤새 염색해야 합니다.
  12. PI 염색을 위한 녹색 여기 필터(WG)와 DAPI 염색을 위한 자외선 필터(UV)를 사용하여 형광 현미경으로 염색체 슬라이드를 관찰합니다. 호환 가능한 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다.
    1. 두 필터를 통해 노출 시간을 조정하여 이미지를 캡처하는 동안 유사한 적색 및 청색 형광 강도를 얻을 수 있습니다. CPD 이미지는 PI 및 DAPI로 염색된 회색조 이미지에서 얻습니다. 염색체 측정 및 이미지 처리는 Adobe Photoshop 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

3. 형광 현장 교잡

  1. FAD(10 μL), ssDNA(2 μL), 20× SSC(2 μL), 5S rDNA(1 μL), 45S rDNA(1 μL) 및 50% 글루칸 설페이트(4 μL)의 하이브리드 용액을 준비합니다. 준비 후 하이브리드 용액(2500 x g, 5-10분, 실온)을 원심분리하여 얼음 위에 놓습니다.
  2. 스캔한 슬라이드를 65°C의 오븐에 30-60분 동안 넣습니다.
  3. 베이크된 슬라이드를 제거하고, 100μL의 70% FAD 변성 용액을 첨가하고, 커버 유리로 덮고, 85°C 분자 혼성로에서 2.5분 동안 변성시킵니다.
  4. 커버 유리를 제거하고 즉시 슬라이드를 70%, 90% 및 100% 차가운 에탄올에 담그고 각각 5분 동안 연속적으로 탈수합니다.
  5. 슬라이드를 제거하고 실온에서 30분 이상 건조시킵니다.
  6. 슬라이드에 20μL의 하이브리드 용액을 추가하고 액체가 완전히 확산될 때까지 커버 유리를 위에 부드럽게 놓고 슬라이드의 덮인 부분을 촉촉하게 하기 위해 10분 동안 실온에 둡니다.
  7. 2× SSC로 적신 하이브리드 접시에 슬라이드를 넣고(하이브리드 접시는 빛을 피해 쉽게 작동할 수 있도록 주석 호일로 감싼 뚜껑이 있는 큰 페트리 접시여야 함) 37°C에서 밤새 배양합니다(최소 6시간 동안).
  8. Vectashield H-100의 30%(v/v) 용액에 3 μg·mL-1 DAPI를 장착하여 염색체를 상쇄합니다. 필터의 보라색 빛에 의해 여기되는 DAPI의 파란색 형광과 녹색 빛에 의해 여기되는 PI의 빨간색 형광으로 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
    참고: FISH 혼성화는 She et al.36에 의해 기술된 방법에 따라 이전에 CPD 염색된 슬라이드에서 45S 및 5S rDNA 프로브를 사용하여 수행되었습니다.

4. 핵형 분석

  1. She et al.4에 설명된 방법론에 따라 염색체가 잘 분산되고(겹치지 않음) 적당히 응축된(염색체가 최대로 응집되어서는 안 되지만 말단이 함께 뭉쳐서는 안 됨) 각 집단에 대해 5개의 중기 유사분열 세포를 선택합니다.
  2. 세포 분열 중 농도가 가장 높은 5개의 염색체를 선택하여 각 염색체의 절대 길이를 결정합니다.
  3. 각 염색체의 긴 팔(L)과 짧은 팔(S)의 길이와 염색체의 각 형광 색소 띠의 크기를 꼼꼼하고 정확하게 측정합니다.
  4. 다음 매개 변수를 계산하십시오 : (1) 상대 염색체 길이 (RL, 반수체 백분율); (2) 팔 비율 (AR = L / S, 긴 팔 / 짧은 팔); (3) 총 반수체 염색체 길이 (TCL; 핵형 길이); (4) 평균 염색체 길이 (C); (5) 형광 밴드의 크기(염색체의 길이에 대한 형광 밴드의 백분율); (6) 중심체에서 rDNA 부위까지의 거리; (7) 평균 중심체 지수 (CI, 각 염색체의 짧은 팔 길이를 해당 염색체의 총 길이로 나눈 값으로 계산 한 다음이 값의 평균으로 계산); (8) 중심체 지수(CVCI), 변동 계수(CV), 염색체 길이 변동 계수(CVCL), 평균 중심체 비대칭 계수(MCA) 및 스테빈스 비대칭 범주를 포함한 핵형 비대칭의 4가지 지표.
    참고: Paszko10 및 Peruzzi et al.11 의 방법을 참조하여 비대칭 지수를 계산합니다. Levan의 5가지 분류 방법에 따라 팔 비율이 다른 염색체를 분류합니다. Lycoris aurea (L'Hér.)의 염색체를 배열합니다. Han et al. 프로토콜37에 설명된 대로 길이의 내림차순으로 된 허브.
  5. 형광 밴드 정보와 결합된 염색체 측정 데이터, rDNA-FISH의 위치 및 크기를 기반으로 염색체 핵형 패턴을 그려 방법론의 정밀도와 정확성을 보장합니다.
  6. 8개 개체군의 핵형 비대칭 관계를 시각화하는 것은 명확한 통찰력을 제공하는 핵심 단계입니다. 이는 MCA 및 CVCL을 얻는 데 사용되는 2차원 산점도를 통해 달성됩니다.
  7. She et al.38의 방법에 따라 중요한 구성 요소인 Gower 유사성 계수를 사용하여 주좌표 분석(PCoA)을 수행합니다.
  8. 6개의 정량적 매개변수(x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI)를 계산하여 8개 집단의 세포유전학적 핵형을 결정합니다.
  9. 데이터 분석 및 시각화 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행하여 UPGMA 기반 덴드로그램 및 PCoA 산점도를 생성합니다.

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결과

세심한 효소 침지 및 화염 건조(EMF) 방법을 사용하여 Lycoris aurea (L'Hér.)의 흩어지고 잘 분화된 중기 염색체를 사용합니다. 허브를 얻어 Lycoris aurea 의 세포유전학적 염색체 핵형을 구성했습니다(그림 1). 응축 정도가 가장 높은 중기 염색체는 형태학적 차이가 감소하여 핵형 분석에 적합하지 않습니다. 그러나 반수체 염색체(TCL)의 총 길이...

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토론

Lycoris aurea (L' Hér.)의 준비 허브 뿌리 염색체는 다음과 같은 몇 가지 중요한 단계를 포함합니다: (1) 수경법을 통한 뿌리 배양, (2) 뿌리 끝을 포화 α-브로모나프탈렌으로 처리, (3) 알코올-아세트산 용액을 사용하여 뿌리 고정, (4) 효소 용액으로 뿌리 끝에 효소 가수분해 수행, (5) 소화된 뿌리를 철저히 으깨고 알코올 램프 불꽃 위에서 슬라이드를 건조.

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공개

저자들은 상충하는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했다.

감사의 말

이 연구는 중국 자연과학재단(32070367)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

참고문헌

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