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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht die Heterochromatinverteilung in acht Populationen von Lycoris aurea (L'Her) Herb unter Verwendung von kombinierter PI- und DAPI-Chromosomenfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit 18S-5.8-26S rRNA-Genregionen (45S rDNA-Regionen) und 5S ribosomalen DNA-Sonden.

Zusammenfassung

Um die Variation des Karyotyps in acht Populationen zu verstehen, wurden detaillierte Karyotypen anhand von Chromosomenmessungen, Fluoreszenzbanden und rDNA-FISH-Signalen akribisch ermittelt. Die Anzahl der 45S-rDNA-Stellen variiert zwischen einem und fünf Paaren pro Population, wobei die häufigste Anzahl pro Karyotyp vier Paare beträgt. Der 45S rDNA-Locus befindet sich überwiegend in den kurzen Armen und terminalen Regionen der Chromosomen, während der 5S rDNA-Locus hauptsächlich im kurzen Arm und in den terminalen oder proximalen Regionen zu finden ist. Die Populationen HBWF, HNXN, HBBD und HNZX zeigten eine ähnliche Verteilung der 45S-rDNA-Stellen, ebenso wie GXTL, HBFC und SCLS, was auf eine enge Beziehung zwischen Populationen mit ähnlichen 45S-rDNA-Stellenverteilungen hinweist. Die Karyotypen aller untersuchten Populationen sind symmetrisch und bestehen aus stabilen und metastabilen Zentroeren oder ausschließlich stabilen Zentromeren. Streudiagramme von MCA und CVCL unterscheiden effektiv ihre karyotypischen Strukturen. Die Analyse umfasst sechs quantitative Parameter (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass PCoA, das auf diesen sechs Parametern basiert, eine robuste Methode zur Bestimmung biologischer Karyotyp-Beziehungen zwischen den acht Populationen ist. Die Chromosomenzahl in Lycoris-Populationen beträgt x = 6-8. Basierend auf der aktuellen Studie und Literatur wird die genomische Differenzierung dieser Populationen in Bezug auf Genomgröße, Heterochromatin, 45S- und 5S-rDNA-Stellen und Karyotyp-Asymmetrie diskutiert.

Einleitung

Lycoris ist eine Familie, zu der mehrere wichtige Gartenbaupflanzen gehören1. Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut. ist eine traditionelle chinesische Heilpflanze mit einer langen Geschichte. Phytochemische Analysen haben gezeigt, dass Lycoris aurea (L'Her.) Das Kraut enthält Galantamin und andere Alkaloide, die die Acetylcholin-Empfindlichkeit erhöhen können und als Cholinesterase-Hemmer das Potenzial haben, die Alzheimer-Krankheit zu behandeln2.

Bei höheren Pflanzen ist die Karyotypanalyse entscheidend für die Integration genetischer und physikalischer Karten, mit erheblichen praktischen Auswirkungen auf die Pflanzenbiologie. Diese Analyse ermöglicht die Charakterisierung des Genoms auf Chromosomenebene, die Klärung zellulärer taxonomischer Beziehungen zwischen Populationen, die Identifizierung genetischer Aberrationen und das Verständnis chromosomaler Evolutionstrends 3,4,5. Typischerweise umfasst eine Karyotypbeschreibung die Chromosomenzahl, absolute und relative Chromosomenlängen, primäre und sekundäre Verengungslokalisationen, heterochromatische Fragmentverteilung, rDNA-Stellennummern und -Positionen und andere DNA-Sequenzmerkmale sowie Karyotyp-Asymmetrie 6,7,8. Unter den Karyotyp-Parametern wird die Asymmetrie durch Variationen der Chromosomenlänge (interchromosomale Asymmetrie) und der Zentromerposition (intrachromosomale Asymmetrie) bestimmt. Die Karyotyp-Asymmetrie ist ein signifikantes Merkmal, das die Chromosomenmorphologie widerspiegelt und in der Pflanzenzelltaxonomie 9,10,11,12 weit verbreitet ist.

Oft schränkt das Fehlen von Chromosomenmarkern die Karyotyp-Analyse ein und erschwert die Identifizierung einzelner Chromosomen. In den letzten Jahren haben sich die Giemsa-Färbung, das Fluoreszenzbanding und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in der Pflanzenchromosomenanalyse durchgesetzt. Duale Fluoreszenzfärbemethoden, wie z. B. die CMA- (Chromomycin A3) / DAPI-Färbung (4, 6-Diamino-2-phenylindol) und die PI (Propyliodid) / DAPI-Färbung (bekannt als CPD-Färbung), zeigen GC- und AT-reiche heterochromatische Regionen auf den Chromosomen 4,13. Während der Metaphase oder Pachyten der Pflanzenmitose können wiederholte DNA-Sequenzen oder lange DNA-Abschnitte durch FISH-Hybridisierung spezifische Signale in Pflanzenpopulationen erzeugen 14,15,16.

Fluoreszierende Banden und FISH-Signale liefern nützliche Marker für die Chromosomenidentifizierung. Durch die Messung der Chromosomenlänge, die Analyse der Fluoreszenzbandeneigenschaften und den Vergleich von FISH-Signalunterschieden können detaillierte molekularzytogenetische Karyotypen verschiedener pflanzlicher Keimplasmen oder Populationen konstruiert werden. Diese Karyotypen zeigen effektiv die Chromosomenmorphologie in verschiedenen Keimplasmen oder Populationen, was Vergleiche der Heterochromatinverteilung und der DNA-Sequenzlokalisierung ermöglicht und weitere Forschungen anregt 4,8,17. Molekularzytogenetische Karyotypvergleiche können wertvolle Einblicke in die phylogenetischen Beziehungen und die chromosomale Evolution verwandter Populationen bieten 8,14,18,19.

Die Gattung Lycoris , eine vielfältige und faszinierende Gruppe innerhalb der Familie der Amaryllis, ist bekannt für ihre mehrjährigen Zwiebeln. Mit etwa 20 Arten, von denen 15 in China endemisch sind, weist er eine reiche Artenvielfalt auf. Diese Gattung kommt ausschließlich in warmgemäßigten und subtropischen Regionen Ostasiens vor, einschließlich Südwestchina, Südkorea und Japan, mit einigen Populationen, die sich bis nach Nordindien und Nepal erstrecken20. Frühe zytogenetische Studien befassten sich hauptsächlich mit der Chromosomenzählung, um die grundlegende Chromosomenzahl der Gattung zu bestimmen und die Chromosomenmorphologie in bestimmten Populationen zu beschreiben, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf Lycoris radiata21 lag. Die in dieser Gattung beobachteten Gesamtchromosomenzahlen reichen von 12 bis 33 oder 44 und repräsentieren den diploiden bzw. abnormalen diploiden, triploiden, tetraploiden und aneuploiden Niveaus. Die grundlegenden Chromosomennummern x sind 6, 7, 8 und 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut, eine bemerkenswerte Art innerhalb der Gattung Lycoris , ist in ganz China weit verbreitet22. Sie gedeiht in entspannten, feuchten Umgebungen und vermehrt sich durch kleine Zwiebeln. Diese Zwiebeln, die Lycorin und Galantamin enthalten - zwei wichtige medizinische Verbindungen - werden seit Jahrhunderten in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet. Auch Lycoris aurea fasziniert Gärtner mit ihren auffällig roten Blüten im Herbst und den immergrünen Blättern im Winter. Die morphologische Ähnlichkeit aller untersuchten Lycoris aurea (L'Hér.) Kräuterpopulationen stellen eine große Herausforderung für die chromosomale Identifizierung mit herkömmlichen zytologischen Methoden dar.

Die Klonierung von FISH, Fosmid oder BAC (bakterielle künstliche Chromosomen) mit repetitiven DNA-Sequenzen und Oligonukleotidsonden auf Metaphase- oder pachydermatoösen Chromosomen wurde für die Karyotypanalyse23,24,25, die vergleichende zytogenetische Analyse26,27, die Erstellung zytogenetischer Karten28,29 und chromosomenspezifische Assays30 verwendet . In jüngster Zeit wurde die FISH-Technik auf die Chromosomenanalyse von Lycoris-Populationen angewendet31. Obwohl die Chromosomenzahl und der Karyotyp in Lycoris-Populationen variieren, bleibt die Gesamtchromosomenzahl konstant, wobei drei Grundtypen beobachtet werden: das zentrale Zentromer-Chromosom (M-), das distale Zentromer-Chromosom (T-) und das proximale Zentromer-Chromosom (A-). Darüber hinaus werden in natürlichen Populationen unterschiedliche Chromosomenformen und -größen beobachtet32.

Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist nützlich für den Nachweis von Chromosomenveränderungen, wie z. B. Zentromerfusion, Inversion, Genamplifikation und Fragmentdeletion. Die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnologie (RNA-FISH) ermöglicht die hochauflösende visuelle Analyse von Chromosomen, um mehrere komplexe Veränderungen zu erkennen und zu identifizieren, einschließlich der Fusion zentraler Chromosomenregionen, der Bildung neuer Chromosomenstrukturen, der Umkehrung von Chromosomenregionen, der Amplifikation von Genen oder Genfragmenten und des Verlusts von Gensequenzen in bestimmten Chromosomenregionen33. Fünf der 500 Klone zeigten starke FISH-Signale auf der Zentromerregion des zentralen Zentromer-Chromosoms (M-), nicht aber auf dem distalen Zentromer-Chromosom (T-)34. Das einzigartige FISH-Signalverteilungsmuster auf jedem Chromosom ermöglichte die Identifizierung einzelner Chromosomen, was zuvor in Lycoris-Populationen mit herkömmlichen Färbemethoden eine Herausforderung darstellte31. Derzeit gibt es nur wenige Studien zur molekularen Zytogenetik von Lycoris aurea (L'Hér.) Herb und betonte den dringenden Bedarf an weiterer Forschung auf diesem Gebiet.

In dieser Studie wurden acht gut differenzierte Metaphase-Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Die Kräuterpopulationen wurden mit Hilfe von Enzymimmersions- und Flammentrocknungsmethoden (EMF) präpariert. CPD-Färbung und 45S- und 5S-rDNA-Sonden wurden für die FISH-Identifizierung verwendet. Detaillierte molekularzytogenetische Karyotypen dieser Populationen wurden unter Verwendung kombinierter Daten aus Chromosomenmessungen, Fluoreszenzbanden und 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signalen konstruiert. Für jede Population wurden sechs verschiedene karyotypische Asymmetrieindizes berechnet, um karyotypische Beziehungen zwischen ihnen zu identifizieren. Die Auswertung der molekularzytogenetischen Karyotypdaten lieferte wichtige Einblicke in die genomische Differenzierung und die evolutionären Beziehungen der acht Populationen, was das Verständnis der Lycoris-Chromosomen möglicherweise verändern wird.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt, während die verwendeten Sonden in der Zusatzdatei 1 aufgeführt sind.

1. Präparation der apikalen Chromosomen

  1. Wurzel schlagen durch Hydrokultur. Nachdem Sie den oberirdischen Teil der Zwiebel entfernt haben, legen Sie ihn in eine konische Flasche, die mit Wasser gefüllt ist, und ersetzen Sie das Wasser alle 3 Tage, nach der von Song et al.35 beschriebenen Methode.
  2. Entfernen Sie aktiv wachsende Wurzelspitzen, wenn sie eine Länge von etwa 1,0 bis 2,0 cm erreichen, und behandeln Sie sie 1,0 h lang mit gesättigtem α-Bromonaphthalin bei 28 °C.
  3. Schneiden Sie die Wurzelspitzen auf ca. 1 cm ab und legen Sie sie in ein frisch zubereitetes Gemisch aus Methanol und Eisessig im Volumenverhältnis 3:1 bei Raumtemperatur (ca. 20-25 °C) für 2-3 h. Lagern Sie sie dann im Kühlschrank bei 4 °C, wie von She et al.36 beschrieben.
  4. Waschen Sie die festen Wurzelspitzen (2-3 mm) gründlich in doppelt destilliertem Wasser.
  5. Bereiten Sie eine Mischung aus Cellulase und Pektinhydrolase in 0,01 mM Zitronensäure-Natriumcitrat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,5 vor, wobei Celluase und Pektinhydrolase jeweils 1 % betragen. Legen Sie die vorbehandelten Wurzelspitzen in die Mischung und verdauen Sie sie bei 28 °C für 1,0-1,5 h.
  6. Waschen Sie die verdauten Wurzelspitzen mit doppelt destilliertem Wasser, geben Sie sie auf einen Objektträger und zerdrücken Sie sie gründlich mit dem Fixiermittel mit einer feinen Zange.
  7. Trocknen Sie die Objektträger über der Flamme einer Alkohollampe, bis der Wassernebel einfach verschwindet. Unter einem Phasenkontrastmikroskop werden Objektträger mit mehr als fünf Spaltphasen und ohne überlappende Chromosomen ausgewählt. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.

2. CPD-Färbung

  1. Bereiten Sie eine CPD-Lösung her, indem Sie PI und DAPI zu einem 30 % (v/v) Antifluoreszenz-Dämpfungsglied hinzufügen, wobei die Konzentration von PI 0,6 μg·mL-1 und die Konzentration von DAPI 3 μg·mL-1 beträgt.
  2. Trocknen Sie den Chromosomenträger bei 65 °C für 30 min.
  3. Pro Chromosomenträger werden 100 μl RNase A-Verdünnungsmittel (die RNase A-Speicherlösung, die 100-mal mit 2x SSC (Kochsalzlösung) verdünnt wird, was zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml führt, zugegeben. Decken Sie den Objektträger ab und erwärmen Sie ihn in einer 37 °C feuchten Kammer für 30-60 Minuten.
  4. Waschen Sie den Chromosomenpräparat mit 2x SSC bei Raumtemperatur für drei Intervalle von je 5 min.
  5. Waschen Sie den Chromosomenträger bei Raumtemperatur für 1-2 Minuten.
  6. Pro Chromosomenträger werden 200 μl Pepsin-Verdünnungsmittel (die Pepsin-Aufbewahrungslösung, die 100-mal mit 0,01 N HCl verdünnt wird, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erreichen) zugegeben. Decken Sie den Objektträger ab und inkubieren Sie ihn in einer feuchten Kammer bei 37 °C für 5-20 Minuten.
  7. Waschen Sie die Chromosomenabschnitte mit Reinstwasser bei Raumtemperatur für 2 min, gefolgt von einem Waschen mit 2 xSSC bei Raumtemperatur für zwei Intervalle von jeweils 5 min.
  8. Befestigen Sie die Objektträger mit Methanol: Eisessig (3:1) Lösung für 10 min.
  9. Mit 2x SSC bei Raumtemperatur in drei Intervallen von je 5 min waschen.
  10. Mit 70 %, 95 % und 100 % Ethanol bei -20 °C jeweils 5 min behandeln, dann bei Raumtemperatur trocknen.
  11. Nehmen Sie die behandelten und getrockneten Chromosomen-Objektträger, fügen Sie jedem Objektträger 30 μl CPD-Färbelösung hinzu, bedecken Sie sie mit einem 24 mm x 50 mm großen Deckglas und färben Sie es mehr als 30 Minuten lang im Dunkeln. Ausgedehntes Chromosomenmaterial sollte über Nacht angefärbt werden.
  12. Betrachten Sie die Chromosomen-Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem grünen Anregungsfilter (WG) für die PI-Färbung und einem Ultraviolett-Filter (UV) für die DAPI-Färbung. Nehmen Sie Bilder mit der kompatiblen Software auf.
    1. Passen Sie die Belichtungszeit durch die beiden Filter an, um während der Bildaufnahme eine ähnliche rote und blaue Fluoreszenzintensität zu erzielen. Das CPD-Bild wird aus den Graustufenbildern gewonnen, die mit PI und DAPI gefärbt wurden. Die Chromosomenvermessung und die Bildbearbeitung wurden mit der Software Adobe Photoshop durchgeführt.

3. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

  1. Bereiten Sie die Hybridlösung vor: FAD (10 μl), ssDNA (2 μl), 20× SSC (2 μl), 5S rDNA (1 μl), 45S rDNA (1 μl) und 50 % Glucansulfat (4 μl). Nach der Zubereitung die Hybridlösung zentrifugieren (2500 x g, 5-10 min, bei Raumtemperatur) und auf Eis legen.
  2. Legen Sie die gescannten Dias für 30-60 Minuten bei 65 °C in den Ofen.
  3. Entfernen Sie die gebackenen Objektträger, fügen Sie 100 μl 70%ige FAD-Denaturierungslösung hinzu, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und denaturieren Sie sie 2,5 Minuten lang in einem 85 °C Molekularhybridisierungsofen.
  4. Entfernen Sie das Deckglas und tauchen Sie die Objektträger sofort in 70 %, 90 % und 100 % kaltes Ethanol und trocknen Sie sie nacheinander jeweils 5 Minuten lang.
  5. Nehmen Sie die Objektträger heraus und lassen Sie sie mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
  6. Geben Sie 20 μl Hybridlösung in den Objektträger, legen Sie das Deckglas vorsichtig darauf, bis die Flüssigkeit vollständig verteilt ist, und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den abgedeckten Bereich des Objektträgers zu befeuchten.
  7. Legen Sie die Objektträger in eine Hybridschale, die mit 2× SSC getränkt ist (die Hybridschale sollte eine große Petrischale mit einem Deckel sein, der in Alufolie eingewickelt ist, um den Betrieb vor Licht zu erleichtern) und inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht (mindestens 6 Stunden).
  8. Die Chromosomen werden durch Einbetten mit 3 μgηmL-1 DAPI in einer 30%igen (v/v) Lösung von Vectashield H-100 gegengefärbt. Nehmen Sie das Bild mit kompatibler Software auf, wobei die blaue Fluoreszenz von DAPI durch das violette Licht des Filters und die rote Fluoreszenz von PI durch das grüne Licht angeregt wird.
    HINWEIS: Die FISH-Hybridisierung wurde unter Verwendung von 45S- und 5S-rDNA-Sonden auf zuvor CPD-gefärbten Objektträgern nach der von She et al.36 beschriebenen Methode durchgeführt.

4. Karyotyp-Analyse

  1. Wählen Sie fünf mitotische Metaphasenzellen für jede Population aus, in denen die Chromosomen gut verteilt (ohne Überlappung) und mäßig kondensiert sind (die Chromosomen sollten nicht maximal aggregiert sein, aber die Enden sollten nicht verklumpt sein), gemäß der von She et al.4 beschriebenen Methodik.
  2. Bestimmen Sie die absolute Länge jedes Chromosoms, indem Sie fünf Chromosomen mit der höchsten Konzentration während der Zellteilung auswählen.
  3. Messen Sie akribisch und präzise die Länge des langen Arms (L) und des kurzen Arms (S) jedes Chromosoms sowie die Größe jeder fluoreszierenden Pigmentbande auf dem Chromosom.
  4. Berechnen Sie die folgenden Parameter: (1) relative Chromosomenlänge (RL, haploider Prozentsatz); (2) Armverhältnis (AR = L/S, langer Arm/kurzer Arm); (3) Gesamtlänge des haploiden Chromosoms (TCL; Länge des Karyotyps); (4) durchschnittliche Chromosomenlänge (C); (5) Größe der Fluoreszenzbande (der prozentuale Anteil der Fluoreszenzbande im Verhältnis zur Länge des Chromosoms); (6) Abstand vom Zentromer zur rDNA-Stelle; (7) durchschnittlicher Zentromer-Index (KI, berechnet als die kurze Armlänge jedes Chromosoms dividiert durch die Gesamtlänge dieses Chromosoms, dann unter Mittelung dieser Werte); (8) vier verschiedene Indikatoren für die Asymmetrie des Karyotyps, darunter der Zentromerindex (CVCI), der Variationskoeffizient (CVCI), der Variationskoeffizient der Chromosomenlänge (CVCL), der mittlere Asymmetriekoeffizient des Zentromers (MCA) und die Kategorie der Stebbins-Asymmetrie.
    HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die Methoden von Paszko10 und Peruzzi et al.11 , um den Asymmetrieindex zu berechnen. Klassifizieren Sie Chromosomen mit unterschiedlichen Armverhältnissen gemäß den fünf Klassifikationsmethoden von Levan. Ordnen Sie die Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut in absteigender Reihenfolge der Länge, wie im Protokoll von Han et al.beschrieben 37.
  5. Stellen Sie die Präzision und Genauigkeit der Methodik sicher, indem Sie Chromosomenkaryotypmuster auf der Grundlage von Chromosomenmessdaten in Kombination mit Fluoreszenzbandeninformationen und der Position und Größe des rDNA-FISH zeichnen.
  6. Die Visualisierung der asymmetrischen Beziehungen des Karyotyps der acht Populationen ist ein wichtiger Schritt, der klare Erkenntnisse liefert. Dies wird durch zweidimensionale Streudiagramme erreicht, die zur Ermittlung ihrer MCA und CVCL verwendet werden.
  7. Führen Sie eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) unter Verwendung des Gower-Ähnlichkeitskoeffizienten, einer entscheidenden Komponente, nach den Methoden von She et al.38 durch.
  8. Berechnen Sie sechs quantitative Parameter (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI), um die zytogenetischen Karyotypen der acht Populationen zu bestimmen.
  9. Führen Sie statistische Analysen mit einem Datenanalyse- und Visualisierungsprogramm durch, um das UPGMA-basierte Dendrogramm und das PCoA-Streudiagramm zu erstellen.

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Ergebnisse

Unter Anwendung der sorgfältigen Methode der Enzymimmersion und Flammentrocknung (EMF) wurden verstreute und gut differenzierte Metaphase-Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Es wurden Kräuter gewonnen und der zytogenetische Chromosomenkaryotyp von Lycoris aurea konstruiert (Abbildung 1). Die Metaphase-Chromosomen mit dem höchsten Kondensationsgrad sind aufgrund der reduzierten morphologischen Unterschiede für die Karyotypanalyse ung...

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Diskussion

Die Zubereitung von Lycoris aurea (L'Hér.) Kräuterwurzelchromosomen umfassen mehrere kritische Schritte: (1) Kultivierung der Wurzeln durch Hydrokultur, (2) Behandlung der Wurzelspitzen mit gesättigtem α-Bromonaphthalin, (3) Fixierung der Wurzeln mit einer Alkohol-Essigsäure-Lösung, (4) Durchführung einer enzymatischen Hydrolyse an den Wurzelspitzen mit einer Enzymlösung und (5) gründliches Zerdrücken der verdauten Wurzeln und Trocknen der Objektträger über einer Alk...

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Offenlegungen

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32070367) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

Referenzen

  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

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