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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo studia la distribuzione dell'eterocromatina in otto popolazioni di Lycoris aurea (L'Her) Herb, utilizzando la colorazione cromosomica combinata PI e DAPI, l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con le regioni geniche 18S-5.8-26S rRNA (regioni 45S rDNA) e le sonde di DNA ribosomiale 5S.

Abstract

Per comprendere la variazione del cariotipo in otto popolazioni, i cariotipi dettagliati sono stati meticolosamente stabiliti utilizzando misurazioni cromosomiche, bande di fluorescenza e segnali rDNA FISH. Il numero di siti di rDNA 45S varia da una a cinque coppie per popolazione, con il numero più comune per cariotipo di quattro coppie. Il locus 45S rDNA è localizzato prevalentemente nei bracci corti e nelle regioni terminali dei cromosomi, mentre il locus 5S rDNA si trova principalmente nel braccio corto e nelle regioni terminali o prossimali. Le popolazioni HBWF, HNXN, HBBD e HNZX hanno mostrato una distribuzione simile dei siti di rDNA 45S, così come GXTL, HBFC e SCLS, indicando una stretta relazione tra popolazioni con distribuzioni simili di siti di rDNA 45S. I cariotipi di tutte le popolazioni studiate sono simmetrici, comprendenti centromeri stabili e metastabili o centromeri esclusivamente stabili. I grafici a dispersione di MCA e CVCL distinguono efficacemente le loro strutture cariotipiche. L'analisi include sei parametri quantitativi (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Inoltre, i risultati indicano che la PCoA basata su questi sei parametri è un metodo robusto per determinare le relazioni biologiche del cariotipo tra le otto popolazioni. Il numero di cromosomi nelle popolazioni di Lycoris è x = 6-8. Sulla base degli studi e della letteratura attuali, la differenziazione genomica di queste popolazioni è discussa in termini di dimensioni del genoma, eterocromatina, siti di rDNA 45S e 5S e asimmetria del cariotipo.

Introduzione

Lycoris è una famiglia che comprende diverse importanti piante orticole1. Lycoris aurea (L'Hér.) Erba. è una pianta medicinale tradizionale cinese con una lunga storia. L'analisi fitochimica ha dimostrato che Lycoris aurea (L'Her.) L'erba contiene galantamina e altri alcaloidi, che possono aumentare la sensibilità all'acetilcolina e hanno il potenziale per trattare il morbo di Alzheimer come inibitori della colinesterasi2.

Nelle piante superiori, l'analisi del cariotipo è fondamentale per l'integrazione di mappe genetiche e fisiche, con significative implicazioni pratiche per la biologia vegetale. Questa analisi consente la caratterizzazione del genoma a livello cromosomico, il chiarimento delle relazioni tassonomiche cellulari tra le popolazioni, l'identificazione delle aberrazioni genetiche e la comprensione delle tendenze dell'evoluzione cromosomica 3,4,5. Tipicamente, la descrizione di un cariotipo include il numero di cromosomi, le lunghezze cromosomiche assolute e relative, le posizioni di costrizione primaria e secondaria, la distribuzione dei frammenti eterocromatici, il numero e le posizioni dei siti di rDNA e altre caratteristiche della sequenza di DNA, nonché l'asimmetria del cariotipo 6,7,8. Tra i parametri del cariotipo, l'asimmetria è determinata dalle variazioni della lunghezza cromosomica (asimmetria intercromosomica) e della posizione del centromero (asimmetria intracromosomica). L'asimmetria del cariotipo è una caratteristica significativa che riflette la morfologia cromosomica ed è ampiamente utilizzata nella tassonomia delle cellule vegetali 9,10,11,12.

Spesso, l'assenza di marcatori cromosomici limita l'analisi del cariotipo e impedisce l'identificazione dei singoli cromosomi. Negli ultimi anni, la colorazione di Giemsa, il banding di fluorescenza e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) sono diventati popolari nell'analisi cromosomica delle piante. I doppi metodi di colorazione fluorescente, come la colorazione CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diammino-2-fenilindo) e la colorazione PI (ioduro di propile) / DAPI (nota come colorazione CPD), rivelano regioni eterocromatiche ricche di GC e AT sui cromosomi 4,13. Durante la metafase o il pachitene della mitosi vegetale, sequenze ripetute di DNA o lunghi segmenti di DNA possono generare segnali specifici nelle popolazioni vegetali attraverso l'ibridazione FISH 14,15,16.

Le bande fluorescenti e i segnali FISH forniscono marcatori utili per l'identificazione dei cromosomi. Misurando la lunghezza dei cromosomi, analizzando le caratteristiche delle bande di fluorescenza e confrontando le differenze del segnale FISH, è possibile costruire cariotipi citogenetici molecolari dettagliati di diversi germoplasmi o popolazioni vegetali. Questi cariotipi mostrano efficacemente la morfologia cromosomica in vari germoplasmi o popolazioni, consentendo confronti tra la distribuzione dell'eterocromatina e la localizzazione della sequenza del DNA e incoraggiando ulteriori ricerche 4,8,17. I confronti del cariotipo citogenetico molecolare possono offrire preziose informazioni sulle relazioni filogenetiche e sull'evoluzione cromosomica delle popolazioni correlate 8,14,18,19.

Il genere Lycoris , un gruppo diversificato e intrigante all'interno della famiglia Amaryllis, è noto per i suoi bulbi perenni. Composto da circa 20 specie, 15 delle quali endemiche della Cina, presenta una ricca biodiversità. Questo genere si trova esclusivamente nelle regioni temperate calde e subtropicali dell'Asia orientale, tra cui la Cina sud-occidentale, la Corea meridionale e il Giappone, con alcune popolazioni che si estendono fino all'India settentrionale e al Nepal20. I primi studi citogenetici hanno riguardato principalmente il conteggio dei cromosomi per stabilire il numero cromosomico di base del genere e per descrivere la morfologia cromosomica in popolazioni specifiche, concentrandosi in gran parte su Lycoris radiata21. Il numero totale di cromosomi osservato in questo genere varia da 12 a 33 o 44, rappresentando rispettivamente i livelli di diploidi, diploidi anormali, triploidi, tetraploidi e aneuploidi. I numeri cromosomici di base, x, sono 6, 7, 8 e 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) L'erba, una specie notevole all'interno del genere Lycoris , è ampiamente distribuita in tutta la Cina22. Prospera in ambienti rilassati e umidi e si riproduce attraverso piccoli bulbi. Questi bulbi, contenenti licurina e galantamina, due composti medicinali chiave, sono stati utilizzati per secoli nella medicina tradizionale cinese. La Lycoris aurea affascina anche gli orticoltori con i suoi sorprendenti fiori rossi in autunno e le foglie sempreverdi in inverno. Tuttavia, la somiglianza morfologica tra tutti gli studi di Lycoris aurea (L'Hér.) Le popolazioni di erbe aromatiche rappresentano una sfida significativa per l'identificazione cromosomica con i metodi citologici convenzionali.

Il clonaggio di FISH, fosmide o BAC (cromosomi artificiali batterici) con sequenze ripetitive di DNA e sonde oligonucleotidiche su cromosomi metafasici o pachidermici è stato utilizzato per l'analisi del cariotipo23,24,25, l'analisi citogenetica comparativa26,27, la costruzione di mappe citogenetiche28,29 e i saggi cromosomici specifici30. Recentemente, la tecnica FISH è stata applicata all'analisi cromosomica delle popolazioni di Lycoris 31. Sebbene il numero cromosomico e il cariotipo varino nelle popolazioni di Lycoris, il numero totale di cromosomi rimane costante, con tre tipi fondamentali osservati: il cromosoma centromero centrale (M-), il cromosoma centromero distale (T-) e il cromosoma centromero prossimale (A-). Inoltre, nelle popolazioni naturali si osservano diverse forme e dimensioni dei cromosomi32.

L'ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA (FISH) è utile per rilevare i cambiamenti cromosomici, come la fusione del centromero, l'inversione, l'amplificazione genica e la delezione di frammenti. La tecnologia RNA-FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) consente l'analisi visiva ad alta risoluzione dei cromosomi per rilevare e identificare molteplici cambiamenti complessi, tra cui la fusione delle regioni centrali dei cromosomi, la formazione di nuove strutture cromosomiche, l'inversione delle regioni cromosomiche, l'amplificazione di geni o frammenti genici e la perdita di sequenze geniche su specifiche regioni cromosomiche33. Cinque dei 500 cloni hanno mostrato forti segnali FISH sulla regione del centromero del cromosoma centrale (M-) ma non sul cromosoma distale del centromero (T-)34. L'esclusivo modello di distribuzione del segnale FISH su ciascun cromosoma ha permesso l'identificazione dei singoli cromosomi, che in precedenza era stata difficile nelle popolazioni di Lycoris utilizzando i metodi di colorazione tradizionali31. Attualmente, ci sono pochi studi sulla citogenetica molecolare di Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, sottolineando l'urgente necessità di ulteriori ricerche in questo campo.

In questo studio, otto cromosomi in metafase ben differenziati di Lycoris aurea (L'Hér.) Le popolazioni di erbe sono state preparate utilizzando metodi di immersione enzimatica ed essiccazione alla fiamma (EMF). Per l'identificazione dei FISH sono stati utilizzati la colorazione CPD e le sonde di rDNA 45S e 5S. I cariotipi citogenetici molecolari dettagliati di queste popolazioni sono stati costruiti utilizzando dati combinati provenienti da misurazioni cromosomiche, bande fluorescenti e segnali FISH di rDNA 45S e 5S. Per ciascuna popolazione sono stati calcolati sei diversi indici di asimmetria cariotipica per identificare le relazioni cariotipiche tra di loro. La valutazione dei dati del cariotipo citogenetico molecolare ha fornito informazioni significative sulla differenziazione genomica e sulle relazioni evolutive delle otto popolazioni, rimodellando potenzialmente la comprensione dei cromosomi di Lycoris .

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella dei materiali, mentre le sonde impiegate sono fornite nel File supplementare 1.

1. Preparazione dei cromosomi apicali

  1. Attecchisci per idroponica. Dopo aver rimosso la parte fuori terra del bulbo, mettilo in una bottiglia affusolata piena d'acqua, sostituendo l'acqua ogni 3 giorni, seguendo il metodo descritto da Song et al.35.
  2. Asportare le punte delle radici in crescita attiva quando raggiungono circa 1,0-2,0 cm di lunghezza e trattarle in α-bromonoftalene saturo a 28 °C per 1,0 ore.
  3. Tagliare le punte delle radici a circa 1 cm e metterle in una miscela appena preparata di metanolo e acido acetico glaciale in un rapporto di 3:1 in volume a temperatura ambiente (circa 20-25 °C) per 2-3 ore. Quindi, conservali in frigorifero a 4 °C, come descritto da She et al.36.
  4. Lavare accuratamente le punte delle radici fisse (2-3 mm) in acqua bidistillata.
  5. Preparare una miscela di cellulasi e pectina idrolasi in tampone acido citrico-sodio citrato 0,01 mM a pH 4,5, con cellulasi e pectina idrolasi ciascuna all'1%. Immergere le punte delle radici pretrattate nella miscela e digerire a 28 °C per 1,0-1,5 h.
  6. Lavare le punte delle radici digerite con acqua distillata a doppia distillazione, trasferirle su un vetrino e schiacciarle accuratamente con il fissativo utilizzando una pinza a punta fine.
  7. Asciugare i vetrini sulla fiamma di una lampada ad alcool fino a quando la nebbia d'acqua non scompare. Al microscopio a contrasto di fase, selezionare i vetrini con più di cinque fasi divise e senza cromosomi sovrapposti. Conservare i vetrini a -20 °C per un uso futuro.

2. Colorazione CPD

  1. Preparare una soluzione CPD aggiungendo PI e DAPI a un attenuatore antifluorescenza al 30% (v/v), dove la concentrazione di PI è 0,6 μg·mL-1 e la concentrazione di DAPI è 3 μg·mL-1.
  2. Asciugare il vetrino cromosomico a 65 °C per 30 minuti.
  3. Aggiungere 100 μL di diluente RNasi A (la soluzione di conservazione della RNasi A diluita 100 volte con 2x SSC (citrato di sodio salino), ottenendo una concentrazione finale di 100 μg/mL) per vetrino cromosomico. Coprire il vetrino e scaldarlo in una camera umida a 37 °C per 30-60 minuti.
  4. Lavare il vetrino cromosomico con 2x SSC a temperatura ambiente per tre intervalli di 5 minuti ciascuno.
  5. Lavare il vetrino cromosomico a temperatura ambiente per 1-2 minuti.
  6. Aggiungere 200 μl di diluente per pepsina (la soluzione di conservazione della pepsina diluita 100 volte con 0,01 N HCl per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL) per vetrino cromosomico. Coprire il vetrino e incubarlo in camera umida a 37 °C per 5-20 minuti.
  7. Lavare le sezioni cromosomiche con acqua ultrapura a temperatura ambiente per 2 minuti, quindi lavare con 2 xSSC a temperatura ambiente per due intervalli di 5 minuti ciascuno.
  8. Fissare i vetrini con metanolo: soluzione di acido acetico glaciale (3:1) per 10 min.
  9. Lavare con 2x SSC a temperatura ambiente per tre intervalli di 5 minuti ciascuno.
  10. Trattare con etanolo al 70%, 95% e 100% a -20 °C per 5 minuti ciascuno, quindi asciugare a temperatura ambiente.
  11. Prelevare i vetrini cromosomici trattati e asciugati, aggiungere 30 μl di soluzione colorante CPD a ciascun vetrino, coprire con un vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm e colorare al buio per più di 30 minuti. Il materiale cromosomico esteso deve essere colorato durante la notte.
  12. Osservare i vetrini cromosomici al microscopio a fluorescenza, utilizzando un filtro di eccitazione verde (WG) per la colorazione PI e un filtro ultravioletto (UV) per la colorazione DAPI. Cattura immagini con il software compatibile.
    1. Regola il tempo di esposizione attraverso i due filtri per ottenere intensità di fluorescenza del rosso e del blu simili durante l'acquisizione dell'immagine. L'immagine CPD è ottenuta dalle immagini in scala di grigi colorate con PI e DAPI. Le misurazioni cromosomiche e l'elaborazione delle immagini sono state eseguite utilizzando il software Adobe Photoshop.

3. Ibridazione in situ a fluorescenza

  1. Preparare la soluzione ibrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) e 50% glucano solfato (4 μL). Dopo la preparazione, centrifugare la soluzione ibrida (2500 x g, 5-10 min, a temperatura ambiente) e metterla sul ghiaccio.
  2. Mettere i vetrini scansionati in forno a 65 °C per 30-60 min.
  3. Rimuovere i vetrini cotti, aggiungere 100 μL di soluzione di denaturazione FAD al 70%, coprire con un vetro di copertura e denaturare in un forno di ibridazione molecolare a 85 °C per 2,5 minuti.
  4. Rimuovere il vetro di copertura e immergere immediatamente i vetrini in etanolo freddo al 70%, 90% e 100%, disidratandoli successivamente per 5 minuti ciascuno.
  5. Rimuovere i vetrini e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per più di 30 minuti.
  6. Aggiungere 20 μL di soluzione ibrida al vetrino, posizionare delicatamente il vetro di copertura sopra fino a quando il liquido non è completamente diffuso e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per inumidire l'area coperta del vetrino.
  7. Collocare i vetrini in una capsula ibrida imbevuta di 2× SSC (la capsula ibrida dovrebbe essere una grande capsula di Petri con un coperchio avvolto in carta stagnola per facilitare l'operazione al riparo dalla luce) e incubare a 37 °C per una notte (per almeno 6 ore).
  8. Controcolorare i cromosomi montandoli con 3 μg·mL-1 DAPI in una soluzione al 30% (v/v) di Vectashield H-100. Cattura l'immagine utilizzando un software compatibile, rispettivamente con la fluorescenza blu di DAPI eccitata dalla luce viola del filtro e la fluorescenza rossa di PI eccitata dalla luce verde.
    NOTA: L'ibridazione FISH è stata eseguita utilizzando sonde di rDNA 45S e 5S su vetrini precedentemente colorati con CPD, seguendo il metodo descritto da She et al.36.

4. Analisi del cariotipo

  1. Selezionare cinque cellule mitotiche di metafase per ogni popolazione in cui i cromosomi sono ben dispersi (senza sovrapposizioni) e moderatamente condensati (i cromosomi non devono essere aggregati al massimo, ma le estremità non devono essere raggruppate insieme), seguendo la metodologia descritta da She et al.4.
  2. Determina la lunghezza assoluta di ciascun cromosoma selezionando cinque cromosomi con la più alta concentrazione durante la divisione cellulare.
  3. Misura meticolosamente e con precisione la lunghezza del braccio lungo (L) e del braccio corto (S) di ciascun cromosoma, nonché la dimensione di ciascuna banda di pigmento fluorescente sul cromosoma.
  4. Calcolare i seguenti parametri: (1) lunghezza relativa dei cromosomi (RL, percentuale aploide); (2) rapporto tra le braccia (AR = L/S, braccio lungo/braccio corto); (3) lunghezza totale del cromosoma aploide (TCL; lunghezza del cariotipo); (4) lunghezza media dei cromosomi (C); (5) dimensione della banda di fluorescenza (la percentuale della banda di fluorescenza rispetto alla lunghezza del cromosoma); (6) distanza dal centromero al sito di rDNA; (7) indice medio del centromero (CI, calcolato come la lunghezza del braccio corto di ciascun cromosoma divisa per la lunghezza totale di quel cromosoma, quindi media di questi valori); (8) quattro diversi indicatori di asimmetria del cariotipo, tra cui l'indice del centromero (CVCI), il coefficiente di variazione (CV), il coefficiente di variazione della lunghezza del cromosoma (CVCL), il coefficiente medio di asimmetria del centromero (MCA) e la categoria di asimmetria di Stebbins.
    NOTA: Fare riferimento ai metodi di Paszko10 e Peruzzi et al.11 per calcolare l'indice di asimmetria. Classificare i cromosomi con diversi rapporti tra le braccia in base ai cinque metodi di classificazione di Levan. Disporre i cromosomi di Lycoris aurea (L'Hér.) Erba in ordine decrescente di lunghezza come descritto nel protocollo Han et al.37.
  5. Garantire la precisione e l'accuratezza della metodologia disegnando modelli di cariotipo cromosomico basati sui dati di misurazione dei cromosomi combinati con le informazioni sulla banda di fluorescenza e la posizione e le dimensioni dell'rDNA-FISH.
  6. Visualizzare le relazioni asimmetriche del cariotipo delle otto popolazioni è un passo chiave che fornisce intuizioni chiare. Ciò si ottiene attraverso grafici a dispersione bidimensionali, che vengono utilizzati per ottenere il loro MCA e CVCL.
  7. Eseguire l'analisi delle coordinate principali (PCoA) utilizzando il coefficiente di somiglianza di Gower, un componente cruciale, seguendo i metodi di She et al.38.
  8. Calcolare sei parametri quantitativi (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) per determinare i cariotipi citogenetici delle otto popolazioni.
  9. Conduci analisi statistiche utilizzando un programma di analisi e visualizzazione dei dati per generare il dendrogramma basato su UPGMA e il grafico a dispersione PCoA.

Risultati

Utilizzando il meticoloso metodo dell'immersione enzimatica e dell'essiccazione alla fiamma (EMF), i cromosomi in metafase sparsi e ben differenziati di Lycoris aurea (L'Hér.) Sono state ottenute erbe aromatiche ed è stato costruito il cariotipo cromosomico citogenetico di Lycoris aurea (Figura 1). I cromosomi in metafase con il più alto grado di condensazione non sono adatti per l'analisi del cariotipo a causa delle ridotte differenze m...

Discussione

La preparazione di Lycoris aurea (L'Hér.) I cromosomi delle radici delle erbe comprendono diversi passaggi critici: (1) coltivare le radici tramite idroponica, (2) trattare le punte delle radici con α-bromonaftalene saturo, (3) fissare le radici utilizzando una soluzione di acido acetico alcolico, (4) eseguire l'idrolisi enzimatica sulle punte delle radici con una soluzione enzimatica e (5) schiacciare accuratamente le radici digerite e asciugare i vetrini sulla fiamma di una ...

Divulgazioni

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation of China (32070367).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

Riferimenti

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