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Resumo

Este protocolo investiga a distribuição da heterocromatina em oito populações de Lycoris aurea (L′Her) Herb, usando coloração combinada dos cromossomos PI e DAPI, hibridização in situ fluorescente (FISH) com regiões do gene 18S-5.8-26S rRNA (regiões 45S rDNA) e sondas de DNA ribossômico 5S.

Resumo

Para entender a variação do cariótipo em oito populações, cariótipos detalhados foram meticulosamente estabelecidos usando medições cromossômicas, bandas de fluorescência e sinais de rDNA FISH. O número de sítios 45S rDNA varia de um a cinco pares por população, sendo o número mais comum por cariótipo quatro pares. O locus 45S rDNA está predominantemente localizado nos braços curtos e nas regiões terminais dos cromossomos, enquanto o locus 5S rDNA é encontrado principalmente no braço curto e nas regiões terminais ou proximais. As populações HBWF, HNXN, HBBD e HNZX mostraram uma distribuição semelhante de sítios de rDNA 45S, assim como GXTL, HBFC e SCLS, indicando uma estreita relação entre populações com distribuições de sítios de rDNA 45S semelhantes. Os cariótipos de todas as populações estudadas são simétricos, compreendendo centrômeros estáveis e metaestáveis ou centrômeros exclusivamente estáveis. Os gráficos de dispersão de MCA e CVCL distinguem efetivamente suas estruturas cariotípicas. A análise inclui seis parâmetros quantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Além disso, os resultados indicam que o PCoA baseado nesses seis parâmetros é um método robusto para determinar as relações do cariótipo biológico entre as oito populações. O número de cromossomos nas populações de Lycoris é x = 6-8. Com base no estudo e na literatura atuais, a diferenciação genômica dessas populações é discutida em termos de tamanho do genoma, heterocromatina, sítios de rDNA 45S e 5S e assimetria de cariótipo.

Introdução

Lycoris é uma família que inclui várias plantas hortícolas importantes1. Lycoris aurea (L'Hér.) Erva. é uma planta medicinal tradicional chinesa com uma longa história. A análise fitoquímica mostrou que Lycoris aurea (L'Her.) A erva contém galantamina e outros alcalóides, que podem aumentar a sensibilidade à acetilcolina e têm o potencial de tratar a doença de Alzheimer como inibidores da colinesterase.

Em plantas superiores, a análise do cariótipo é crucial para integrar mapas genéticos e físicos, com implicações práticas significativas para a biologia vegetal. Essa análise permite a caracterização do genoma em nível cromossômico, esclarecimento das relações taxonômicas celulares entre populações, identificação de aberrações genéticas e compreensão das tendências de evolução cromossômica 3,4,5. Normalmente, uma descrição de cariótipo inclui número de cromossomos, comprimentos cromossômicos absolutos e relativos, localizações de constrição primária e secundária, distribuição de fragmentos heterocromáticos, números e localizações de locais de rDNA e outras características da sequência de DNA, bem como assimetria de cariótipo 6,7,8. Entre os parâmetros cariotípicos, a assimetria é determinada por variações no comprimento cromossômico (assimetria intercromossômica) e na posição do centrômero (assimetria intracromossômica). A assimetria cariotípica é uma característica significativa que reflete a morfologia cromossômica e é amplamente utilizada na taxonomia de células vegetais 9,10,11,12.

Muitas vezes, a ausência de marcadores cromossômicos limita a análise do cariótipo e impede a identificação de cromossomos individuais. Nos últimos anos, a coloração de Giemsa, a banda de fluorescência e a hibridização in situ de fluorescência (FISH) tornaram-se populares na análise de cromossomos de plantas. Métodos de coloração fluorescente dupla, como a coloração CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenilindo) e a coloração PI (iodeto de propila) / DAPI (conhecida como coloração CPD), revelam regiões heterocromáticas ricas em GC e ricas em AT nos cromossomos 4,13. Durante a metáfase ou paquiteno da mitose vegetal, sequências repetidas de DNA ou longos segmentos de DNA podem gerar sinais específicos em populações de plantas por meio da hibridização FISH 14,15,16.

Bandas fluorescentes e sinais FISH fornecem marcadores úteis para a identificação de cromossomos. Medindo o comprimento do cromossomo, analisando as características da banda de fluorescência e comparando as diferenças do sinal FISH, cariótipos citogenéticos moleculares detalhados de diferentes germoplasmas ou populações de plantas podem ser construídos. Esses cariótipos exibem efetivamente a morfologia cromossômica em vários germoplasmas ou populações, permitindo comparações da distribuição da heterocromatina e localização da sequência de DNA e incentivando pesquisas futuras 4,8,17. As comparações de cariótipos citogenéticos moleculares podem oferecer informações valiosas sobre as relações filogenéticas e a evolução cromossômica de populações relacionadas 8,14,18,19.

O gênero Lycoris , um grupo diversificado e intrigante dentro da família Amaryllis, é conhecido por seus bulbos perenes. Composto por aproximadamente 20 espécies, 15 das quais são endêmicas da China, apresenta uma rica biodiversidade. Este gênero é encontrado exclusivamente em regiões temperadas e subtropicais quentes do leste da Ásia, incluindo sudoeste da China, sul da Coréia e Japão, com algumas populações que se estendem ao norte da Índia e Nepal20. Os primeiros estudos citogenéticos envolveram principalmente a contagem de cromossomos para estabelecer o número cromossômico básico do gênero e descrever a morfologia cromossômica em populações específicas, concentrando-se principalmente em Lycoris radiata21. O número total de cromossomos observados neste gênero varia de 12 a 33 ou 44, representando níveis diplóides, diplóides anormais, triploides, tetraplóides e aneuploides, respectivamente. Os números cromossômicos básicos, x, são 6, 7, 8 e 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, uma espécie notável dentro do gênero Lycoris , é amplamente distribuída por toda a China22. Ele prospera em ambientes relaxados e úmidos e se reproduz através de pequenos bulbos. Essas lâmpadas, contendo licorina e galantamina - dois compostos medicinais importantes - têm sido usadas na medicina tradicional chinesa há séculos. Lycoris aurea também cativa os horticultores com suas impressionantes flores vermelhas no outono e folhas perenes no inverno. No entanto, a semelhança morfológica entre todos os Lycoris aurea (L'Hér.) estudados As populações de ervas apresentam um desafio significativo para a identificação cromossômica usando métodos citológicos convencionais.

A clonagem de FISH, fosmídeo ou BAC (cromossomos artificiais bacterianos) com sequências repetitivas de DNA e sondas de oligonucleotídeos em cromossomos metafásicos ou paquidérmicos tem sido usada para análise de cariótipo23,24,25, análise citogenética comparativa26,27, construção de mapa citogenético28,29 e ensaios cromossômicos específicos30. Recentemente, a técnica FISH tem sido aplicada à análise cromossômica de populações de Lycoris 31. Embora o número de cromossomos e o cariótipo variem nas populações de Lycoris, o número total de cromossomos permanece constante, com três tipos básicos observados: o cromossomo do centrômero central (M-), o cromossomo do centrômero distal (T-) e o cromossomo do centrômero proximal (A-). Além disso, diversas formas e tamanhos cromossômicos são observados em populações naturais32.

A hibridização in situ de fluorescência de RNA (FISH) é útil para detectar alterações cromossômicas, como fusão de centrômeros, inversão, amplificação de genes e deleção de fragmentos. A tecnologia de hibridização in situ fluorescente (RNA-FISH) permite a análise visual de alta resolução dos cromossomos para detectar e identificar múltiplas alterações complexas, incluindo a fusão de regiões centrais cromossômicas, formação de novas estruturas cromossômicas, reversão de regiões cromossômicas, amplificação de genes ou fragmentos de genes e perda de sequência gênica em regiões cromossômicas específicas33. Cinco dos 500 clones mostraram fortes sinais de FISH na região do centrômero do cromossomo do centrômero central (M-), mas não no cromossomo do centrômero distal (T-) 34 . O padrão único de distribuição de sinal FISH em cada cromossomo permitiu a identificação de cromossomos individuais, o que anteriormente era um desafio em populações de Lycoris usando métodos tradicionais de coloração31. Atualmente, existem poucos estudos sobre a citogenética molecular de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, enfatizando a necessidade urgente de mais pesquisas neste campo.

Neste estudo, oito cromossomos metafásicos bem diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) As populações de ervas foram preparadas usando métodos de imersão enzimática e secagem por chama (EMF). A coloração CPD e as sondas 45S e 5S rDNA foram usadas para identificação de FISH. Cariótipos citogenéticos moleculares detalhados dessas populações foram construídos usando dados combinados de medições cromossômicas, bandas fluorescentes e sinais FISH de rDNA 45S e 5S. Seis diferentes índices de assimetria cariotípica foram calculados para cada população para identificar relações cariotípicas entre eles. A avaliação dos dados do cariótipo citogenético molecular forneceu informações significativas sobre a diferenciação genômica e as relações evolutivas das oito populações, potencialmente remodelando a compreensão dos cromossomos de Lycoris .

Protocolo

Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão detalhados na Tabela de Materiais, enquanto as sondas empregadas são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

1. Preparação dos cromossomos apicais

  1. Crie raízes pela hidroponia. Após a retirada da parte aérea do bulbo, coloque-o em uma garrafa cônica cheia de água, repondo a água a cada 3 dias, seguindo o método descrito por Song et al.35.
  2. Extirpar as pontas das raízes em crescimento ativo quando atingirem aproximadamente 1,0-2,0 cm de comprimento e tratá-las com α-bromonaftaleno saturado a 28 °C por 1,0 h.
  3. Corte as pontas das raízes em cerca de 1 cm e coloque-as em uma mistura recém-preparada de metanol e ácido acético glacial em uma proporção de volume de 3:1 à temperatura ambiente (cerca de 20-25 °C) por 2-3 h. Em seguida, armazene-os em geladeira a 4 °C, conforme descrito por She et al.36.
  4. Lave bem as pontas das raízes fixas (2-3 mm) em água bidestilada
  5. Prepare uma mistura de celulase e pectina hidrolase em tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,01 mM a pH 4,5, com celulase e pectina hidrolase cada uma a 1%. Coloque as pontas das raízes pré-tratadas na mistura e digerir a 28 °C durante 1,0-1,5 h.
  6. Lave as pontas das raízes digeridas com água bidestilada
  7. Seque as lâminas sobre a chama de uma lâmpada de álcool até que a névoa de água desapareça. Sob um microscópio de contraste de fase, selecione lâminas com mais de cinco fases divididas e sem cromossomos sobrepostos. Armazene as lâminas a -20 °C para uso futuro.

2. Coloração CPD

  1. Prepare uma solução de CPD adicionando PI e DAPI a um atenuador antifluorescência a 30% (v/v), onde a concentração de PI é de 0,6 μg·mL-1 e a concentração de DAPI é de 3 μg·mL-1.
  2. Secar a lâmina cromossómica a 65 °C durante 30 min.
  3. Adicione 100 μL de diluente RNase A (a solução de armazenamento de RNase A diluída 100 vezes com 2x SSC (citrato de sódio salino), resultando em uma concentração final de 100 μg / mL) por lâmina cromossômica. Cubra a lâmina e aqueça-a em uma câmara úmida a 37 °C por 30-60 min.
  4. Lave a lâmina cromossômica com 2x SSC em temperatura ambiente por três intervalos de 5 min cada.
  5. Lave a lâmina cromossômica em temperatura ambiente por 1-2 min.
  6. Adicione 200 μL de diluente de pepsina (a solução de armazenamento de pepsina diluída 100 vezes com 0,01 N HCl para atingir uma concentração final de 5 μg / mL) por lâmina cromossômica. Cubra a lâmina e incube-a em uma câmara úmida a 37 ° C por 5-20 min.
  7. Lave as seções cromossômicas com água ultrapura em temperatura ambiente por 2 min, seguida de lavagem com 2 xSSC em temperatura ambiente por dois intervalos de 5 min cada.
  8. Fixe as lâminas com metanol: solução de ácido acético glacial (3:1) por 10 min.
  9. Lave com 2x SSC em temperatura ambiente por três intervalos de 5 min cada.
  10. Trate com etanol 70%, 95% e 100% a -20 °C por 5 min cada e depois seque em temperatura ambiente.
  11. Pegue as lâminas cromossômicas tratadas e secas, adicione 30 μL de solução de coloração CPD a cada lâmina, cubra com uma lamínula de 24 mm x 50 mm e pinte no escuro por mais de 30 min. O material cromossômico extenso deve ser corado durante a noite.
  12. Observe as lâminas cromossômicas sob um microscópio de fluorescência, usando um filtro de excitação verde (WG) para coloração PI e um filtro ultravioleta (UV) para coloração DAPI. Capture imagens com o software compatível.
    1. Ajuste o tempo de exposição através dos dois filtros para obter intensidades de fluorescência vermelha e azul semelhantes durante a captura de imagem. A imagem CPD é obtida a partir das imagens em tons de cinza coradas com PI e DAPI. As medidas cromossômicas e o processamento das imagens foram realizados no software Adobe Photoshop.

3. Hibridização in situ de fluorescência

  1. Prepare a solução híbrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) e 50% de sulfato de glucano (4 μL). Após a preparação, centrifugue a solução híbrida (2500 x g, 5-10 min, à temperatura ambiente) e coloque-a sobre gelo.
  2. Coloque as lâminas digitalizadas no forno a 65 °C por 30-60 min.
  3. Remova as lâminas cozidas, adicione 100 μL de solução de desnaturação FAD a 70%, cubra com uma lamínula e desnature em um forno de hibridização molecular a 85 ° C por 2,5 min.
  4. Remova a lamínula e mergulhe imediatamente as lâminas em etanol frio 70%, 90% e 100%, desidratando sucessivamente por 5 min cada.
  5. Remova as lâminas e deixe-as secar em temperatura ambiente por mais de 30 min.
  6. Adicione 20 μL de solução híbrida à lâmina, coloque suavemente a lamínula por cima até que o líquido esteja completamente difundido e deixe-a em temperatura ambiente por 10 min para umedecer a área coberta da lâmina.
  7. Colocar as lâminas numa placa híbrida embebida em 2× SSC (a placa híbrida deve ser uma placa de Petri grande com uma tampa envolvida em folha de estanho para facilitar a operação ao abrigo da luz) e incubar a 37 °C durante a noite (durante pelo menos 6 h).
  8. Contra-corar os cromossomos montando-os com 3 μg · mL-1 DAPI em uma solução a 30% (v / v) de Vectashield H-100. Capture a imagem usando um software compatível, com a fluorescência azul do DAPI excitada pela luz roxa do filtro e a fluorescência vermelha do PI excitada pela luz verde, respectivamente.
    NOTA: A hibridização de FISH foi realizada usando sondas de rDNA 45S e 5S em lâminas previamente coradas com CPD, seguindo o método descrito por She et al.36.

4. Análise de cariótipo

  1. Selecione cinco células mitóticas metafásicas para cada população em que os cromossomos estejam bem dispersos (sem sobreposição) e moderadamente condensados (os cromossomos não devem ser agregados ao máximo, mas as extremidades não devem ser agrupadas), seguindo a metodologia descrita por She et al.4.
  2. Determine o comprimento absoluto de cada cromossomo selecionando cinco cromossomos com a maior concentração durante a divisão celular.
  3. Meça meticulosamente e com precisão o comprimento do braço longo (L) e do braço curto (S) de cada cromossomo, bem como o tamanho de cada banda de pigmento fluorescente no cromossomo.
  4. Calcule os seguintes parâmetros: (1) comprimento relativo do cromossomo (RL, porcentagem haplóide); (2) relação braço (AR = L/S, braço longo/braço curto); (3) comprimento total do cromossomo haploide (TCL; comprimento do cariótipo); (4) comprimento cromossômico médio (C); (5) tamanho da banda de fluorescência (a porcentagem da banda de fluorescência em relação ao comprimento do cromossomo); (6) distância do centrômero ao sítio do rDNA; (7) índice médio de centrômero (IC, calculado como o comprimento do braço curto de cada cromossomo dividido pelo comprimento total desse cromossomo, calculando a média desses valores); (8) quatro indicadores diferentes de assimetria do cariótipo, incluindo o índice de centrômero (CVCI), coeficiente de variação (CV), coeficiente de variação do comprimento do cromossomo (CVCL), coeficiente de assimetria média do centrômero (MCA) e categoria de assimetria de Stebbins.
    NOTA: Consulte os métodos de Paszko10 e Peruzzi et al.11 para calcular o índice de assimetria. Classifique os cromossomos com diferentes proporções de braço de acordo com os cinco métodos de classificação de Levan. Organizar os cromossomas de Lycoris aurea (L'Hér.) Erva em ordem decrescente de comprimento, conforme descrito no protocolo de Han et al.37.
  5. Garantir a precisão e exatidão da metodologia desenhando padrões de cariótipo cromossômico com base em dados de medição cromossômica combinados com informações de banda de fluorescência e a posição e tamanho do rDNA-FISH.
  6. Visualizar as relações assimétricas do cariótipo das oito populações é uma etapa fundamental que fornece insights claros. Isso é conseguido por meio de gráficos de dispersão bidimensionais, que são usados para obter seu MCA e CVCL.
  7. Realizar a análise de coordenadas principais (PCoA) usando o coeficiente de similaridade de Gower, um componente crucial, seguindo os métodos de She et al.38.
  8. Calcule seis parâmetros quantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) para determinar os cariótipos citogenéticos das oito populações.
  9. Realize análises estatísticas usando um programa de análise e visualização de dados para gerar o dendrograma baseado em UPGMA e o gráfico de dispersão de PCoA.

Resultados

Empregando o método meticuloso de imersão enzimática e secagem por chama (EMF), cromossomos metafásicos dispersos e bem diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb foram obtidos, e o cariótipo cromossômico citogenético de Lycoris aurea foi construído (Figura 1). Os cromossomos metafásicos com maior grau de condensação são inadequados para análise de cariótipo devido às diferenças morfológicas reduzidas. No entanto, como o...

Discussão

A preparação de Lycoris aurea (L'Hér.) Os cromossomos da raiz da erva envolvem várias etapas críticas: (1) cultivar raízes via hidroponia, (2) tratar as pontas das raízes com α-bromonaftaleno saturado, (3) fixar as raízes usando uma solução de ácido álcool-acético, (4) realizar hidrólise enzimática nas pontas das raízes com uma solução enzimática e (5) esmagar completamente as raízes digeridas e secar as lâminas sobre uma chama de lâmpada de álcool.

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Divulgações

Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da China (32070367).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is added to both ends (5 'and 3' ends)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturation
Anti-burnout agentSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Citric acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deionized formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dextran sulfateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situ hybridization instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus China Co.ltdBX60
Glacial acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Ice machineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biological microscopeGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Salmon sperm DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Sodium citrateAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 for statistical analysis

Referências

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