نموذج التئام الجروح الحروق الشبيه برقعة الشطرنج للفئران على أساس جهاز التسخين الرقمي

Summary

يتم تقديم بروتوكول مبسط لإنشاء نموذج التئام جروح الحروق في الفئران باستخدام جهاز تسخين رقمي. تسهل المواقع التجريبية الشبيهة برقعة الشطرنج التي تم إنشاؤها على الجلد مزيدا من التحليل الوظيفي لمقايسة التئام الجروح.

Abstract

تعد إصابات الحروق الشديدة من بين أكثر الحالات المؤلمة والمنهكة جسديا ، حيث تؤثر على كل جهاز أعضاء تقريبا وتؤدي إلى مراضة ووفيات كبيرة. نظرا لتعقيدها وتورط أعضاء متعددة ، تم إنشاء نماذج حيوانية مختلفة لتكرار جوانب مختلفة من إصابة الحروق. تختلف الطرق المستخدمة لإنتاج الأسطح المحترقة بين النماذج الحيوانية التجريبية. تصف هذه الدراسة نموذجا بسيطا وفعالا من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لعمل حروق متسقة كاملة السماكة باستخدام جهاز تسخين رقمي. تم تطبيق طرف هذا الجهاز على ظهر الفئران لمدة 10 ثوان عند 97 درجة مئوية لإنشاء حرق يشبه رقعة الشطرنج وفحص التئام الجروح تحت علاج ضمادة تجريبية. تم جمع عينات الجلد للتحليل النسيجي ، بما في ذلك تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتلوين ماسون. تم تقييم التئام الجروح من خلال تحليل منطقة الجرح والفحص المجهري للتسلل الالتهابي وإعادة الظهارة وتكوين الأنسجة الحبيبية. يمكن أن يكون نموذج إصابة حروق الفئران بمثابة أداة أساسية في دراسة الفيزيولوجيا المرضية للإصابات الحرارية وتقييم التدخلات العلاجية.

Introduction

تعتبر الحروق من الإصابات الخطيرة للجلد ، والتي تسببها التعرض للحرارة والكهرباء والمواد الكيميائية والتعرض^{للإشعاع 1،2}. يمكن تصنيفها إلى أربع درجات حسب عمق الإصابة ، بدءا من البشرة إلى السماكة الكاملة للجلد ، وحتى العضلات والعظام. يمكن أن تؤدي الحروق الصغيرة إلى تكوين ندبات وتزيد من خطر الإصابة بالعدوى. لا تسبب مساحة كبيرة من إصابات الحروق أضرارا موضعية فحسب ، بل تحفز أيضا اضطرابات القلب والكلى والأعضاء أو الأنظمة الأخرى في الجسم من خلال الالتهابات الشديدة والطويلة الأمد والاستجابات المناعية ، مما يؤدي إلى عواقب جهازية خطيرة وارتفاع معدلات^{المراضة 3}. يرافق معظم الناجين من إصابات الحروق إعاقات جسدية طويلة الأمد وضيق عاطفي وانخفاض نوعية^{الحياة 4،5}. لذلك ، من المهم دراسة العملية المرضية للحروق وآليات تجديد الأنسجة المحروقة.

تشارك في الاستجابات المناعية ، وتجديد الأنسجة ، والتوازن المنهجي ، لم تستطع الدراسات المختبرية التحقيق بشكل شامل في العملية المرضية لالتئام جروح الحروق. وهكذا ، على مدى العقدين الماضيين ، من أجل استكشاف التدخلات العلاجية المحتملة ، تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة لشفاء جروح الحروق لتكرار السمات المختلفة لإصابة الحروق^6،7. عادة ما تنتج جروح الحروق على السطح الظهري للخنازير والجرذان والفئران والأرانب الأخرى بعد إزالة الشعر. يمكن أن يستمر وقت الاحتراق لمدة 3 ثوان إلى 30 ثانية لتشكيل ضرر حراري جزئي إلى كامل السماكة مع نطاق من 5٪ إلى 30٪ من إجمالي مساحة سطح الجسم (TBSA) ⁸. لا توجد حاليا نماذج موحدة لهذه الأساليب في أبحاث الحروق بسبب التباين الكبير في التقنيات المستخدمة. تختلف الطرق المستخدمة لإنتاج الأسطح المحترقة بين النماذج الحيوانية التجريبية ، بما في ذلك لهب الغاز⁹ ، وحمام الإيثانول المحترق¹⁰ ، واللوح / القضيب المعدني المفرد المسخن^{مسبقا 11،12} ، والماء المغلي أو الساخن^13،14. ومع ذلك ، فإن تقنية إحداث الحروق وعمق الحروق الناتج غالبا ما تكون غير متسقة وسيئة الوصف في الدراسات السابقة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تحديد شدة الحرق وطريقة علاج الحروق.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج حيواني بسيط وفعال من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لخلق حروق متسقة كاملة السماكة في سيناريوهات سريرية محاكاة. في هذا البروتوكول ، استخدمنا جهاز تسخين رقمي مناسب للتحكم في عمق الحرق عن طريق ضبط درجة الحرارة المطبقة على الجلد. يمكن تبديل طرف هذا الجهاز إلى أحجام مختلفة لإحداث حروق حرارية بنطاقات متفاوتة من TBSA. يسمح ذلك بإنشاء جرح حروق يشبه رقعة الشطرنج على ظهر الفأر ، مما يتيح مقارنة العديد من العلاجات التجريبية والعلاجات الضابطة داخل نفس. لاحظنا وسجلنا عملية إغلاق الجرح. تم حصاد عينات الجلد للتقييم النسيجي (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتلوين ماسون ثلاثي الألوان) في مراحل مختلفة من التئام الجروح. يقلل هذا النهج من عدد المستخدمة في التجربة ، وبالتالي يقلل من التكاليف الاقتصادية مع كونه أكثر توافقا مع أخلاقيات. ستزود هذه الدراسة الباحثين بالأدوات الأساسية لتسهيل تطوير علاجات جديدة لإصابات الحروق والكشف عن الآليات الفيزيولوجية المرضية لالتئام جروح الحروق.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2024-499). تم استخدام أربعة وعشرين فأرا C57BL / 6 يبلغ من العمر ثمانية أسابيع (أنثى ، وزن الجسم 25-30 جم) في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المعدات والفأر قبل إصابة الحروق

1. احصل على ووضعها في أقفاص لمدة 7 أيام عند وصولها للسماح لها بالتأقلم مع البيئة.
2. تعقيم منطقة العمل عن طريق الرش والمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول (v / v). قم بتغطية طاولة العمليات بضمادات ماصة جراحية معقمة.
3. اضبط درجة حرارة جهاز التسخين الرقمي على 97 درجة مئوية. يتكون جهاز التسخين من ثلاثة أجزاء (الشكل 1).
   ملاحظة: يمكن ضبط درجة الحرارة من 50-450 درجة مئوية من خلال وحدة التحكم في درجة الحرارة (الشكل 1 أ). يتم استخدام قاعدة الحامل لوضع الطرف (الشكل 1 ب) ، والذي يمكن تفكيكه (الشكل 1 ج) لاستبدال أحجام الأدوات المختلفة. تطهير الطرف باليودوفور أو الكحول.
4. قم بتخدير الفأر باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران في 100٪ أكسجين في غرفة الحث لمدة 3 دقائق (معدل التدفق: 4 لتر / دقيقة) حتى يتباطأ التنفس. تقييم عمق التخدير باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم.
   ملاحظة: قد يؤدي استنشاق الأيزوفلوران إلى النعاس وإلحاق الضرر بنظام القلب والأوعية الدموية. من الضروري ارتداء معدات واقية والتعامل معها داخل غطاء الدخان في منطقة جيدة التهوية.
5. بمجرد تخدير الفأر بعمق ، انقله إلى وسادة ساخنة في وضع الانبطاح للحفاظ على الدفء ومنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التعافي من التخدير. قلل الأيزوفلوران إلى 1. 5٪ أكسجين للصيانة عبر مخروط الأنف.
6. ضع جل التشحيم على كلتا عيني الفأر بقطعة قطن لمنع جفاف القرنية.

2. إحداث إصابة حروق كاملة السماكة

ملاحظة: تظهر العملية العامة لتحريض الحرق وتحليله في الشكل 2.

1. احلق جلد الفأر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية على مساحة يبلغ طولها حوالي 5 سم وعرضها 4 سم من الرقبة إلى الذيل. اعمل بلطف لتجنب إصابة الجلد عند الحلاقة (الشكل 3 ج).
2. استخدمي قضيبا قطنيا لوضع كريم مزيل الشعر على منطقة الجلد المحلوقة لمدة 3 دقائق (الشكل 3 د).
   ملاحظة: تجنب وضع كريم إزالة الشعر على أجزاء أخرى من الماوس لمنع الحروق التي يصعب اكتشافها. تسبب الكريم في حدوث طفح جلدي إذا تم استخدامه لأكثر من 5 دقائق. تختلف المدة الدقيقة للفعالية المثلى بين المنتجات ويجب أن يحددها المشغل.
3. امسحي الكريم باستخدام شاش رطب حتى لا يتم اكتشاف الكريم والشعر. تطهير المنطقة الجراحية بمقشر الكلورهيكسيدين متبوعا ب 70٪ إيثانول (v / v) ثلاث مرات لكل منهما. نظف وجفف المنطقة بشاش معقم.
4. استخدم طرف ماصة معقم سعة 1 مل بقطر 9 مم (الشكل 3 أ) مغموس في حبر معقم لتحديد مواقع الجرح المرغوبة بدقة. يتميز الجلد الظهري للفأر بتضاريس غير متساوية. يعد تحديد منطقة الجرح بعيدا عن الحبل الشوكي للفئران أمرا ضروريا لضمان التكرار.
5. قم بتغطية الجلد بستارة معقمة مشذبة مسبقا ، مع ترك منطقة الجراحة خالية (الشكل 3). ارتد قفازات مقاومة للحرارة وتحقق من درجة حرارة جهاز التسخين الرقمي. قبل وبعد تحريض الحرق ، قم بتعقيم طرف الجهاز بنسبة 70٪ من الإيثانول (v / v).
6. ضع طرف جهاز التسخين على وسط مواقع الجرح الموجودة (97 درجة مئوية لمدة 10 ثوان) لإنشاء ستة جروح مستديرة بقطر 4 مم (الشكل 3 ب). الفاصل الزمني بين الحروق المجاورة هو 0.5-1 سم. تحديد عدد الحروق حسب التصميم التجريبي.
   ملاحظة: الحرق ناتج بشكل رئيسي عن التوصيل الحراري. لذلك ، ليس من الضروري ممارسة الضغط على القضيب ، أي إبقائه ملامسا للجلد عن طريق الجاذبية أثناء تحريض الحرق. كانت هناك ستة حروق للتصميم التجريبي. هذا هو الحد الأقصى لعدد جروح الحروق التي يمكن بناؤها وفقا للجهاز الذي استخدمناه ومساحة ظهر الفأر. يمكن تحقيق تكرارات متعددة من نفس المجموعة التجريبية على هذا الأساس.

3. رعاية وقياس ما بعد الحرق

1. ضع الثلج على جرح الحروق لمدة 5 دقائق لتقليل الألم المحتمل لإدارة الألم (الشكل 3G).
2. قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران ، وإزالة مخروط الأنف بعد إصابة الحروق. انقل الماوس إلى وسادة تدفئة حتى يتحرك الماوس بشكل طبيعي (على سبيل المثال ، لا يجلس أو يرتجف).
3. ضع كل فأر في قفص استرداد لمنعهم من خدش بعضهم البعض. قم بتليين بعض كريات الطعام عن طريق إضافة 5-10 قطرات من ماء الشرب إلى كل حبيبات وضعها على أرضية القفص لتسهيل التغذية.
   ملاحظة: تعقيم الأقفاص بالرش والمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول (vol / vol). يجب استبدال الفراش بانتظام للحفاظ على دفء الفئران وامتصاص البول.
4. يتم تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد في مكان ذيلية مرتين يوميا لمدة 3 أيام، مع ضمان 8 ساعات على الأقل بين الحقن.
5. نظف جميع الجروح بشاش معقم مبلل بالمحلول الملحي بعد 24 ساعة من تحريض الحروق. امسح الجلد بالشاش واستخدم كمية صغيرة من الجل المضاد للبكتيريا (TKH hydrogel) باستخدام حقنة لتغطية جرح الحروق^12،14. كرر هذا الإجراء في الأيام 3 و 7 و 10 بعد ذلك.
6. استخدم ضمادة شفافة ومسامية لتغطية الجروح. يجب أن يغطي حجم الضمادة حوالي 1 سم حول الجرح ويجب ألا يغطي المنطقة دون إزالة الشعر.
   ملاحظة: قم بتغيير ضمادة الجرح مرة واحدة على الأقل كل يومين. قد يؤدي الاستخدام المطول للضمادة دون استبدال إلى عدوى الجرح بتكوين القيح ، مما يؤدي إلى تأخر التئام الجروح.
7. طوال فترة المتابعة ، قم بقياس الوزن كل 2-3 أيام. بشكل عام ، يجب التضحية بالفئران التي تفقد 15٪ -20٪ من وزن جسمها الأولي وإزالتها من التجربة.

4. جمع الجروح

1. في 0 و 3 و 7 و 10 و 14 يوما ، ضع علامة على الجرح بطرف طرف ماصة معقمة سعة 1 مل ، وقم بتسجيله بكاميرا رقمية.
2. القتل الرحيم للفئران عن طريق جرعة زائدة من التخدير وخلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة من المؤسسة).
   ملاحظة: كن حذرا أثناء خلع عنق الرحم لتجنب الشد المفرط ، مما قد يؤدي إلى تلف جروح الظهر.
3. باستخدام المقص ، اعزل موقع الجرح والجلد المحيط به ، بما في ذلك العضلات الأساسية (1 سم × 1 سم). استعد لثلاث عينات على الأقل لكل مجموعة.
4. ثبت عينات الجلد في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 24 ساعة وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب أن يكون حجم التثبيت 30 ضعف حجم الأنسجة^15،16.
   ملاحظة: PFA خطير. تأكد من العمل في منطقة جيدة التهوية واستخدام معدات الحماية المناسبة.

5. تقييم التئام الجروح

1. اغسل مناديل الجرح مرتين باستخدام PBS وانشرها بورق ترشيح ، والذي يجب قصه بحجم مناسب (الشكل 2H). نظرا لوجود بعض المحتوى المخاطي داخل طبقة الأنسجة تحت الجلد ، فإنه يلتصق بسطح ورق الترشيح دون حركة أو تجعيد الأنسجة.
   1. ضع ورق الترشيح والعينة في كاسيت مناديل لتجفيف البارافين للحصول على عينات من الأنسجة الملساء نسبيا ثم قم بتضمين الأنسجة^15،16. تخزين العينات في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بتمديد الأنسجة قدر الإمكان وتجنب أي طي ، حيث ستصبح هذه الطيات دائمة بعد التثبيت.
2. قم بقص العينات المضمنة في البارافين إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر وشرائح البقع عبر H & E و Masson trichrome لتقييم مدى الأنسجة الحبيبية ، وتكوين الأوعية الدموية ، وترسب الكولاجين ، مما يوفر دليلا لتقييم المراحل المختلفة وتطور التئام الجروح^17،18.
3. التقط صورا لجميع العينات باستخدام مجهر بهدف 40x.
4. استخدم برنامجا متوافقا لتحليل قسم الجلد الملطخ ، بما في ذلك البشرة والأدمة والأنسجة تحت الجلد وحالة العضلات.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم إنشاء جروح حروق تشبه رقعة الشطرنج بمدة حرق تبلغ 10 ثوان عند 97 درجة مئوية بواسطة جهاز التسخين الرقمي (الشكل 1). طرف الجهاز مصنوع من النحاس النقي المعروف بالتوصيل الحراري الممتاز وقدرات التسخين السريع. القبضة التي يحملها المجرب مصنوعة ?...

Discussion

بالنسبة لدراسات الحروق ، تركز النماذج المختبرية عادة على التأثيرات المثبطة للعوامل المضادة للميكروبات المحلية أو المضادات الحيوية على البكتيريا المرتبطة بالحروق ، مثل المكورات العنقودية الذهبية و Pseudomonas aeruginosa¹⁹ ، بالإضافة إلى تأثير المواد ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding