Schachbrettartiges Brandwundenheilungsmodell von Mäusen basierend auf digitalem Heizgerät

Zusammenfassung

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Etablierung eines Brandwundenheilungsmodells bei Mäusen mit einem digitalen Heizgerät vorgestellt. Die auf der Haut angelegten schachbrettartigen Experimentierstellen ermöglichen die weitere Funktionsanalyse für den Wundheilungstest.

Zusammenfassung

Schwere Brandverletzungen gehören zu den traumatischsten und körperlich belastendsten Erkrankungen, die fast jedes Organsystem betreffen und zu einer erheblichen Morbidität und Mortalität führen. Aufgrund ihrer Komplexität und der Beteiligung mehrerer Organe wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt, um verschiedene Facetten von Brandverletzungen nachzubilden. Die Methoden, die zur Herstellung verbrannter Oberflächen verwendet werden, variieren zwischen den experimentellen Tiermodellen. Diese Studie beschreibt ein einfaches, kostengünstiges und benutzerfreundliches Mausbrennmodell zur Erzeugung konsistenter Verbrennungen in voller Dicke mit einem digitalen Heizgerät. Die Spitze dieses Gerätes wurde 10 s lang bei 97 °C auf den Rücken von Mäusen aufgebracht, um eine schachbrettartige Verbrennung zu etablieren und die Wundheilung unter der Behandlung eines experimentellen Verbandes zu untersuchen. Hautproben wurden für die histologische Analyse entnommen, einschließlich der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und der Masson-Färbung. Die Wundheilung wurde durch Analyse des Wundbereichs und mikroskopische Untersuchung der entzündlichen Infiltration, der Reepithelisierung und der Bildung von Granulationsgewebe beurteilt. Das Modell der Verbrennung von Mäusen kann als grundlegendes Werkzeug für die Untersuchung der Pathophysiologie thermischer Verletzungen und die Bewertung therapeutischer Interventionen dienen.

Einleitung

Verbrennungen gelten als eine der kritischen Verletzungen der Haut, die durch Hitzeeinwirkung, Elektrizität, chemische Materialien und Strahlenbelastung verursacht^{werden 1,2}. Sie kann je nach Tiefe der Verletzung in vier Grade eingeteilt werden, die von der Epidermis über die gesamte Dicke der Haut bis hin zu den Muskeln und Knochen reichen. Kleine Verbrennungen können zur Narbenbildung führen und das Infektionsrisiko erhöhen. Eine großflächige Brandverletzung verursacht nicht nur lokale Schäden, sondern stimuliert auch Erkrankungen des Herzens, der Nieren und anderer Organe oder Systeme des Körpers durch schwere und langfristige Entzündungen und Immunreaktionen, was zu schwerwiegenden systemischen Folgen und hoher Morbidität führt³. Die meisten Überlebenden von Brandverletzungen gehen mit lang anhaltenden körperlichen Behinderungen, emotionalen Belastungen und einer verminderten Lebensqualität einher ^4,5. Daher ist es wichtig, den pathologischen Prozess von Verbrennungen und die Mechanismen der Regeneration von verbranntem Gewebe zu untersuchen.

In-vitro-Studien, die an Immunantworten, Geweberegeneration und systematischer Homöostase beteiligt sind, konnten den pathologischen Prozess der Heilung von Brandwunden nicht umfassend untersuchen. Um mögliche therapeutische Interventionen zu erforschen, wurden daher in den letzten zwei Jahrzehnten verschiedene Tiermodelle zur Heilung von Brandwunden entwickelt, um die verschiedenen Merkmale der Brandverletzung zu replizieren ^6,7. Brandwunden entstehen in der Regel auf der Rückenoberfläche von Schweinen, Ratten, Mäusen, Kaninchen und anderen Tieren nach der Haarentfernung. Die Brenndauer kann 3 s bis 30 s betragen, um teilweise bis vollständige thermische Schäden mit einem Bereich von 5 % bis 30 % der gesamten Körperoberfläche (TBSA)⁸ zu bilden. Aufgrund der hohen Variabilität der angewandten Techniken gibt es derzeit keine standardisierten Modelle dieser Methoden in der Verbrennungstierforschung. Die Verfahren zur Herstellung verbrannter Oberflächen variieren je nach Versuchstiermodell, einschließlich Gasflamme⁹, brennendes Ethanolbad¹⁰, vorgewärmte einzelne Metallplatte/-stange^11,12, siedendes oder heißes Wasser^13,14. Die Technik der Brandzufügung und die erzeugte Verbrennungstiefe sind jedoch in früheren Studien oft widersprüchlich und schlecht beschrieben, was für die Bestimmung der Schwere der Verbrennung und der Methode der Verbrennungsbehandlung von entscheidender Bedeutung ist.

Ziel dieser Studie ist es, ein einfaches, kostengünstiges und benutzerfreundliches Tiermodell für Mausverbrennungen zu entwickeln, um konsistente Verbrennungen in voller Dicke in simulierten klinischen Szenarien zu erzeugen. In diesem Protokoll haben wir ein praktisches digitales Heizgerät verwendet, um die Tiefe der Verbrennung zu steuern, indem wir die auf die Haut ausgeübte Temperatur anpassen. Die Spitze dieses Geräts kann auf verschiedene Größen umgeschaltet werden, um thermische Verbrennungen mit unterschiedlichen TBSA-Bereichen zu induzieren. Dies ermöglicht die Erzeugung einer schachbrettartigen Brandwunde auf dem Rücken der Maus, die den Vergleich mehrerer Versuchs- und Kontrollbehandlungen innerhalb desselben Tieres ermöglicht. Wir beobachteten und protokollierten den Prozess des Wundverschlusses. Hautproben wurden für die histologische Beurteilung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung) in verschiedenen Stadien der Wundheilung entnommen. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der im Versuch verwendeten Tiere und senkt somit die wirtschaftlichen Kosten, während er gleichzeitig besser mit der Tierethik vereinbar ist. Diese Studie wird den Forschern wichtige Werkzeuge an die Hand geben, um die Entwicklung neuartiger Behandlungen für Verbrennungsverletzungen zu erleichtern und die pathophysiologischen Mechanismen der Heilung von Brandwunden aufzudecken.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2024-499). Für die vorliegende Studie wurden vierundzwanzig acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse (weiblich, Körpergewicht 25-30 g) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Ausrüstung und Maus vor Verbrennungen

1. Erwerben Sie die Tiere und halten Sie sie nach ihrer Ankunft 7 Tage lang in Käfigen, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können.
2. Sterilisieren Sie den Arbeitsbereich durch Besprühen und Wischen mit 70% Ethanol (v/v). Decken Sie den Operationstisch mit sterilen chirurgischen Saugeinlagen ab.
3. Stellen Sie die Temperatur des digitalen Heizgeräts auf 97 °C ein. Die Heizvorrichtung besteht aus drei Teilen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Temperatur von 50 bis 450 °C kann über den Temperaturregler eingestellt werden (Abbildung 1A). Der Stativfuß wird zum Platzieren der Spitze (Abbildung 1B) verwendet, die demontiert werden kann (Abbildung 1C), um verschiedene Instrumentengrößen zu ersetzen. Desinfizieren Sie die Spitze mit Jodophor oder Alkohol.
4. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in 100% Sauerstoff in einer Induktionskammer für 3 min (Durchflussrate: 4 L/min), bis sich die Atmung verlangsamt hat. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenquetschtest.
   HINWEIS: Das Einatmen von Isofluran kann zu Schläfrigkeit führen und das Herz-Kreislauf-System schädigen. Es ist wichtig, Schutzausrüstung zu tragen und sie in einem Abzug in einem gut belüfteten Bereich zu handhaben.
5. Sobald die Maus tief betäubt ist, legen Sie sie in Bauchlage auf ein beheiztes Pad, um die Wärme zu erhalten und eine Unterkühlung während der Genesung von der Narkose zu verhindern. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1. 5 % Sauerstoff für die Wartung über einen Nasenkonus.
6. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen Gleitgel auf beide Augen der Maus auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.

2. Induktion von Verbrennungen in voller Dicke

HINWEIS: Der allgemeine Prozess der Verbrennungsinduktion und -analyse ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Rasieren Sie die Haut der Maus mit einem Elektrorasierer auf einer Fläche von ca. 5 cm Länge und 4 cm Breite vom Hals bis zum Schwanz. Arbeiten Sie vorsichtig, um Verletzungen der Haut bei der Rasur zu vermeiden (Abbildung 3C).
2. Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze 3 Minuten lang Enthaarungscreme auf die rasierte Hautpartie auf (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Enthaarungscreme auf andere Teile der Maus aufzutragen, um Verbrennungen zu vermeiden, die schwer zu erkennen sein können. Die Creme verursachte Hautausschläge, wenn sie länger als 5 Minuten verwendet wurde. Die genaue Dauer für eine optimale Wirksamkeit variiert je nach Produkt und sollte vom Bediener festgelegt werden.
3. Wischen Sie die Creme mit feuchter Gaze ab, bis Creme und Haare nicht mehr zu erkennen sind. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Chlorhexidin-Peeling, gefolgt von jeweils dreimal 70% Ethanol (v/v). Reinigen und trocknen Sie den Bereich mit steriler Gaze.
4. Verwenden Sie eine sterilisierte 1-ml-Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 9 mm (Abbildung 3A), die in sterilisierte Tinte getaucht ist, um die gewünschten Wundstellen genau zu lokalisieren. Die Rückenhaut der Maus zeichnet sich durch eine unebene Topographie aus. Die Definition des Wundbereichs abseits des Rückenmarks von Mäusen ist wichtig, um die Wiederholbarkeit zu gewährleisten.
5. Decken Sie die Haut mit einem zuvor getrimmten sterilen Tuch ab und lassen Sie den Operationsbereich frei (Abbildung 3). Ziehen Sie hitzebeständige Handschuhe an und überprüfen Sie die Temperatur des digitalen Heizgeräts. Desinfizieren Sie die Spitze des Geräts vor und nach der Verbrennungsinduktion mit 70 % Ethanol (v/v).
6. Setzen Sie die Spitze des Heizgeräts in die Mitte der lokalisierten Wundstellen (97 °C für 10 s), um sechs runde Wunden mit einem Durchmesser von 4 mm zu erzeugen (Abbildung 3B). Der Abstand zwischen benachbarten Verbrennungen beträgt 0,5-1 cm. Bestimmen Sie die Anzahl der Verbrennungen gemäß dem Versuchsplan.
   HINWEIS: Die Verbrennung wird hauptsächlich durch Wärmeleitung verursacht; Daher ist es nicht notwendig, Druck auf den Stab auszuüben, d.h. ihn während der Verbrennungsinduktion durch die Schwerkraft mit der Haut in Kontakt zu halten. Für das Versuchsdesign gab es sechs Verbrennungen. Dies ist die maximale Anzahl an Brandwunden, die je nach verwendetem Gerät und der Fläche des Mausrückens gebaut werden kann. Auf dieser Basis können mehrere Replikate derselben Versuchsgruppe erreicht werden.

3. Pflege und Messung nach der Verbrennung

1. Tragen Sie 5 Minuten lang Eis auf die Brandwunde auf, um mögliche Schmerzen für die Schmerzbehandlung zu reduzieren (Abbildung 3G).
2. Schalten Sie das Isofluran aus und entfernen Sie den Nasenkegel nach der Verbrennungsverletzung. Schieben Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis sich die Maus normal bewegt (z. B. nicht geduckt oder zittert).
3. Legen Sie jede Maus in einen Bergungskäfig, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig zerkratzen. Machen Sie einige Futterpellets weich, indem Sie 5-10 Tropfen Trinkwasser zu jedem Pellet geben und legen Sie sie auf den Käfigboden, um die Fütterung zu erleichtern.
   HINWEIS: Sterilisieren Sie die Käfige durch Besprühen und Wischen mit 70% Ethanol (vol/vol). Die Einstreu sollte regelmäßig gewechselt werden, um die Mäuse warm zu halten und Urin aufzunehmen.
4. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zweimal täglich an einer kaudalen Stelle für insgesamt 3 Tage, wobei ein Abstand von mindestens 8 Stunden zwischen den Injektionen sichergestellt wird.
5. Reinigen Sie alle Wunden mit steriler, mit Kochsalzlösung angefeuchteter Gaze nach 24 Stunden Verbrennungseinleitung. Tupfen Sie die Haut mit Gaze ab und tragen Sie eine kleine Menge antibakterielles Gel (TKH-Hydrogel) mit einer Spritze auf, um die Brandwunde zu bedecken^12,14. Wiederholen Sie diesen Vorgang an den Tagen 3, 7 und 10 danach.
6. Verwenden Sie einen atmungsaktiven, transparenten Verband, um die Wunden abzudecken. Die Größe des Verbandes sollte ca. 1 cm um die Wunde herum abdecken und den Bereich ohne Haarentfernung nicht abdecken.
   HINWEIS: Wechseln Sie den Wundverband mindestens alle 2 Tage. Eine längere Anwendung des Verbandes ohne Ersatz kann zu einer Wundinfektion mit Eiterbildung führen, was zu einer verzögerten Wundheilung führt.
7. Messen Sie während der Nachbeobachtungszeit alle 2-3 Tage das Gewicht. Im Allgemeinen sollten Mäuse, die 15 % bis 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren, getötet und aus dem Experiment entfernt werden.

4. Wundsammlung

1. Markieren Sie die Wunde nach 0, 3, 7, 10 und 14 Tagen mit der Spitze einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze und zeichnen Sie sie mit einer Digitalkamera auf.
2. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Überdosierung von Anästhesie und Gebärmutterhalsluxation (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
   HINWEIS: Seien Sie während der Gebärmutterhalsluxation vorsichtig, um übermäßiges Ziehen zu vermeiden, das die Rückenwunden beschädigen kann.
3. Isolieren Sie mit einer Schere die Wundstelle und die umliegende Haut einschließlich der darunter liegenden Muskulatur (1 cm x 1 cm). Bereiten Sie sich auf mindestens drei Proben für jede Gruppe vor.
4. Die Hautproben 24 h in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixieren und bei 4 °C lagern. Das Volumen des Fixiermittels muss das 30-fache des Gewebevolumens^15,16 betragen.
   HINWEIS: PFA ist gefährlich. Stellen Sie sicher, dass Sie in einem gut belüfteten Bereich arbeiten und geeignete Schutzausrüstung verwenden.

5. Bewertung der Wundheilung

1. Waschen Sie das Wundtuch zweimal mit PBS und verteilen Sie es mit Filterpapier, das auf eine geeignete Größe zugeschnitten werden sollte (Abbildung 2H). Aufgrund des Vorhandenseins eines gewissen Schleimgehalts in der subkutanen Gewebeschicht haftet es an der Oberfläche des Filterpapiers, ohne dass sich das Gewebe bewegt oder sich kräuselt.
   1. Das Filterpapier und die Probe werden in eine Gewebekassette zur Paraffindehydratisierung gegeben, um relativ glatte Gewebeproben zu erhalten, und dann das Gewebe^15,16 einbetten. Die Proben werden bei 4 °C gelagert.
      HINWEIS: Dehnen Sie das Gewebe so weit wie möglich und vermeiden Sie jegliche Faltenbildung, da diese Falten nach der Fixierung dauerhaft werden.
2. Schneiden Sie die in Paraffin eingebetteten Proben in 5 μm dicke Schnitte und färben Sie Objektträger über H&E und Massons Trichrom, um das Ausmaß des Granulationsgewebes, die Angiogenesebildung und die Kollagenablagerung zu beurteilen und Beweise für die Beurteilung der verschiedenen Stadien und des Fortschritts der Wundheilung zu liefern^17,18.
3. Nehmen Sie Bilder aller Proben mit einem Mikroskop mit einem 40-fach-Objektiv auf.
4. Verwenden Sie eine kompatible Software, um den verfärbten Hautabschnitt zu analysieren, einschließlich der Epidermis, der Dermis, des Unterhautgewebes und des Muskelzustands.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurden schachbrettartige Brandwunden mit einer Brenndauer von 10 s bei 97 °C durch das digitale Heizgerät erzeugt (Abbildung 1). Die Spitze des Geräts besteht aus reinem Kupfer, das für seine hervorragende Wärmeleitung und schnelle Aufheizfähigkeit bekannt ist. Der Griff, den der Experimentator hält, besteht aus Polycarbonat-Material, das Hitzebeständigkeit und Nichtbrennbarkeit bietet. Im Vergleich zu den vorgewärmten Methoden m...

Diskussion

Für Studien zu Verbrennungen konzentrieren sich In-vitro-Modelle in der Regel auf die hemmende Wirkung lokaler antimikrobieller Wirkstoffe oder Antibiotika auf Bakterien, die mit Verbrennungen in Verbindung stehen, wie Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa¹⁹, sowie auf die Auswirkungen verschiedener Biomaterialien (wie Elastin, Seide und Hydrogelverbände^14,20) an Ent...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding