Modelo de curación de heridas por quemaduras similar a un tablero de ajedrez de ratones basado en un dispositivo de calentamiento digital

Resumen

Se presenta un protocolo simplificado para establecer un modelo de cicatrización de heridas por quemaduras en ratones utilizando un dispositivo de calentamiento digital. Los sitios experimentales en forma de tablero de ajedrez creados en la piel facilitan un análisis funcional adicional para el ensayo de cicatrización de heridas.

Resumen

Las lesiones por quemaduras graves se encuentran entre las afecciones más traumáticas y físicamente debilitantes, ya que afectan a casi todos los sistemas de órganos y provocan una morbilidad y mortalidad considerables. Dada su complejidad y la afectación de múltiples órganos, se han creado varios modelos animales para replicar diferentes facetas de las lesiones por quemaduras. Los métodos utilizados para producir superficies quemadas varían entre los modelos animales experimentales. Este estudio describe un modelo de quemaduras de ratón simple, rentable y fácil de usar para crear quemaduras consistentes de espesor completo utilizando un dispositivo de calentamiento digital. La punta de este dispositivo se aplicó al dorso de ratones durante 10 s a 97 °C para establecer una quemadura similar a un tablero de ajedrez y examinar la cicatrización de la herida bajo el tratamiento de un apósito experimental. Se recogieron muestras de piel para su análisis histológico, incluyendo la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción de Masson. La cicatrización de la herida se evaluó mediante el análisis del área de la herida y el examen microscópico de la infiltración inflamatoria, la reepitelización y la formación de tejido de granulación. El modelo de lesión por quemadura en ratón puede servir como una herramienta fundamental en el estudio de la fisiopatología de las lesiones térmicas y en la evaluación de intervenciones terapéuticas.

Introducción

Las quemaduras se consideran una de las lesiones críticas de la piel, causadas por la exposición al calor, la electricidad, los materiales químicos y la exposición a la radiación ^1,2. Se puede clasificar en cuatro grados dependiendo de la profundidad de la lesión, que van desde la epidermis hasta todo el grosor de la piel, e incluso los músculos y huesos. Las quemaduras pequeñas pueden provocar la formación de cicatrices y aumentar el riesgo de infección. Una gran área de lesión por quemadura no solo causa daño local, sino que también estimula trastornos del corazón, los riñones y otros órganos o sistemas del cuerpo a través de inflamaciones y respuestas inmunitarias graves y a largo plazo, lo que conduce a graves consecuencias sistémicas y una alta morbilidad³. La mayoría de los sobrevivientes de lesiones por quemaduras están acompañados de discapacidades físicas duraderas, angustia emocional y disminución de la calidad de vida ^4,5. Por lo tanto, es importante estudiar el proceso patológico de las quemaduras y los mecanismos de regeneración del tejido quemado.

Implicados en las respuestas inmunitarias, la regeneración de tejidos y la homeostasis sistemática, los estudios in vitro no pudieron investigar exhaustivamente el proceso patológico de la cicatrización de las heridas por quemaduras. Así, en las últimas dos décadas, con el fin de explorar posibles intervenciones terapéuticas, se desarrollaron diferentes modelos animales de curación de heridas por quemaduras para replicar las diversas características de las lesiones por quemaduras ^6,7. Las heridas por quemaduras generalmente se producen en la superficie del dorso de cerdos, ratas, ratones, conejos y otros animales después de la depilación. El tiempo de combustión puede durar de 3 s a 30 s para formar daño térmico de espesor parcial a completo con un rango de 5% a 30% de área total del cuerpo (TBSA)⁸. Actualmente no existen modelos estandarizados de estos métodos en la investigación con animales quemados debido a la alta variabilidad de las técnicas utilizadas. Los métodos utilizados para producir superficies quemadas varían entre los modelos animales experimentales, incluyendo la llama de gas⁹, el baño de etanol^{quemado 10}, la placa/barra de metal simple precalentada^11,12, el agua hirviendo o caliente^13,14. Sin embargo, la técnica de infligir quemaduras y la profundidad de la quemadura producida a menudo son inconsistentes y están mal descritas en estudios anteriores, lo cual es crucial para determinar la gravedad de la quemadura y el método de tratamiento de la quemadura.

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un modelo animal de quemaduras de ratón simple, rentable y fácil de usar para crear quemaduras consistentes de espesor completo en escenarios clínicos simulados. En este protocolo, utilizamos un conveniente dispositivo de calentamiento digital para controlar la profundidad de la quemadura ajustando la temperatura aplicada a la piel. La punta de este dispositivo se puede cambiar a diferentes tamaños para inducir quemaduras térmicas con diferentes rangos de TBSA. Esto permite la creación de una herida por quemadura similar a un tablero de ajedrez en la espalda del ratón, lo que permite la comparación de varios tratamientos experimentales y de control dentro del mismo animal. Observamos y registramos el proceso de cierre de la herida. Se recolectaron muestras de piel para evaluación histológica (tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción con tricrómico de Masson) en diferentes etapas de la cicatrización de la herida. Este enfoque reduce el número de animales utilizados en el experimento y, por lo tanto, reduce los costos económicos al tiempo que es más compatible con la ética animal. Este estudio proporcionará a los investigadores herramientas esenciales para facilitar el desarrollo de nuevos tratamientos para las lesiones por quemaduras y revelará los mecanismos fisiopatológicos de la cicatrización de heridas por quemaduras.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2024-499). Para el presente estudio se utilizaron veinticuatro ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad (hembras, peso corporal de 25 a 30 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del equipo y del ratón antes de una lesión por quemadura

1. Adquiere los animales y alójalos en jaulas durante 7 días a su llegada para que puedan aclimatarse al entorno.
2. Esterilice el área de trabajo rociando y limpiando con etanol al 70% (v/v). Cubra la mesa de operaciones con almohadillas absorbentes quirúrgicas estériles.
3. Ajuste la temperatura del dispositivo de calefacción digital a 97 °C. El dispositivo de calentamiento consta de tres partes (Figura 1).
   NOTA: La temperatura de 50-450 °C se puede ajustar a través del controlador de temperatura (Figura 1A). La base del soporte se utiliza para colocar la punta (Figura 1B), que se puede desmontar (Figura 1C) para reemplazar diferentes tamaños de instrumentos. Desinfecte la punta con yodoforo o alcohol.
4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% en oxígeno al 100% en una cámara de inducción durante 3 min (caudal: 4 L/min) hasta que la respiración se haya ralentizado. Evalúe la profundidad de la anestesia mediante una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
   NOTA: La inhalación de isoflurano puede provocar somnolencia y dañar el sistema cardiovascular. Es esencial usar equipo de protección y manipularlo dentro de una campana extractora en un área bien ventilada.
5. Una vez que el ratón esté profundamente anestesiado, transfiéralo a una almohadilla térmica en posición prona para mantener el calor y prevenir la hipotermia durante la recuperación de la anestesia. Reducir el isoflurano a 1. 5% de oxígeno para el mantenimiento a través de un cono nasal.
6. Aplique gel lubricante en ambos ojos del ratón con un bastoncillo de algodón para evitar la sequedad de la córnea.

2. Inducir lesiones por quemaduras de espesor completo

NOTA: El proceso general de inducción y análisis de quemaduras se muestra en la Figura 2.

1. Afeitar la piel del ratón con una afeitadora eléctrica en un área de aproximadamente 5 cm de largo y 4 cm de ancho desde el cuello hasta la cola. Trabaje suavemente para evitar lesionar la piel al afeitarse (Figura 3C).
2. Use un aplicador con punta de algodón para aplicar la crema depilatoria en el área de la piel afeitada durante 3 minutos (Figura 3D).
   NOTA: Evite aplicar la crema depilatoria en otras partes del ratón para evitar quemaduras, que pueden ser difíciles de detectar. La crema causaba erupciones cutáneas si se usaba durante más de 5 minutos. La duración precisa para una eficacia óptima varía según los productos y debe ser determinada por el operador.
3. Limpie la crema con una gasa húmeda hasta que no se detecte la crema y el cabello. Desinfecte el área quirúrgica con un exfoliante de clorhexidina seguido de etanol al 70% (v/v) tres veces cada uno. Limpie y seque el área con gasa estéril.
4. Utilice una punta de pipeta esterilizada de 1 ml con un diámetro de 9 mm (Figura 3A) sumergida en tinta esterilizada para identificar con precisión los sitios de herida deseados. La piel dorsal murina se caracteriza por una topografía irregular. Definir el área de la herida aparte de la médula espinal de los ratones es esencial para garantizar la repetibilidad.
5. Cubrir la piel con un paño estéril previamente recortado, dejando libre la zona quirúrgica (Figura 3). Póngase guantes resistentes al calor y verifique la temperatura del dispositivo de calefacción digital. Antes y después de la inducción de la combustión, desinfecte la punta del dispositivo con etanol (v/v) al 70%.
6. Aplique la punta del dispositivo de calentamiento en el centro de los sitios de la herida ubicados (97 °C durante 10 s) para crear seis heridas redondas con un diámetro de 4 mm (Figura 3B). El intervalo entre quemaduras adyacentes es de 0,5-1 cm. Determinar el número de quemaduras de acuerdo con el diseño experimental.
   NOTA: La quemadura es causada principalmente por la conducción de calor; Por lo tanto, no es necesario ejercer presión sobre la varilla, es decir, mantenerla en contacto con la piel por gravedad mientras se induce la quemadura. Hubo seis quemaduras para el diseño experimental. Este es el número máximo de heridas por quemaduras que se pueden construir según el dispositivo que hayamos utilizado y la zona del dorso del ratón. Sobre esta base, se pueden lograr múltiples réplicas del mismo grupo experimental.

3. Cuidado y medición después de la quemadura

1. Aplique hielo a la herida de la quemadura durante 5 minutos para reducir el dolor potencial para el manejo del dolor (Figura 3G).
2. Apague el isoflurano y retire el cono de la nariz después de la lesión por quemadura. Transfiera el mouse a una almohadilla térmica hasta que el mouse se mueva normalmente (por ejemplo, no esté agachado o temblando).
3. Coloque cada ratón en una jaula de recuperación para evitar que se rasquen entre sí. Ablande algunos gránulos de comida agregando de 5 a 10 gotas de agua potable a cada gránulos y colóquelos en el piso de la jaula para facilitar la alimentación.
   NOTA: Esterilización de las jaulas mediante pulverización y limpieza con etanol al 70% (vol/vol). La ropa de cama debe reemplazarse regularmente para mantener a los ratones calientes y absorber la orina.
4. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea en caudal dos veces al día durante un total de 3 días, asegurando al menos 8 h entre inyecciones.
5. Limpiar todas las heridas con gasa estéril humedecida con suero fisiológico después de 24 h de inducción de la quemadura. Secar la piel con una gasa y aplicar una pequeña cantidad de gel antibacterial (hidrogel TKH) con una jeringa para cubrir la herida de la quemadura^12,14. Repita este procedimiento los días 3, 7 y 10 siguientes.
6. Use un vendaje transparente y transpirable para cubrir las heridas. El tamaño del apósito debe cubrir aproximadamente 1 cm alrededor de la herida y no debe cubrir el área sin depilación.
   NOTA: Cambie el apósito para heridas al menos una vez cada 2 días. El uso prolongado del apósito sin reemplazo puede provocar una infección de la herida con formación de pus, lo que resulta en una cicatrización tardía de la herida.
7. A lo largo del período de seguimiento, mida el peso cada 2-3 días. En general, los ratones que pierden entre el 15% y el 20% de su peso corporal inicial deben ser sacrificados y retirados del experimento.

4. Colección de heridas

1. A los 0, 3, 7, 10 y 14 días, marque la herida con la punta de una pipeta estéril de 1 ml y regístrela con una cámara digital.
2. Eutanasia de los ratones por sobredosis de anestesia y luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
   NOTA: Tenga cuidado durante la luxación cervical para evitar tirones excesivos, que pueden dañar las heridas del dorso.
3. Con unas tijeras, aísle el sitio de la herida y la piel circundante, incluida la musculatura subyacente (1 cm x 1 cm). Prepárese para al menos tres muestras para cada grupo.
4. Fijar las muestras de piel en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 24 h y almacenar a 4 °C. El volumen fijador debe ser 30 veces el volumen del tejido ^15,16.
   NOTA: El PFA es peligroso. Asegúrese de trabajar en un área bien ventilada y use el equipo de protección adecuado.

5. Evaluación de la cicatrización de heridas

1. Lave el tejido de la herida dos veces con PBS y extiéndalo con papel de filtro, que debe recortarse a un tamaño adecuado (Figura 2H). Debido a la presencia de cierto contenido de moco dentro de la capa de tejido subcutáneo, se adhiere a la superficie del papel de filtro sin movimiento ni enroscamiento del tejido.
   1. Coloque el papel de filtro y la muestra en un casete de tejido para la deshidratación de parafina para obtener muestras de tejido relativamente suaves y luego incruste el tejido^15,16. Almacene las muestras a 4 °C.
      NOTA: Estire el tejido tanto como sea posible y evite cualquier pliegue, ya que estos pliegues se volverán permanentes después de la fijación.
2. Corte las muestras incluidas en parafina en secciones de 5 μm de espesor y tiña los portaobjetos mediante H&E y tricrómico de Masson para evaluar el grado de tejido de granulación, la formación de angiogénesis y la deposición de colágeno, proporcionando evidencia para evaluar las diferentes etapas y la progresión de la cicatrización de la herida^17,18.
3. Capture imágenes de todas las muestras utilizando un microscopio con un objetivo de 40x.
4. Utilice un software compatible para analizar la sección de piel manchada, incluida la epidermis, la dermis, el tejido subcutáneo y el estado muscular.

Resultados

En este protocolo, se crearon heridas por quemaduras similares a un tablero de ajedrez con una duración de quemadura de 10 s a 97 °C mediante el dispositivo de calentamiento digital (Figura 1). La punta del dispositivo está hecha de cobre puro, que es conocido por su excelente conducción de calor y sus capacidades de calentamiento rápido. La empuñadura sostenida por el experimentador está hecha de material de policarbonato, que proporciona resistencia...

Discusión

Para los estudios de quemaduras, los modelos in vitro suelen centrarse en los efectos inhibitorios de los agentes antimicrobianos locales o antibióticos sobre las bacterias asociadas a las quemaduras, como Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa¹⁹, así como en el impacto de diversos biomateriales (como apósitos de elastina, seda e hidrogel^14,20) en células inflamatoria...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding